专利名称：一种促进肠动力的真菌次生代谢产物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种促进肠动力的真菌次生代谢产物的制备方法，尤其是一种采用硫磺多孔菌发酵得到的促进肠动力的次生代谢产物的制备方法。
背景技术：
由科学出版社1998年出版的《中国经济真菌》中，对真菌硫磺多孔菌的性状、分布及经济价值进行了报道。相关文献叙述了硫磺多孔菌的子实体大、菌盖呈瓦状排列，肉质多汗，干后轻而脆。菌盖宽8-30cm，厚1-2cm，表面硫磺色呈鲜橙色，菌肉白色或浅黄色，管孔为硫磺色，干后褪色，孔口多角形，该菌的重要特征是子实体瓦状生长，硫磺色，生于柳、云等活立本树干、枯立木上。该菌无毒可食，具有药用，性温，味甘，能调节机体，增进健康，抵抗疾病。
消化道动力功能是消化系统最重要的生理功能之一，其动力功能是由各个水平的平滑肌协调运动完成的。消化道动力障碍相当常见，除溃疡病、慢性胃炎、食管炎等常伴有动力障碍外，某些系统性疾病常伴随消化道动力功能发生改变，而在无明显的器质性病变的消化疾病，如功能性消化不良，肠易激综合症和特发性假性肠梗阻等病中，动力障碍可能是其基本的发病机理。因此有关专家预言消化道动力药将具有广阔的开发前景。
目前在临床上使用的促胃肠动力药象胃复安，氯波比利，吗叮林，西沙比利等有肯定的疗效，近年研究表明红霉素也有促胃肠动力作用，但同时也发现这些药物均有不同程度的副作用。
祖国传统医学在治疗胃肠疾病方面有着悠久的历史和良好的疗效，但从促胃肠动力角度研究中药调治胃肠疾病的报道甚少。能否遵循中医理论，研制出高效、低副作用的中药促动力药，已成为众多医药学家们考虑的热点之一。
硫磺多孔菌为生长在我国某山区的天然野生菌体，民间使用发现该菌对腹胀、气寒、结肠炎等消化系统疾病有奇效。当地民间至少百例腹胀、尿频、腰痛、神经衰弱等疾病患者服用后，发现具有很好的疗效，尤其是其对消化系统疾病效果独特且立竿见影，被当地称之为神药。
发明内容
本发明的目的是提供采用硫磺多孔菌进行分离、发酵而获得具有促进肠动力作用的真菌发酵次生代谢产物的制备方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案是采得野生硫磺多孔菌子实体，经分离筛选得一优良菌株，通过培养条件优化，得到适合此菌生长的培养基，而后通过液体深层发酵得到大量的该菌发酵产物(包括菌丝体和发酵液)，即一种可促进胃肠动力硫磺多孔菌发酵液。
上述的发酵培养基组成为蛋白胨0.05-0.5％、酵母粉0.05-0.5％、蔗糖1-5％、麦麸1-5％、玉米淀粉1-5％、KH2PO40.05-0.5％、MgSO40.01-0.1％、Nacl0.01-0.1％，余量为水。
对发酵的温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于使用菌的生长为准。如培养温度宜在20-30℃。
本发明提供一种发酵方法将分离得到的优良菌株接于试管斜面培养基上(PDA)，作保存菌种之用。发酵时取斜面菌种接于摇瓶，20-30℃，摇床转速100-200转/分，培养1-5天，接入种子罐(18L)，20-30℃，通气量为2-10L/min，培养3-6天，接入发酵罐(150L)，20-30℃，通气量为3-5m3/h，培养1-10天，放罐，离心得到发酵液及菌丝体。发酵液及菌丝均为橘红色，气味清香。
由上述的所得的培养物，通过提取代谢物的方法，制得活性次生代谢产物。例如，可利用该活性产物与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取。这些方法可以单独使用，也可适当配合或反复利用。
一种具有胃肠动力的活性次生代谢产物，通过上述的硫磺多孔菌发酵液分离得到，先用乙醇或丙酮沉淀，除去多糖及蛋白质等大分子化合物，离心取上清除醇后，上强酸性阳离子交换树脂柱，反洗3次，而后水洗至中性，再用pH9-10氨水浸泡、洗脱至洗脱液无色为止，然后用5-10％Nacl、1-5％NaOH溶液1-10倍柱体积洗脱，收集所得液蒸干，用无水乙醇除盐，除醇得活性次生代谢产物。
