专利名称：表达纤维素酶的重组酵母菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及表达纤维素酶的重组酵母菌株及其应用。
背景技术：
目前，随着分子遗传学与分子生物学技术的发展，国内外都在尝试应用基因工程技术来改造与构建高效纤维素降解菌株，由于这些菌株具有独特的遗传特性与生物学性能，随之纤维素酶的应用范围在不断拓展。纤维素酶生产大多采用里氏木霉诱变筛选高产菌株，经液态深层通风发酵精制提取制成。诱变菌株存在性能不稳定，经过几次传代后，高产活性往往丧失,因此需要反复培育新菌株,生产成本大大提高。
基因工程技术为纤维素酶的生产开辟了新途径，新型的纤维素酶基因的发现与克隆成功，各种不同性质和用途的表达载体构建成功，直到采用不同的细胞进行表达生产，涌现了一批新技术新工艺。其中以细菌为主的原核细胞表达体系首先被用于纤维素酶的生产中，其缺点是酶活性不高，这与细菌缺乏蛋白质翻译后的加工修饰功能有关。以啤酒酵母和毕赤酵母为主的真核细胞表达体系来生产纤维素酶获得人们越来越多的关注，但是发酵水平较低，一般低于lg/L，仍然无法满足大规模工业化生产的需要。目前培育的纤维素酶生产菌种普遍具有容易退化的缺点，需要反复培育，并且酶产量和活性都不高，生产的菌株的酶活性大多低于300U/mL，酶的酵母发酵水平低于I克/升。
发明内容
本发明就是针对现有技术的缺点提供一种表达纤维素酶的重组酵母菌株及其在生产纤维素酶方面的应用，本发明的多拷贝纤维素酶基因毕赤酵母菌，具有细胞外分泌纤维素酶的特性，使得发酵后酶蛋白的提取纯化优于现有技术，经过再生纤维素非晶(RAC)亲和层析，得到的酶蛋白纯度就能达到90%，极大地节约了时间，提高生产效率，节省生产成本，从而提高了经济效益。本发明的表达纤维素酶的重组酵母菌株及其应用技术方案是
一种表达纤维素酶的重组酵母菌株，多拷贝纤维素酶基因整合入分泌型表达载体，构建出酶蛋白分泌表达质粒，导入毕赤酵母受体菌，得到表达纤维素酶的重组毕赤酵母菌。所述的多拷贝为2，4，6，8，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 任一拷贝数。所述毕赤酵母受体菌为巴斯德毕赤酵母GS115。纤维素酶基因多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出酶蛋白分泌表达质粒，导入毕赤酵母受体菌，得到表达纤维素酶的重组毕赤酵母菌。具体如下
(1)里氏木酶内切酶EGI，GeneBank编号M15665.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGI酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGI的重组毕赤酵母菌；
(2)里氏木酶内切酶EGII,GeneBank编号AB003694.I，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGII酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGII的重组毕赤酵母菌； (3)里氏木酶内切酶EGIII，GeneBank编号M19373.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGIII酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGIII的重组毕赤酵母菌；
(4)里氏木酶内切酶EGIV，GeneBank编号Y11113.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGIV酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGIV的重组毕赤酵母菌；
(5)里氏木酶内切酶EGV，GeneBank编号Z33381.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGV酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGV的重组毕赤酵母菌；
(6)里氏木酶内切酶CEL74A，GeneBank编号AY281371.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶CEL74A酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶CEL74A的重组毕赤酵母菌；
(7)里氏木酶内切酶CEL61B，GeneBank编号AY281372.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶CEL61B酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶CEL61B的重组毕赤酵母菌；
(8)里氏木酶内切酶CEL5B，GeneBank编号AY281373.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶CEL5B酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶CEL5B的重组毕赤酵母菌；
(9)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII,GeneBank编号M16190. 1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒PPICZaABC中，构建出里氏木酶外切酶CBHII M16190. I酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶外切酶CBHII M16190. I的重组毕赤酵母菌。(10)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII ,GeneBank编号M55080. 1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶外切酶CBHII M55080. I酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶外切酶CBHII M55080. I的重组毕赤酵母菌；
(11)里氏木酶P葡糖苷酶BGLI，GeaneBank编号U09580.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLI酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶P葡糖苷酶BGLI的重组毕赤酵母菌；
(12)里氏木酶P葡糖苷酶BGLII，GeneBank编号AB003110.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLII酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶P葡糖苷酶BGLII的重组毕赤酵母菌。所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株在生产纤维素酶中的应用。发酵后纤维素酶蛋白的提取纯化，采用再生纤维素非晶亲和层析工艺，获得高纯度的酶蛋白制剂。本发明的有益效果是本发明的表达纤维素酶的重组酵母菌株及其应用，是多拷贝纤维素酶基因整合入分泌型表达载体，构建出酶蛋白分泌表达质粒，导入毕赤酵母受体菌，得到表达纤维素酶的重组毕赤酵母菌。(I)本发明使用的纤维素酶基因来源为里氏木霉，其产生的酶降解纤维素的性能更强大，对高温酸碱等环境的耐受性更强。
