高通量鉴定甜瓜杂交种纯度的方法与流程

本发明属于蔬菜育种与应用技术领域，涉及一种高通量鉴定甜瓜杂交种纯度的方法。

背景技术：

甜瓜是传统的特色水果和瓜农就业增收的主要经济作物。甜瓜杂交种的种子纯度是种子质量的核心指标，随着甜瓜产业的发展和生产的需求，越来越多的优质、抗病新品种涌入市场，但由于杂交种子中混入了母本种子导致纯度不达标，引起的种子纠纷时有发生，给瓜农造成很大的经济损失，因此为了保护育种者、种子经营者及瓜农的利益，研究并建立快速、准确有效的种子纯度鉴定方法是非常重要的。

在众多分子标记技术中，ssr技术因其多态性高、操作简便、结果稳定可靠等优点，在甜瓜、黄瓜、西瓜等瓜类作物的杂交种纯度鉴定方面得到了广泛应用。甜瓜核基因组ssr标记呈现共显性遗传方式，电泳检测时，f1带型为双亲互补带型，只能通过单株检测才能显示f1种子中混入的母本种子，工作量较大。而在甜瓜杂交种子纯度鉴定工作中，母本株通常较少，如果能够通过混合样品检测就可显示母本的有无，从而迅速判定混合样品的整体纯度，将大幅度减少工作量，显著提高工作效率，因此，急需寻找能够进行混合样品分析的分子标记技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高通量鉴定甜瓜杂交种纯度的方法。

本发明提供了一种高通量鉴定甜瓜品种a的杂交种中是否混有其母本自交种的方法，其原理在于：甜瓜的线粒体基因组呈现独特的父系遗传特性。电泳检测时，纯合的f1带型和父本带型一样；如果f1带型是双亲带型，将表示f1种子中混入了母本种子。该方法具体可包括如下步骤：

(a1)从待测甜瓜种子中随机选取若干数目的种子，提取基因组dna，混合后形成混合样本dna；

(a2)以步骤(a1)所得混合样本dna作为模板，采用根据甜瓜线粒体基因组开发的ssr引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；

(a3)将步骤(a2)所得扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳谱图按照如下确定所述待测甜瓜种子是否均为甜瓜品种a的杂交种：若所述电泳图谱上具有所述甜瓜品种a的父本的特征谱带且不具有所述甜瓜品种a的母本的特征谱带，则所述待测甜瓜种子均为所述甜瓜品种a的杂交种，不含其母本自交种；若所述电泳图谱上同时具有所述甜瓜品种a的父本的特征谱带和所述甜瓜品种a的母本的特征谱带，则所述待测甜瓜种子中除了所述甜瓜品种a的杂交种外混有其母本自交种。

所述待测甜瓜种子为所述甜瓜品种a的杂交种，或者所述甜瓜品种a的杂交种与其母本自交种的混合。

在所述方法的步骤(a1)中，所述若干数目可为大于等于2且小于50的整数(如20-40)。

进一步，在本发明的一个实施例中，所述若干数目具体为20，即步骤(a1)中，每20个种子一混合。

在所述方法中，所述凝胶电泳具体为聚丙烯酰胺凝胶电泳；如非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；更加具体如8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在本发明中，所述8％非变性聚丙烯酰胺溶液具体由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％(质量百分比)acr-bis、40μltemed、400μl10％(质量百分比)ap配制而成。

在所述方法中，将所述扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，220v稳压电泳直至溴酚蓝指示剂迁移至可以使扩增dna片段能够被清楚识别的距离时，停止电泳；银染法染色，拍照记录特征谱带。

在所述方法中，从种子中提取基因组dna具体为从种子所发幼芽中提取基因组dna。更加具体的，为：将待测样品种子35℃发芽3-4天，取1cm左右的幼芽，分别装入2ml离心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl缓冲液1ml，充分混匀，得待测样品基因组dna，4℃下保存备用。

在所述方法中，进行pcr扩增采用的反应体系如下：基因组dna20ng、含mg²⁺的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l^-11μl，上下游引物0.25mmol·l^-1各1μl，taq酶5u·μl^-10.2μl，ddh2o补足至12.5μl。

在所述方法中，进行pcr扩增采用的退火温度为55℃。更加具体的，进行pcr扩增采用的扩增程序如下：94℃下预变性5min；94℃下变性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35个循环反应；72℃延伸5min；16℃永久保存。

在本发明的一个实施例中，所述甜瓜品种a为甜瓜品种“糖妃极品”。步骤(a2)中，所述根据甜瓜线粒体基因组开发的ssr引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链dna组成的引物对。相应的，所述“糖妃极品”的父本的特征谱带是大小为255bp的目的条带；所述“糖妃极品”的母本的特征谱带是大小为243bp的目的条带。

本发明还请求保护用于鉴定甜瓜“糖妃极品”杂交种纯度的引物对。

所述引物对具体由序列表中序列1和序列2所示两条单链dna组成。

所述引物对在如下(b1)或(b2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(b1)鉴定甜瓜“糖妃极品”杂交种纯度；

