专利名称：一株产甘草次酸的甘草内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术：
甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza Linn)属乌拉尔甘草(G. uralensis Fisch)，胀果甘草(G. inflate Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根茎，广泛分布于我国东北、西北及华北等地。甘草性味甘平，为补气类中药，具有补中益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和药性等功效。中医处方离不开甘草，自古至今，广为药用，兼有“国老”的尊号。近年来，野生甘草因过度采挖强度而濒临灭绝，甘草已被列入《野生药材资源保护条例》的国家二级保护植物。、植物内生真菌是产生活性物质和新化学物质的潜在资源，不但可以帮助维护人类健康，也可以维护动物和植物的健康。实验研究表明，药用植物与内生真菌在相互作用的过程中，有的内生真菌能产生与植物相同或相似的活性物质，因此从药用植物中分离能够产生活性物质的内生真菌已成为当今学者的研究趋势。
发明内容
本发明提供了一株产甘草次酸的甘草内生真菌。本发明产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为6 8cm，中心凸起，菌落为白色，后中央变为深红色，菌丝密集，毡状，基质深红棕色，产分生孢子，分生孢子头呈长圆筒形，分生孢子着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，分生孢子单生，单细胞，卵形。本发明甘草次酸的甘草内生真菌,它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,其ITS序列提交至NCBI网页，应用BLAST分析进行同源性比较，采用MEGA 4. I软件中Alignment Explorer对菌株RE5与相关菌株进行同源性分析,构建系统发育树,在系统发育树中，菌株RE5与Fusarium oxysporum strain CPRI15在同一个分支上，其18S rDNA序列相似性为97%，与菌株RE5在同一簇上的其它菌都属于镰孢霉属，相似性都是97%，结合形态学观察结果，确定菌株RE5应归于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的一个新菌株。本发明产甘草次酸的甘草内生真菌,它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明利用微生物制药手段提取分离野生甘草健康植株的内生真菌RE5同时以甘草次酸为对照，采用HPLC法分析检测RE5的发酵液，结果从甘草内生真菌RE5发酵液中检测到甘草的主要活性成分甘草次酸，说明内生真菌RE5能够产生与宿主药用植物甘草相同的活性成分——甘草次酸。将获得的RE5菌株通过形态学观察和18S rDNA序列分析鉴定其种属。本发明产甘草次酸的甘草内生真菌,它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，本发明对采用甘草内生真菌RE5生产甘草次酸具有指导意义。
图I为具体实施方式
一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5的菌落形态图；图2为具体实施方式
一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的孢子显微结构 图；图3为具体实施方式
一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的18S rDNA提取后进行扩增，PCR检测结果的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE5 ；图4为具体实施方式
一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的菌落PCR检测结果的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE5 ；图5为具体实施方式
一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的系统进化树；图6为具体实施方式
一中甘草次酸对照品的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图7为具体实施方式
一中供试品RE5的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图8为具体实施方式
一中加入对照品后供试品RE5的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图9为具体实施方式
一中空白对照品的HPLC色谱图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC No M2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本实施方式中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为6 8cm，中心凸起，菌落为白色，后中央变为深红色，菌丝密集，毡状，基质深红棕色，产分生孢子，分生孢子头呈长圆筒形，分生孢子着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，分生孢子单生，单细胞，卵形。本实施方式中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,其生长温度为28°C,生长pH值自然。本实施方式中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum) RE5,该菌株分离自健康的野生甘草的根莖，采自大庆地区,植株年龄3年,植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养选取健康的野生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成Icm小段，然后于无菌超净台内将甘草的根茎按下述方法进行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗3次；用无菌手术刀将野生甘草的根茎从中间切开，分别置于5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基和5%甘草提取液马铃薯液体分离培养基中，于28°C恒温水浴摇床和恒温培养箱中，培养3 5d,待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4°C保存备用；其中5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的5%甘草提取液组成，pH值为7. 0 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；5%甘草提取液马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液组成，pH值为7. 0 7. 2，121 °C下高压灭菌30min ；’斜面固体培养基为取5mL5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。结果从野生甘草的根茎中分离出内生真菌RE5，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。