专利名称：预防新生儿神经管缺陷的基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种预防新生儿神经管缺陷的基因检测试剂盒，通过同时检测与孕期叶酸营养代谢能力密切相关的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)的单核苷酸多态性位点基因型来评估孕妇叶酸代谢能力，指导其个性化补充叶酸。
背景技术：
神经管缺陷(NTDs) —直是我国围产期儿中高发的畸形疾病。1986年NTDs的发生率为27. 40/万，到2007年下降至7. 2/万，但在某些高发省份，如山西，陕西，甘肃等，发生率仍高达30/万，是影响我国人口出生素质的重要因素。NTDs的发生是基因和环境因素的共同作用的结果。自1964年E. D. HilDbard和 R. W. Smhell首先发现叶酸缺乏与神经管缺陷(NTDs)有关以来，妇女妊娠期定量补充叶酸已经成为预防NTDs出生非常有效的措施之一。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是参与体内叶酸代谢的关键酶，与体内叶酸/同型半胱氨酸(HCY)的代谢和蛋氨酸的合成有关，它们在胚胎神经管发育(妊娠4-8 周)中意义重大。研究表明，MTHFR基因677C —T突变，可导致MTHFR酶活性降低，引起高半胱氨酸血症，体内HCY水平升高，而由于HCY具有胚胎毒性作用，最终有可能诱发神经管畸形。因此，MTHFR基因C677T多态性可以作为神经管缺陷的遗传危险因素之一。近年来研究发现，MTHFR基因的第2个常见的突变位点，即1298位点A — C突变，可降低该酶的活性，在神经管缺陷发生过程中起一定的作用，可以作为NTDs的又一遗传危险因素。C677T和 A1298C很少发生共同纯合突变，研究表明，C677T和AU98C基因型的交互作用较单独作用更大。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)也是参与体内叶酸代谢和同型半胱氨酸代谢的关键酶，研究表明MTRR66A — G突变后，血浆HCY浓度升高。并且研究证明，基因型为 MTRR66GG、MTRR66AG的孕妇发生NTDs的危险性较正常对照组增加。因此，建立简单、快速的预防新生儿神经管缺陷的检测方法，能够检测出女性在 MTHFRC677T、MTHFRA1298C、MTRRA66G三个位点的单核苷酸位点基因型，及时筛查出生育神经管缺陷儿的高危人群及评估其叶酸代谢能力，从而调整叶酸补充剂量和加强孕期监测， 这对于降低新生儿神经管缺陷出生率有非常重要的意义。
发明内容
基于MTHFRC677T、MTHFRA1298C、MTRRA66G的3个SNPs位点多态性可用来评估孕妇生育神经管缺陷患儿的基础上，本发明提供一种预防新生儿神经管缺陷基因检测试剂
品.ο该试剂盒包括检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点(MTHFRC677T)和rsl801131号SNP位点(MTHFR A1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上 rsl801394号SNP位点(MTRR A66G)多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ；20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ； ddH203. 875uL·测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ； 125mMEDTA 溶液 Iul ； 100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.检测试剂盒的使用1、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(I)MTHFR C677T 正向引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'MTHFR C677T 反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘(WMTHFR A1298C 正向引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT 3‘MTHFRA1298C 反向引物5' CCACTCCAGCATCACTCACTTT 3‘(3) MTRR A66G 正向引物5 ‘ GATTCAAGCCCAAGTAGTTTCG 3 ‘MTRR A66G 反向引物5 ‘ GCTCTAACCTTATCGGATTCACTA 3 ‘PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5μ 1 ； 25mM的dNTP混合液0. 2 μ 1、 5U/ul Taq酶0. 125 μ 1、DNA模板 1 μ 1 (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 0. 25 μ 1、 ddH20 19. 175μ 1 ；反应条件为94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C 1分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物 20ul, lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(I)MTHFR C677T 测序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'(WMTHFR A1298C 测序引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT 3 ‘(；3)MTRR A66G 测序引物5' GATTCAAGCCCAAGTAGTTTCG 3 ‘反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 测序引物lul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀 15min ；在4°C，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul， 3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测
序仪中。5、基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的 SNP位点的基因型。实施例2.对人们进行预防神经管缺陷基因无创检测的服务采样及抽提DNA由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上 rsl801133 号 SNP 位点(MTHFR C677T)和 rsl801131 号 SNP 位点(MTHFR A1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801394号SNP位点(MTRR A66G)分别进行DNA 测序，确定这6个SNPs位点的基因型。生育神经管缺陷儿女性高危人群风险评估通过对受检者SNPs基因型的分析，出具生育神经管缺陷儿女性风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点(MTHFR C677T)和rsl801131号SNP位点(MTHFRA1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801394号SNP位点(MTRRA66G)基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，详细列出了预防神经管缺陷的叶酸补充建议方案和孕期监测建议方案，并由医师向受检者详细说明和解读预防神经管缺陷基因无创检测报告单。
权利要求
1.一种预防新生儿神经管缺陷的基因无创检测试剂盒，其特征在于检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点(MTHFR C677T)和rsl801131号SNP位点 (MTHFR A1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801394号SNP位点(MTRR A66G)的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点(MTHFR C677T)和rsl801131号 SNP位点(MTHFR A1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801394号SNP位点 (MTRR A66G)，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA测序引物是针对5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801133号SNP位点(MTHFR C677T)和rsl801131号SNP位点(MTHFR A1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因上rsl801394号SNP位点(MTRR A66G)而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下(1)MTHFRC677T 正向引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'MTHFR C677T 反向引物5 ‘ CAGACACTGTTGCTGGGTTTT 3 ‘(2)MTHFRA1298C 正向引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT 3'MTHFRA1298C 反向引物5‘ CCACTCCAGCATCACTCACTTT 3‘(3)MTRR A66G 正向引物5 ‘ GATTCAAGCCCAAGTAGTTTCG 3 ‘MTRR A66G 反向引物5 ‘ GCTCTAACCTTATCGGATTCACTA 3 ‘。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下(1)MTHFRC677T 测序引物5' CATCCCTCGCCTTGAACAG 3'(2)MTHFRA1298C 测序引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT 3'(3)MTRRA66G 测序引物5' GATTCAAGCCCAAGTAGTTTCG 3 ‘。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括(1)PCR反应体系10XPCR反应缓冲液2. 5ul，25mM dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)测序反应体系25%BigDyemixlul，3. 2uM DNA 测序引物 lul，125mMEDTA 溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ulo本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明提供了一种预防新生儿神经管缺陷的基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)上rs1801133号SNP位点(MTHFR C677T)和rs1801131号SNP位点(MTHFR A1298C)以及5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTRR)上rs1801394号SNP位点(MTRR A66G)的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测引起新生儿缺陷发生的主要遗传因素-女性叶酸代谢能力密切相关的单核苷酸多态性位点基因型来评估孕妇生育神经管缺陷儿的风险级别，并最终根据每一位受检者的基因检测结果指导孕妇个性化的补充叶酸。本发明的方法符合我国国情，采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
文档编号C12Q1/68GK102399875SQ20111035046
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者姜丽, 潘加奎 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司