用于检测人类egfr基因突变的引物及方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，特别是基因突变的检测。更具体而言，本发明公开了检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的9组引物及使用其进行检测的方法。
【专利说明】用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及基因突变的检测，特别涉及检测表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其方法。
【背景技术】
[0003]表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于HER或ErbB受体家族的一员，该家族包括EGFR (ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4) ? EGFR 也常被称作HERl或ErbBl。EGFR及其家族成员能够调控细胞分化、凋亡、细胞运动、新血管生成、浸润和转移等多项生理过程，同时在大部分的人类肿瘤中都有表达，因此EGFR已经被证明在众多肿瘤的发生、发展及预后过程中发挥了重要调控作用。
[0004]EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase, TK)活性的受体，TK在EGFR的活性中发挥了关键作用。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者，进行EGFR基因突变检测。需要指出，检测EGFR基因突变并不能作为患者是否患癌的依据。在我国《NCCN:非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》中只是明确提出了临床实践中EGFR-TKI治疗前需要针对EGFR编码区第18、19、20和21外显子的突变位点开展检测。确定患者是否携带有EGFR突变在一定程度上避免无效用药和社会经济资源的浪费。近年来，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal Growth Factor Receptor-TyrosineKinase Inhibitor, EGFR-TKI)类药物(包括吉非替尼和厄洛替尼等)已经在非小细胞肺癌等肿瘤的特定患者的临床治疗中被证明效果显著(Paez JG, et al.Science.2004;304:1497-1500)。EGFR-TKI能够有效延长患者的生存期，但研究表明患者个体EGFR的第18、19、20和21号外显子的突变状态(尤其是19号外显子的插入缺失以及21号外显子L858R点突变最为常见)和疗效密切相关，占到突变总数的90%以上(Chan SK et al.EurJ Cancer 42，1，2006, 17-23)。因此，在引物设计时包含核心突变区的高频突变点和尽可能多的突变点，检测时将会最大程度上降低EGFR突变检测的假阴性。
[0005]目前，使用最多的临床基因突变检测方法是PCR测序法，PCR测序法是目前默认的“金标准”。其它常用的方法还包括PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、Real time PCR法、DHPLC和ARMS法等。PCR测序法敏感度较低，对低质量或含量较低的样本检测会产生较大的假阳性和假阴性。ARMS法能将突变检测的选择性提高到1%，但是对于质量低或含量低的DNA样品，这样的选择性依然偏低。另外，ARMS法依靠常规凝胶电泳或探针杂交来检测PCR产物，对于因样品含量较低导致扩增效率较低的突变产物，在电泳条带上可能不能显示。同时，该方法不能对样品所含突变进行定量或半定量分析。本领域需要可高灵敏度和高选择性地进行突变检测的PCR技术。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本发明使用了一种加荧光并结合毛细管电泳的阻滞PCR技术方法(AMP-MDS)。
[0007]具体而言，本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰的引物及PCR方法。其中，所述PCR方法包括如下步骤:
1)对于EGFR基因的41种突变(位于18、19、20和21号的外显子)，对每一个点突变设计包括一对外引物和两个内引物的组合；对每一个缺失突变或者插入突变，设计一对外引物，其中所述两个内引物方向相向，3’端位于突变位置处，一个内引物的3’端和正常碱基互补，另一个内引物的3’端与突变位置的突变碱基互补；所述两个外引物分别和一个内引物可以配对进行PCR扩增，它们自身也可以进行配对扩增；所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的两个产物的长度差均须在5 bp以上；在所述内引物3’端倒数5个碱基的区域引入错配，按照热力学稳定性高低相间的模式引入(低热力学稳定性是指引物与模板结合能力弱，不稳固，例如含有两个氢键的AT配对，或者AC，AG等错配；高热力学稳定性是指引物与模板结合能力强，比较稳固，如含有三个氢键的CG配对)；将荧光加在外引物的5’端，且使用不同颜色的荧光染料对两个内引物进行标记；
2)用步骤I)中的各组引物分别扩增来自待测样品的模板序列，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物I以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物2和产物3 ;对于插入突变或者缺失突变，得到长度有差异的两条产物；
3)将上述产物通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，在产物1、产物2和产物3均有峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。
[0008]在一个实施方案中,所述PCR方法还包括定量步骤:
4)进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
[0009]共41种突变
在本发明中，肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变具体详见表1。
[0010]表1肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变
【权利要求】
1.用于检测人类EGFR基因突变的引物，包括下列9组引物:
(1)G719S_0UT_FP: SEQ ID N0.1、
G719S_0UT_RP: SEQ ID N0.2、
G719S_IN_FP: SEQ ID N0.3、
G719S_IN_RP: SEQ ID N0.4 ；
(2)G719C_0UT_FP: SEQ ID N0.1、
G719C_0UT_RP: SEQ ID N0.2、
G719C_IN_FP: SEQ ID N0.5、
G719C_IN_RP: SEQ ID N0.6 ；
(3)G719A_0UT_FP: SEQ ID N0.7,
G719A_0UT_RP: SEQ ID N0.8、
G719A_IN_FP: SEQ ID N0.9、
G719A_IN_RP: SEQ ID N0.10 ；
(4)Exl9-del_OUT_FP: SEQ ID N0.11、
Exl9-del_OUT_RP: SEQ ID N0.12 ；
(5)S768I_OUT_FP: SEQ ID N0.13、
S768I_OUT_RP: SEQ ID N0.14、
S768I_IN_FP: SEQ ID N0.15、
S768I_IN_RP: SEQ ID N0.16 ；
(6)T790M_0UT_FP: SEQ ID N0.17、
T790M_0UT_RP: SEQ ID N0.18、
T790M_IN_FP: SEQ ID N0.19、
T790M_IN_RP: SEQ ID N0.20 ；
(7)Ex20-1ns_0UT_FP: SEQ ID N0.21、
Ex20-1ns_0UT_RP: SEQ ID N0.22 ；
(8)L858R_OUT_FP: SEQ ID N0.23、
L858R_OUT_RP: SEQ ID N0.24、
L858R_IN_FP: SEQ ID N0.25、
L858R_IN_RP: SEQ ID N0.26 ；
(9)L861Q_OUT_FP: SEQ ID N0.27、
L861Q_OUT_RP: SEQ ID N0.28、
L861Q_IN_FP: SEQ ID N0.29、
L861Q_IN_RP: SEQ ID N0.30。
2.一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤: 用权利要求1所述的9组引物扩增来自待测样品的模板； 使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。
3.权利要求2的方法，还包括步骤:进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于:步骤2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。
5.如权利要求2-4任一项所述的方法，其中扩增用包括如下的PCR反应体系进行: PCR缓冲液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
6.如权利要求5所述的方法，其中用于扩增的PCR反应体系包括: PCR缓冲液
rTaq 酶 2.5 μ L
1X缓冲液5 μ L
dNTP-MIX 200 μ mol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物各I μ L
甲酰胺I yL。
7.一种试剂盒，包括:权利要求1所述的9组引物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，还包括PCR反应缓冲液。
9.如权利要求8所述的试剂盒，还包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl2、外引物和甲酰胺。
【文档编号】C12N15/11GK104131091SQ201410346892
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】不公告发明人 申请人:思博奥科生物信息科技（北京）有限公司