筛选出的内生真菌RE5根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，其菌株的形态学特征与镰孢霉属菌特征极为相近，菌落形态如图I所示，孢子显微结构如图2所示；分子鉴定内生真菌RE5发酵液抽滤得菌丝体用25 %乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，吸干残余液体，使沉淀尽可能干燥，然后在液氮中迅速研磨成粉末，提取总DNA后进行目的片段的PCR扩增，将含有目标条带的PCR产物全部进行再一次的点样，用2%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用解剖刀将目的条带切下，用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，制备大肠杆菌感受态细胞，将PCR产物与pMD18-T载体进行连接后，连接产物加入到感受态细胞中，进行菌落PCR验证；挑取单菌落进行大肠杆菌转化子的PCR检测，证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后，将克隆阳性菌株送上海生工生物工程技术服务有限公司测序；所测定的核苷酸序列在NCBI数据库中应用BLAST分析进行同源性比较，并根据分子系统学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的18S rDNA序列应用软件CLUSTALX 1.83和1^6八4. I以近邻结合法(Neighbor-joining)构建系统发育树，bootstrap检验值> 50% (1000重复)，确定目标菌株的分类地位；内生真菌RE5菌株18S rDNA提取后进行扩增，PCR检测结果见图3，结果显示菌株的18S rDNA大小约为500kb，可直接用于连接T载体。菌落PCR检测结果(如图4所示)表明目的片段已经转入T载体，并成功在大肠杆菌中扩增，可将阳性克隆菌株送往上海英骏生物技术有限公司测序,结果甘草内生真菌RE5测出序列总长为544bp，喊基序列见SEQ ID NO 1 ； 测序结果应用BLAST分析进行同源性比较，采用MEGA4. I软件中Al ignmentExplorer对菌株RE5与相关菌株进行同源性分析，构建系统发育树(如图5所示)，在系统发育树中，菌株RE5与Fusarium oxysporum strain CPRI15在同一个分支上，其18S rDNA序列相似性为97%，与菌株RE5在同一簇上的其它菌都属于镰孢霉属，相似性都是97%，结合形态学观察结果，确定菌株RE5应归于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的一个新菌株。采用琼脂块法测定甘草内生真菌的抑菌活性将已分离到的内生真菌RE5接种于PDA培养基(200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和IOOOmL的水组成，pH自然，121°C灭菌20min)上，28 °C培养4_7天，待培养基内有明显的颜色变化后，用直径为6mm的打孔器打取菌饼，放在含菌平板上，每株真菌做3个重复，用PDA培养基做阴性对照，用含链霉素和制霉素PDA培养基做阳性对照，制备好的平板在37°C恒温培养24h后观察，十字交叉法測量抑菌圈直径(Φ)。甘草内生真菌RE5对12种试验菌的抑菌活性实验结果见表I。表I
试验菌株:A :金黄色葡萄球菌；B :短小芽孢杆菌；C :枯草芽孢杆菌；D :单增李斯特菌；E :酿脓链球菌；F :粪肠球菌；G :屎肠球菌；H :大肠杆菌；1 :肺炎克雷伯菌J :鲍曼不动杆菌；K :铜绿假单孢菌；L 白假丝酵母；Str :链霉素；Nys :制霉素。-无活性；+活性较弱，抑菌圈直径< IImm ;++活性中等，抑菌圈直径Il-15mm ；+++活性较强，抑菌圈直径>15mm。甘草内生真菌RE5的抑菌活性实验结果表明，内生真菌RE5具有抑制细菌生长的潜在活性物质。甘草内生真菌RE5发酵液的抑菌活性甘草内生真菌RE5的发酵液对12种试验菌的抑菌活性实验结果见表2，结果表明甘草内生真菌RE5的发酵液具有一定的抑菌活性。表 2
样品"|A B 「C Γ D I E F Γ G 「H l' I J [K 「L
发酵液 +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ 一一-一 Str+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 一
Nys- -- -- -- -- -- +++试验菌株:A :金黄色葡萄球菌；B :短小芽孢杆菌；C :枯草芽孢杆菌；D :单增李斯特菌；E :酿脓链球菌；F :粪肠球菌；G :屎肠球菌；H :大肠杆菌；1 :肺炎克雷伯菌J :鲍曼不动杆菌；K :铜绿假单孢菌；L 白假丝酵母；Str :链霉素；Nys :制霉素。-无活性；+活性较弱，抑菌圈直径< IImm ;++活性中等，抑菌圈直径Il-15mm ；+++活性较强，抑菌圈直径>15mm。甘草内生真菌RE5的活性代谢物检测I色谱条件色谱柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mmX 250mm，5 μ m);流动相甲醇-水-冰醋酸(85 14 I)；
流速ImL· mirf1 ；检测波长254nm；柱温25°C；进样量10 μし2对照品溶液的制备精密称取甘草次酸对照品适量，以甲醇制成lmg/mL的对照品储备液，精确量取对照品储备液O. 5mL,置于ImL量瓶中以甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为O. 5mg/mL甘草次酸对照品溶液，保存于4°C冰箱备用。
3空白对照品溶液的制备将含有50mL PDA液体培养基的IOOmL三角瓶，置于28°C 120r/min空气浴摇床中，培养15天取出，过滤后得到的滤液，40°C减压蒸懼，真空抽干后，加入ImL无菌水溶解，即为空白对照品溶液，保存于4°C冰箱备用。4供试品溶液的制备分别挑取已活化的甘草内生真菌RE5接种于含50mL PDA液体培养基的IOOmL三角瓶中，作10个重复，置于28°C 120r/min空气浴摇床中，培养15天取出，过滤后得到的滤液，40°C减压蒸馏，真空抽干后，加入ImL无菌水溶解，保存于4°C冰箱备用。供试品中甘草次酸的鉴别采用对照品加入法。5高效液相色谱检测结果甘草内生真菌RE5发酵液中含有甘草次酸，在色谱条件下，供试品与甘草次酸对照品相应位置的色谱峰一致，而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认，结果见图6，图7，图8及图9。空白对照无干扰。结论甘草内生真菌RE5为尖孢铼刀菌Fusarium oxysporum,其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，说明甘草内生真菌RE5能够产生甘草次酸。本发明对采用甘草内生真菌RE5生产甘草次酸具有指导意义。
权利要求
1. 一株产甘草次酸的甘草内生真菌，其特征在于它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012046，保 藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
全文摘要
一株产甘草次酸的甘草内生真菌，它涉及一株内生真菌。产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NoM 2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，本发明对采用甘草内生真菌RE5生产甘草次酸具有指导意义。
文档编号C12P33/00GK102660467SQ20121017115
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者孔德崴, 孙雅北, 白长胜, 谭佳音, 郑春英 申请人:黑龙江大学