专利名称：建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒及其制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及检测建兰花叶病毒的试剂盒及其制备和检测方法，特别是涉及建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒及制备该试剂盒的方法与应用该试剂盒进行建兰花叶病毒斑点酶联检测的检测方法。
背景技术：
建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)隶属马铃薯X病毒属，能使建兰产生褪绿斑点及坏死斑，卡特兰产生局部坏死，树兰属产生花叶，此外，还侵染热带香料作物香草兰，是危害各种观赏兰花的主要病毒之一。鉴于CyMV对我国兰花产业的危害性，研究其检测技术已十分重要。
植物病毒检测常用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，酶免疫分析是将抗原抗体结合的特异性与酶的高效催化性相结合的技术，具有灵敏度高，特异性强等特点，但操作步骤多，耗时长，且需要相对昂贵的酶标抗体和96孔酶标板。
斑点酶联检测是以酶免疫吸附分析的原理为基础近年来迅速发展起来的检测方法，曾研究报道该方法用于快速检测羊胴体中的沙门氏菌与常规分离培养检测比较，不仅简便，快捷，而且安全、可靠。而目前尚未有关斑点免疫酶联用于检测建兰花叶病毒的文献报道以及用于检测该病毒的斑点酶联检测试剂盒产品。
发明内容
本发明的目的在于提供简便、快捷、安全、可靠且经济实用的建兰花叶病毒斑点酶联检测的试剂盒。
本发明的另一目的，在于提供制备建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒的方法。
本发明的再一目的，在于提供利用制备的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒进行斑点酶联检测建兰花叶病毒的检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种瓶装用液和PVDF膜组成。
所述的各种瓶装用液包括
保温液I 1瓶保温液II 1瓶显色缓冲液 1瓶显色剂 1支阳性样品 1支阴性样品 1支样品处理液 1瓶洗涤缓冲液 1瓶所述的保温液I为含有建兰花叶病毒多克隆抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶。
所述的保温液II为含有羊抗兔酶标抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶。
所述的显色缓冲液为0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris缓冲液。
所述的显色剂为0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒。
所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒，浓度为0.1μg-100g/ml范围。
所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。
所述的样品处理液为1-5M，pH9.6的碳酸盐缓冲液。
所述的洗涤缓冲液为0-0.05M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒的制备方法，它主要包括下列步骤1、建兰花叶病毒的提取和纯化取100g曼陀罗病叶加入100ml0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)匀浆后，加入100ml氯仿搅拌30分钟。在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟。取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，搅拌后静置1小时。在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，弃上清，用0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)充分溶解沉淀后重复一次PEG沉淀。第二次取沉淀后用5mM硼酸缓冲液悬浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，取上清于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时。取沉淀用0.01MPB(pH7.0)重新悬浮，再进行一次差速离心，最后取沉淀用适量0.01MPB(pH7.0)溶解。若杂质太多，再进行一次差速离心。取粗提纯病毒置于10％-40％蔗糖垫梯度，于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时。收集病毒条带，再次于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时沉淀病毒，最后溶解于0.01MPB(pH7.0)中，置于-40℃备用。
2、抗血清的制备及纯化选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔。每次注射病毒的量分别是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价；通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体。用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30分钟，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐。取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mMTris-HCl pH8.5缓冲液5ml/min冲洗15分钟，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的建兰花叶病毒多克隆抗体。
3、阳性、阴性样品的制备阳性样品为纯化的建兰花叶病毒病毒，浓度在0.1μg-100μg/ml范围；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。
4、各种用液的制备保温液I为含有建兰花叶病毒多克隆抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶。
保温液II为含有羊抗兔酶标抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶。
显色缓冲液为0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris缓冲液。
显色剂为0.01g/m1 NBT+0.005g/ml BCIP。
样品处理液为1-5M，pH9.6的碳酸盐缓冲液。
洗涤缓冲液为0-0.05M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒的检测方法为斑点酶联检测法，它包括以下步骤1)、试剂准备根据检测的需要，稀释样品处理液和洗涤缓冲液，备用；2)、样品处理取待测样品加入样品处理液充分研磨，离心取上清液，再稀释备用；3)、点样取处理后的样品在PVDF膜上点样，同时设立阳性对照和阴性对照；4)、吸附将PVDF膜置于37℃恒温箱干燥0-60min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；5)、孵育I取PVDF膜浸泡于保温液I中，于37℃保温30-90min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；6)、孵育II取PVDF膜浸泡于保温液II中，于37℃保温30-90min。取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；7)、显色将洗涤后的PVDF膜取出浸泡于显色液中，显色510min；8)、检测判定根据检测判定标准，判定检测结果。