(2)生产过程中转入的基因数量(拷贝数)的多少与酶的产量有直接的关系，本发明的拷贝数(包括2，4，6，8，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100拷贝数)符合酶制剂并且使其产量最大化的基因拷贝数，即从2个到100个。(3)构建的多拷贝纤维素酶基因pPICZ a ABC表达载体与毕赤酵母GSl 15具有极好的相容性，本发明的重组毕赤酵母菌具有细胞外分泌酶蛋白的特性。经过再生纤维素非晶(RAC)亲和层析，得到的酶蛋白纯度能达到90%，极大地节约了时间，提高生产效率，节省生产成本，从而提高了经济效益。(4)从基因选取，到表达载体的制造，整个生产体系所涉及环节的实验条件有明显优化和改善，从而每升发酵液可以生产出10克左右酶制剂，活性高，产量较现有技术有大幅度增加。
图I所示为本发明的表达纤维素酶的重组酵母菌株形成示意图。图中，I.纤维素酶基因，2.多克隆酶切位点MCS，3 质粒pPICZ a ABC，4.表达载体，5.重组毕赤酵母菌。
具体实施例方式如说明书附图所示，纤维素酶的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的纤维素酶基因I片段，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了纤维素酶基因表达载体
4。此基因表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YPD液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即里氏木酶内切酶EGI株，得到表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5。下述实施例，如无特别说明，所用方法均为常规方法。实施例I
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶EGI的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶EGI株。实施例2
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶EGII的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶EGII株。实施例3如说明书附图所示，里氏木酶内切酶EGIII的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶EGIII株。实施例4
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶EGIV的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GSl 15中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的 高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶EGIV株。实施例5
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶EGV的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶EGV株。实施例6
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶CEL74A的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含KpnI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GSl 15中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶CEL74A株。实施例7
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶CEL61B的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GSl 15中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶CEL61B株。实施例8
如说明书附图所示，里氏木酶内切酶CEL5B的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶内切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入Yro液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶内切酶CEL5B株。实施例9
如说明书附图所示，将里氏木酶外切酶CBHII M16190. I的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含KpnI-NotI酶切位点的里氏木酶外切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZaABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶外切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GSl 15中。YH)平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶外切酶CBHIIM16190. I 株。实施例10 如说明书附图所示，将里氏木酶外切酶CBHII M55080. I的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含KpnI-NotI酶切位点的里氏木酶外切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZaABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶外切酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GSl 15中。YH)平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶外切酶CBHIIM55080. I 株。实施例11
如说明书附图所示，里氏木酶P葡糖苷酶BGLI的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含KpnI-NotI酶切位点的里氏木酶内切酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZ a ABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶P葡糖苷酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶3葡糖苷酶BGLI 株。实施例12
如说明书附图所示，里氏木酶P葡糖苷酶BGLII的cDNA基因序列从5’端到3’端，PCR扩增得到的含EcoRI-XbaI酶切位点的里氏木酶P葡糖苷酶cDNA的片断，插入图I质粒pPICZaABC3的多克隆酶切位点MCS2中，并且构建了多拷贝体系，测序证实已经成功地构建了里氏木酶P葡糖苷酶cDNA基因表达载体4。此表达载体4整合入巴斯德毕赤酵母GS115中。YPD平板筛选后，转入YH)液体培养基培养。酵母收获后，酶蛋白提纯，筛选得到酶比活性高，产率高的高产株系，即表达纤维素酶重组毕赤酵母菌5-里氏木酶3葡糖苷酶BGLII 株。实施例13