本发明对硫磺多孔菌的分离、驯化培养及液体深层发酵技术的成功，扩大了开发利用的价值。在药物筛选模型指导下通过对发酵液的分离提取得到菌体发酵次生代谢产物。通过各项动物的离体及整体试验证明了发酵液次生代谢产物具有促进肠动力的生物活性。同时经动物毒性试验证明多孔菌发酵液次生代谢产物无毒副作用。
此次生代谢产物具有润肠通便、增强肠蠕动作用，犹对术后病人排气具有明显疗效，该真菌的开发利用将产生显著的社会和经济效益。
图1是本发明发酵液的工艺流程图；图2是本发明从发酵液中提取次生代谢物的工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1 制备发酵培养基A蛋白胨1g、酵母粉5g、蔗糖10g、麦麸50g、玉米淀粉10g、KH2PO45g、MgSO40.1g、Nacl1g，水1000ml。
实施例2 制备发酵培养基B蛋白胨5g、酵母粉0.5g、蔗糖50g、麦麸10g、玉米淀粉50g、KH2PO40.5g、MgSO41g、Nacl0.1g，水1000ml。
实施例3 制备发酵培养基C蛋白胨0.5g、酵母粉1g、蔗糖30g、麦麸20g、玉米淀粉30g、KH2PO43g、MgSO40.5g、Nacl0.5g，水1000ml。
实施例4 制备发酵液将以分离得到的优良菌株接于试管斜面培养基上(PDA)，作保存菌种之用。发酵时取斜面菌种接于摇瓶，20℃，摇床转速100转/分，培养5天，接入种子罐(18L)，30℃，通气量为8L/min，培养3天，接入发酵罐(150L)，20℃，通气量为5m3/h，培养8天，放罐，离心得到发酵液及菌丝体。发酵液及菌丝均为橘红色，气味清香。本实施例采用上述的实施例2所制的培养基B。
实施例5 提取次生代谢产物将实施例4制备的硫磺多孔菌发酵液用乙醇沉淀，除去多糖及蛋白质等大分子化合物，离心取上清除醇后，上强酸性阳离子交换树脂柱，反洗3次，而后水洗至中性，再用pH9氨水浸泡、洗脱至洗脱液无色为止，然后用5％Nacl、1％NaOH溶液1倍柱体积洗脱，收集所得液蒸干，用无水乙醇除盐，除醇得活性次生代谢产物，其收率为2.00％。
实施例6 提取次生代谢产物将硫磺多孔菌发酵液用丙酮沉淀，离心取上清，用强酸性阳离子交换树脂柱交换后水洗至中性，再用pH10氨水浸泡、洗脱至洗脱液无色为止，然后用10％Nacl、5％NaOH溶液10倍柱体积洗脱，收集所得液蒸干，用无水乙醇除盐，除醇得活性次生代谢产物，其收率为2.50％。
实施例7 提取次生代谢产物同实施例5，经过沉淀离心及树脂交换后，用pH8氨水洗脱，然后用8％Nacl、3％NaOH溶液5倍柱体积洗脱，收集所得液蒸干，用无水乙醇除盐，除醇得活性次生代谢产物其收率为3.00％。
实施例8经国家卫生部指定的北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心，依据《保健食品的功能学评价程序和检测方法》的规定，判定多孔菌发酵液次生代谢产物具有润肠通便功能。试验动物经口给予发酵液次生代谢产物14天后，灌胃复方地芬诺酯造成小鼠便秘模型。与模型对照组相比，中剂量组(3.3ml/kg.bw)小鼠小肠推进率提高88％(p＜0.001)，8小时排便重量增加32％(p＜0.05)。高剂量组(10.0ml/kg.bw)首次排便时间缩短14％(p＜0.05)，8小时排便重量增加101％(p＜0.01)。因此，根据部协作组《新增保健功能评价指标及程序的初步方案》判定该发酵液次生代谢产物具有润肠通便的作用。
辽宁省食品卫生监督检验所根据GB15193.1～15193.19-94《食品安全性毒理学评价程序和方法》进行试验，多孔菌发酵液次生代谢产物对两种性别的大、小鼠经口急性毒性(LD50)均大于10.00g/kg.bw，根据急性毒性分级，属无毒物；四项遗传毒性试验(Ames试验，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，小鼠精子染色体畸型试验，小鼠睾丸染色体畸变试验)结果均为阴性；大鼠传统致畸试验结果表明无致畸作用；大鼠30天喂养试验中临床检查、血液学检查、血液生化学检查、脏器称量、病理组织学检查，结果表明各检验项目试验组与对照组比较，差异不显著。因此认为食用安全。