(b2)制备用于鉴定甜瓜“糖妃极品”杂交种纯度的试剂盒。

其中，所述鉴定甜瓜“糖妃极品”杂交种纯度可为高通量鉴定甜瓜“糖妃极品”杂交种纯度。

本发明的有益效果是：通过合理混合样品dna，避免了单株分析，具有简单、高效等优势。可以将至少20株样品dna进行混合，1次pcr检测即可显示混合样品中是否存在母本，大幅度减少了鉴定工作量，将鉴定效率提高20倍左右，具有较高的商业应用价值。

附图说明

图1为利用引物mtssr073扩增“糖妃极品”f1及其父本、母本和不同比例dna混合样品的pcr电泳结果。♀表示母本，♂表示父本，f1表示“糖妃极品”，1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50表示混合样品dna中的母本与f1体积比。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于高通量检测甜瓜“糖妃极品”杂交种混合样品纯度的方法

一、筛选用于鉴定甜瓜“糖妃极品”纯度的mtssr引物

从genbank下载甜瓜线粒体基因组序列，使用mreps2.5ssr序列鉴定程序，鉴定甜瓜线粒体基因组中含ssr的序列区段，同时设计出跨越ssr位点的pcr引物；

以“糖妃极品”母本、父本、f1为dna模板进行引物筛选，获得条带清晰、差异大、重复性好的引物mtssr073，其序列为；

mtssr073f：5’-tgtcgagttcactctttcattag-3’(序列1)；

mtssr073r：5’-ttcattctttgctctcgttatac-3’(序列2)。

二、利用特异性引物mtssr073对甜瓜“糖妃极品”杂交种子混合样品进行纯度鉴定

1、样品dna的快速提取：将供试甜瓜“糖妃极品”以及其父本和母本的种子，35℃发芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分别装入2ml离心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl缓冲液1ml，充分混匀，得待测样品基因组dna，4℃下保存备用；

2、样品dna混合：按照母本与f1(即“糖妃极品”)的体积比为1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的体积比进行样品dna混合；

3、pcr扩增

①反应体系

12.5μl反应体系如下：基因组dna20ng、含mg²⁺的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l^-11μl，上下游引物0.25mmol·l^-1各1μl，taq酶5u·μl^-10.2μl，ddh2o补足至12.5μl。

②反应条件

94℃下预变性5min；94℃下变性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min；16℃永久保存；

4、聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳

扩增产物在8％聚丙烯酰胺非变性凝胶(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配制而成。％均表示质量百分比)电泳分离，120v稳压1.5小时，电泳结束后，0.1％agno3银染6min；然后用2％naoh、0.4％甲醛显色，直至条带清晰即可。

5、拍照记录样品dna的特征谱带。

6、扩增结果分析：

mtssr073引物在“糖妃极品”父本、母本均可以扩增出特异标记，母本表现为243bp的特征谱带，父本表现为相异于母本的255bp特征谱带，f1表现和父本一样的255bp特征谱带。

混合样品中，当混合比例为1:1、1:5、1:10、1:20时，混合样品中均显示出清晰的243bp母本条带，说明当混样株数达到20株时，样品中即使只有1株母本株，也可以被检测出来。但是，当混合样品比例降低到1:30甚至1:40时，243bp的母本条带变弱；混合样品比例降低到1:50时弱带消失。说明当混样株数达到50株时，如果样品中有1株母本株，将很难被检测，影响纯度鉴定结果的准确性。具体结果如图1所示。

实施例2、采用混合样品法高通量检测“糖妃极品”杂交种样品纯度

一、样品dna的快速提取

将待测试的“糖妃极品”f1种子100粒，35℃发芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分别装入2ml离心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用组织捣碎仪打碎样品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl缓冲液1ml，充分混匀，得待测样品基因组dna，4℃下保存备用；

二、样品dna混合

将“糖妃极品”f1种子dna，按照每20株一混，形成5个混合样品。混合的20株样品，单株体积相同。

三、pcr扩增

1、反应体系

12.5μl反应体系如下：基因组dna20ng、含mg²⁺的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l^-11μl，上下游引物0.25mmol·l^-1各1μl，taq酶5u·μl^-10.2μl，ddh2o补足至12.5μl。

其中，基因组dna分为两组：一组为单株dna；另一组为混样dna。即实验中采用单株检测和混样高通量检测两种方法平行进行，以验证高通量检测方法的准确性。

2、反应条件

94℃下预变性5min；94℃下变性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min；16℃永久保存；

四、聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳

扩增产物在8％聚丙烯酰胺非变性凝胶(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配制而成。％均表示质量百分比)电泳分离，120v稳压1.5小时，电泳结束后，0.1％agno3银染6min；然后用2％naoh、0.4％甲醛显色，直至条带清晰即可。拍照记录样品dna的特征谱带。

五、扩增结果分析

采用单株dna进行pcr分析时，100株f1单株中有1株表现为母本带型，说明100株单株中混入了一株母本株；

采用混合样品dna进行pcr分析时中，只有混样1表现为杂合带型，说明20株f1单株中混入了母本，其余4个混样均表现为父本带型，表明这80株均为纯合的f1单株。将混样1进行单株检测，发现确实有1株母本，与单株检测结果一致。

<110>北京市农林科学院

<120>高通量鉴定甜瓜杂交种纯度的方法

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