上述表达纤维素酶的重组毕赤酵母菌，经过再生纤维素非晶(RAC)亲和层析，得到的酶蛋白纯度就能达到90%。具体实施例如下
再生纤维素非晶(RAC)亲和层析柱的制备，将发酵液离心后，取上清液100毫升加入亲和层析柱，双蒸水清洗三次后，用60%乙二醇洗脱酶蛋白。含乙二醇的酶蛋白置于10 kDaVivaspin 500超滤膜,购自德国赛多利斯(Sartorius-Stedim)公司，用50 mM,PH 5. 0的醋酸纳缓冲液置换去除乙二醇，获得酶的原液。每克再生纤维素非晶的亲和力为360毫克酶蛋白。经过一步亲和层析，酶蛋白纯化收率就达90%，明显高于现有技术的纯度20%左右。纤维素酶活性检测方法
纤维素内切酶采用羟甲基纤维素法，纤维素外切酶采用微晶纤维素法，3葡糖苷酶采用@水杨苷法，参见常规手册。表I，12个菌株纤维素酶活性(平均值土标准差)
权利要求
1.一种表达纤维素酶的重组酵母菌株，其特征在于，多拷贝纤维素酶基因整合入分泌型表达载体，构建出酶蛋白分泌表达质粒，导入毕赤酵母受体菌，得到表达纤维素酶的重组酵母菌株。
2.如权利要求I所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株，其特征在于，所述的多拷贝为2,4,6,8,10,20,30,40,50,60,70,80, 90，100 任一拷贝数。
3.如权利要求I所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母受体菌为巴斯德毕赤酵母GSl 15。
4.如权利要求I至3任一所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株，其特征在于，纤维素酶基因多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒PPICZ a ABC中，构建出酶蛋白分泌表达质粒，导入毕赤酵母受体菌，得到表达纤维素酶的重组酵母菌株。
5.如权利要求4所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株，其特征在于， (1)里氏木酶内切酶EGI，GeneBank编号M15665.I，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGI酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGI的重组毕赤酵母菌； (2)里氏木酶内切酶EGII,GeneBank编号AB003694.I，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGII酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGII的重组毕赤酵母菌； (3)里氏木酶内切酶EGIII，GeneBank编号M19373.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGIII酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGIII的重组毕赤酵母菌； (4)里氏木酶内切酶EGIV，GeneBank编号Y11113.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGIV酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGIV的重组毕赤酵母菌； (5)里氏木酶内切酶EGV，GeneBank编号Z33381.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶EGV酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶EGV的重组毕赤酵母菌； (6)里氏木酶内切酶CEL74A，GeneBank编号AY281371.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶CEL74A酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶CEL74A的重组毕赤酵母菌； (7)里氏木酶内切酶CEL61B，GeneBank编号AY281372.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶CEL61B酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶CEL61B的重组毕赤酵母菌； (8)里氏木酶内切酶CEL5B，GeneBank编号AY281373.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶内切酶CEL5B酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶内切酶CEL5B的重组毕赤酵母菌； (9)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII,GeneBank编号M16190. 1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶外切酶CBHII M16190. I酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶外切酶CBHII M16190. I的重组毕赤酵母菌； (10)里氏木酶里氏木酶外切酶CBHII,GeneBank编号M55080. I，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶外切酶CBHII M55080. I酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶外切酶CBHII M55080. I的重组毕赤酵母菌； (11)里氏木酶P葡糖苷酶BGLI，GeaneBank编号U09580.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLI酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶P葡糖苷酶BGLI的重组毕赤酵母菌； (12)里氏木酶P葡糖苷酶BGLII，GeneBank编号AB003110.1，多拷贝整合到毕赤酵母相容性质粒pPICZ a ABC中，构建出里氏木酶P葡糖苷酶BGLII酶蛋白分泌表达质粒，获得表达里氏木酶P葡糖苷酶BGLII的重组毕赤酵母菌。
6.权利要求5所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株在生产纤维素酶中的应用。
7.如权利要求6所述的表达纤维素酶的重组酵母菌株在生产纤维素酶中的应用，其特征在于，发酵后纤维素酶蛋白的提取纯化，采用再生纤维素非晶亲和层析工艺，获得高纯度的酶蛋白制剂。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种表达纤维素酶的重组酵母菌株及其在生产纤维素酶方面的应用。多拷贝纤维素酶基因整合入分泌型表达载体，构建出酶蛋白分泌表达质粒，导入毕赤酵母受体菌，得到表达纤维素酶的重组毕赤酵母菌。本发明的表达纤维素酶的重组毕赤酵母菌酶产率高，活性高，可以胞外分泌酶蛋白。
文档编号C12R1/84GK102643758SQ20121012614
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者陈战 申请人:陈战