采用上述方案后，本发明由盒体，设在盒体内的各种用液、PVDF膜组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行斑点酶联联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，且试剂盒使用不需特殊仪器，直接可用肉眼判定结果，所以便于在基层单位推广应用。
具体实施例方式
本发明所用的主要试剂建兰花叶病毒多克隆抗体为厦门华侨亚热带植物引种园制备；PEG6000(聚乙二醇6000)、2-巯基乙醇、Triton-100(曲拉通X-100)、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；羊抗兔酶标抗体、BCIP、NBT、DEAE离子交换填充物、IgG亲合层析填充物购自Pierce公司；试验中所使用的其他常规药品和试剂均为国产分析纯试剂。
一、试剂盒建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种瓶装用液和PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)组成，各种瓶装用液包括保温液I 1瓶保温液II 1瓶显色缓冲液 1瓶显色剂 1支阳性对照 1支阴性对照 1支样品处理液 1瓶洗涤缓冲液 1瓶阳性样品为纯化的建兰花叶病毒病毒，其浓度为100μg/ml；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。
保温液I为含有建兰花叶病毒多克隆抗体0.05M的磷酸盐缓冲液，内含1％明胶。
保温液II为含有羊抗兔酶标抗体0.05M的磷酸盐缓冲液，内含1％明胶。
显色缓冲液为0.1M，pH9.5，含MgCl2 10g/L+NaCl 2g/L的Tris缓冲液。
显色剂为0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
样品处理液为2M，pH9.6的碳酸盐缓冲液。
洗涤缓冲液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
二、制备方法本发明建兰花叶病毒检测试剂盒的制备方法，它包括下列步骤1、建兰花叶病毒的提取和纯化取100g曼陀罗病叶加入100ml0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)匀浆后，加入100ml氯仿搅拌30分钟。在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟。取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，搅拌后静置1小时。在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，弃上清，用0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)充分溶解沉淀后重复一次PEG沉淀。第二次取沉淀后用5mM硼酸缓冲液悬浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，取上清于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时。取沉淀用0.01MPB(pH7.0)重新悬浮，再进行一次差速离心，最后取沉淀用适量0.01MPB(pH7.0)溶解。若杂质太多，再进行一次差速离心。取粗提纯病毒置于10％-40％蔗糖垫梯度，于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时。收集病毒条带，再次于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时沉淀病毒，最后溶解于0.01MPB(pH7.0)中，置于-40℃保存备用。
2、抗血清的制备及纯化选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔。每次注射病毒的量分别是0.5、0.75、1、1.5和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价。通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体。用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30min，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐。取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mM Tris-HClpH8.5缓冲液5ml/min冲洗15min，再用含0-1M NaCl的10mMTris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的建兰花叶病毒多克隆抗体。
3、阳性、阴性样品的制备阳性样品为纯化的建兰花叶病毒病毒，浓度在100μg/ml；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。
4、各种用液的制备保温液I为含有建兰花叶病毒多克隆抗体0.05M的磷酸盐缓冲液，内含1％明胶；保温液II为含有羊抗兔酶标抗体0.05M的磷酸盐缓冲液，内含1％明胶；显色缓冲液为0.1M，pH9.5，含MgCl2 10g/L+NaCl 2g/L的Tris缓冲液；
显色剂为0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；样品处理液为2M碳酸盐缓冲液(pH9.6)；洗涤缓冲液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；封闭缓冲溶液为20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉。
三、检测方法实施例试剂盒的斑点酶联(DIBA)检测方法1、试剂准备根据检测的需要，稀释样品处理液和洗涤缓冲液，备用；2、样品处理取待测样品0.1g加入1ml样品处理液充分研磨，离心取上清液，再稀释备用；3、点样取1μL处理后的样品在PVDF膜上点样，同时设立阳性对照和阴性对照；4、吸附将PVDF膜置于37℃恒温箱干燥30min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡于保温液I中，于37℃保温45min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡于保温液II中，于37℃保温45min。取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；7、显色将洗涤后的PVDF膜取出浸泡于显色液中，显色5-10min；8、检测判定根据检测判定标准，判定检测结果。
斑点酶联检测判定标准在阳性对照显色、阴性对照不显色的情况下，样品检测带有斑点的判断为阳性，否则为阴性。
待测样品按以上标准，定性判断待测样品检测结果的阴、阳性。
为检验斑点酶联检测试剂盒检测效果，用该法检测了40份兰花样品，检测结果如下附表1 检测结果
注“+”代表阳性；“-”代表阴性31份由RT-PCR检测阳性的样品，DIBA检测阳性样品30份，1份阴性；9份由RT-PCR检测阴性的样品，DIBA检测阴性样品份，阳性样品1份；由检测结果可知DIBA的敏感性为96.77％；特异性88.89％；检测准确性为95％。
权利要求