实施例91、对动物整体的药效观察由表一可见，经口给3个剂量组的多孔菌发酵液次生代谢产物及西沙比利后，小鼠小肠推进比明显增加，与对照组比较，有显著性差异。
表一 多孔菌发酵液次生代谢产物对小鼠小肠推进运动的影响组别动物数 平均小肠推进比去离子水 20 60.61±8.8西沙比利 20 68.53±7.4*多孔菌发酵液次生代谢产物25％ 20 68.59±7.92*多孔菌发酵液次生代谢产物50％ 20 73.41±10.99多孔菌发酵液次生代谢产物100％ 20 79.53±5.91****p＜0.05与正常对照组间比较**p＜0.01与正常对照组间比较
***p＜0.001与正常对照组间比较2、对离体肠管的药效观察在18只离体豚鼠回肠，分别观察了不同浓度的多孔菌发酵液次生代谢产物(6.25％、12.5％、25％、50％、75％、100％)1.0ml对回肠自发收缩的影响。结果显示，在一定范围内，随浓度增加，引起的收缩幅度增大。12.5％浓度的多孔菌发酵液次生代谢产物对离体豚鼠回肠收缩较正常收缩即有显著性增加(p＜0.05)，50％浓度效应达到最大(p＜0.01)。
实施例10采用双盲随机方法将40例阑尾切除术后的患者分为2组。多孔菌发酵液次生代谢产物组20例，男性8例，女性12例，平均年龄27.04岁。术后6小时服用多孔菌发酵液次生代谢产物50ml，p.o.q12h，直至肛门排气。安慰剂组20例，男性9例，女性11例，平均年龄30.09岁。服用0.9％Nacl50ml，服法与多孔菌发酵液次生代谢产物相同。通过询问肛门排气时间来观察疗效。结果多孔菌发酵液次生代谢产物组使阑尾切除术后肛门排气时间(术后14.03小时)较安慰剂组(术后38.9小时)明显缩短(p＜0.01)。
权利要求
1.一种促进肠动力的真菌次生代谢产物，其特征在于由下述方法制备而成(1)分离筛选硫磺多孔菌菌株；(2)用液体深层发酵得到的发酵产物，发酵产物中包含菌丝体和发酵液；发酵培养基组成为蛋白胨0.05-0.5％、酵母粉0.05-0.5％、蔗糖1-5％、麦麸1-5％、玉米淀粉1-5％、KH2PO40.05-0.5％、MgSO40.01-0.1％、Nacl 0.01-0.1％、余量为水；(3)采用提取代谢产物的方法，获得一种具有胃肠动力的活性次生代谢产物。
2.一种促进肠动力的真菌次生代谢产物的制备方法，其特征在于(1)分离筛选硫磺多孔菌菌株；(2)用液体深层发酵得到的发酵产物，发酵产物中包含菌丝体和发酵液；发酵培养基组成为蛋白胨0.05-0.5％、酵母粉0.05-0.5％、蔗糖1-5％、麦麸1-5％、玉米淀粉1-5％、KH2PO40.05-0.5％、MgSO40.01-0.1％、Nacl0.01-0.1％、余量为水；(3)采用提取代谢产物的方法，获得一种具有胃肠动力的活性次生代谢产物。
3.权利要求1或2所述的一种促进肠动力的真菌次生代谢产物的制备方法，其特征在于提取代谢产物的方法是先用乙醇或丙酮沉淀，除去多糖及蛋白质等大分子化合物，离心取上清除醇后，上强酸性阳离子交换树脂柱，水洗至中性，再用pH9-10氨水浸泡、洗脱至洗脱液无色为止，然后用5-10％Nacl、1-5％NaOH溶液1-10倍柱体积洗脱，收集所得液蒸干，用无水乙醇除盐，除醇得活性次生代谢产物。
4.权利要求1所述的多孔菌发酵次生代谢产物，具有润肠通便、增强肠蠕动作用，对术后病人排气具有明显疗效。
全文摘要
本发明公开了一种促进肠动力的真菌次生代谢产物的制备方法，该方法通过从硫磺多孔菌的野生子实体中分离并筛选出一株优良菌种，运用现代液体深层发酵技术得到大量的该菌发酵产物(包括菌丝体和发酵液)，在药物筛选模型指导下对发酵液的分离提取，得到具有明显促进肠动力的菌体发酵次生代谢产物。通过各项动物的离体及整体试验证明了发酵液次生代谢产物具有促进肠动力的生物活性。同时经动物毒性试验证明多孔菌发酵液次生代谢产物无毒副作用。
文档编号A61P1/10GK1468605SQ0213261
公开日2004年1月21日 申请日期2002年7月17日 优先权日2002年7月17日
发明者杜昱光, 陆海峰, 李曙光, 白雪芳, 曲天明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所