1.建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种瓶装用液和PVDF膜组成，其特征在于所述的各种瓶装用液包括保温液I 1瓶；保温液II1瓶；显色缓冲液 1瓶；显色剂 1支；阳性样品1支；阴性样品1支；样品处理液 1瓶；洗涤缓冲液 1瓶。
2.如权利要求1所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒，其特征在于所述的显色缓冲液为0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris缓冲液；所述的显色剂为0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的样品处理液为1-5M，pH9.6的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤缓冲液为0-0.05M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1或2所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒，其特征在于所述的保温液I为含有建兰花叶病毒多克隆抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶；所述的保温液II为含有羊抗兔酶标抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶；所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒病毒；所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。
4.如权利要求书3所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒，其特征在于所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒，浓度为0.1μg-100μg/ml。
5.如权利要求1所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的制备方法主要包括下列步骤1)、建兰花叶病毒的提取和纯化取100g曼陀罗病叶加入100ml0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)匀浆后，加入100ml氯仿搅拌30分钟，在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟；取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，搅拌后静置1小时，在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，弃上清，用0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)充分溶解沉淀后重复一次PEG沉淀，第二次取沉淀后用5mM硼酸缓冲液悬浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，取上清于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时，取沉淀用0.01M PB(pH7.0)重新悬浮，再进行一次差速离心，最后取沉淀用适量0.01M PB(pH7.0)溶解，若杂质太多，再进行一次差速离心，取粗提纯病毒置于10％-40％蔗糖垫梯度，于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时，收集病毒条带，再次于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时沉淀病毒，最后溶解于0.01M PB(pH7.0)中，置于-40℃保存备用；2)、抗血清的制备及纯化选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔，每次注射病毒的量分别是0.5、0.75、1、1.5和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价，通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体，用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30min，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐，取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mM Tris-HClpH8.5缓冲液5ml/min冲洗15min，再用含0-1M NaCl的10mMTris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的建兰花叶病毒多克隆抗体；3)、阳性、阴性样品的制备阳性样品为纯化的建兰花叶病毒病毒，浓度在0.1μg-100μg/ml范围；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液；4)、各种用液的制备保温液I为含有建兰花叶病毒多克隆抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶；保温液II为含有羊抗兔酶标抗体的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液，内含1％明胶；显色缓冲液为0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris缓冲液；显色剂为0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；样品处理液为1-5M，pH9.6的碳酸盐缓冲液；洗涤缓冲液为0-0.05M，pH7.4的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述的检测方法为斑点酶联检测法，它包括以下步骤1)、试剂准备根据检测的需要，稀释样品处理液和洗涤缓冲液，备用；2)、样品处理取待测样品加入样品处理液充分研磨，离心取上清液，再稀释备用；3)、点样取处理后的样品在PVDF膜上点样，同时设立阳性对照和阴性对照；4)、吸附将PVDF膜置于37℃恒温箱干燥0-60min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；5)、孵育I取PVDF膜浸泡于保温液I中，于37℃保温30-90min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；6)、孵育II取PVDF膜浸泡于保温液II中，于37℃保温30-90min，取出，用洗涤液洗涤三次，每次3min；7)、显色将洗涤后的PVDF膜取出浸泡于显色液中，显色5-10min；8)、检测判定根据检测判定标准，判定检测结果。
全文摘要
本发明公开了建兰花叶病毒斑点酶联检测试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒由盒体，设在盒体内的各种用液和PVDF膜组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行斑点酶联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，且试剂盒使用不需特殊仪器，直接可用肉眼判定结果，所以便于在基层单位推广应用。
文档编号G01N21/78GK1975428SQ20061016443
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年2月10日
发明者明艳林, 郑国华, 童庆宣, 李梅, 陈良华 申请人:厦门华侨亚热带植物引种园