与肝癌预后相关的血清miRNA标志物及其检测试剂盒的应用
【技术领域】
[00011本发明属于生物医学领域，具体涉及一种血清miRNA的检测产品以及miR-29a-3p 和miR-192-5p作为肝癌危险度(预后)肿瘤分子标记物的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是我国排名第二的常见恶性肿瘤，因为是乙肝感染大国，因而每年新发患者 众多，新发病人数占世界约50%，且具有早期症状不明显，进展迅速，复发转移率高等特点。 现有了匪分期及甲胎蛋白AFP并不能很好地指导患者预后，很多早期患者即使手术之后，也 常常容易复发转移，迫切需要新的分子标记物来指导患者预后，达到危险度分级分层的目 的，从而指导个体化治疗。
[0003] 肿瘤标志物（tumor marker，TM)是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细 胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的，反映肿瘤存 在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因产物等，存在于病人的 血液、体液、细胞或组织中，可用生物化学、免疫学及分子生物学等方法进行测定，对肿瘤的 辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发以及预后评价具有一定的价值。一些标记物起到 监测肿瘤可能容易复发，自然病程快速进展等预测患者病情进程的作用，称之为肿瘤预后 标记物。
[0004] 肝癌预后，是指肝癌患者从诊断确立的开始到最终(死亡）的病情进展过程，比如 说进展快慢，复发早晚，生存长短，简而言之就是从整个病情进展状态来评价最终结局的好 与坏。
[0005] 肝癌的预后标志物，就是揭示或预示病情发展进程往好的方面发展，还是往坏的 方面发展的生物标记物质，又分不良预后标志物和良好预后标志物，携带了不良预后标志 物，提示病人病情发展进程中，病情进展迅速，复发转移情况较多较早，生存时间较短；反 之，携带了良好预后标志物，提示病情发展缓慢，复发转移较少较晚，生存时间较长。简而言 之，预后标记物就是从肿瘤病人病情总体的概括出发，外在方面，揭示病情危险度高中低的 趋势情况；内延方面，揭示了肿瘤病情生物学异质性差异，导致的肿瘤生物学行为恶性高低 的不同。
[0006] 微小 RNA(microRNA，miRNA)来源于长链 RNA 初始转录产物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA 在细胞核中经酶切作用，形成具有莖环结构的miRNA前体，miRNA前体转运至胞质后，被进一 步加工成miRNA;成熟的miRNA在特定的宿主细胞内与脂质或脂蛋白结合形成微囊泡，以外 切酶体形式分泌至胞外，经体液微循环，被内吞入特定的受体细胞内发挥特定调节功能;月中 瘤相关miRNA可能来源于肿瘤细胞死亡、溶化或肿瘤细胞向周围环境所释放的miRNA ;miRNA 可在转录后水平通过与靶基因特异性的碱基互补配对，引起靶基因的降解或者抑制其翻 译，调控癌基因和/或抑癌基因的表达，广泛参与肿瘤细胞增殖、凋亡、分化侵袭、迀移血管 生成等，与多种肿瘤的发生发展及预后关系密切。因此，有学者提出了"癌microRNA" (OncomiRs)的观点，即认为某些miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中充当了类似癌基因 的角色。
[0007] 血清中的含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法；又由于引物序 列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以直接利用，没有标注化的内参基因做参 照，故引物、反应体系及内参体系均需筛选及优化过程。目前针对miRNA的高通量筛查一般 采用芯片技术，成本高、特异性和灵敏度有限，且不能满足零散标本实时检测需求。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种检测快速方便，准确率高，无创伤，可以实现肝癌危险度 (预后)分级的检测试剂盒，以及提供miR-29a-3p和miR-192-5p联合使用作为肝癌血清分子 标记物的应用。
[0009] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：
[0010] 本发明的第一个方面，涉及一种肝癌预后标记物，本发明前期工作经过高通量深 度测序，筛选出了包含miR-29a-3p和miR-192-5p在内的表达差异明显的肝癌相关血清 miRNA表达谱，并且经定量PCR(qPCR)验证，最终确认血清miR-29a-3p和miR-192-5p是肝癌 危险度(预后)相关的肿瘤标志物。
[0011 ] 所述预后肝癌标记物为miR-29a_3p和miR-192_5p的组合，所述miR-29a_3p序列信 息如SEQIDN0.1所示;miR-192-5p序列信息如SEQIDN0.2所示。
[0012] 基于所述两种标记物组合的预后风险模型公式为：
[0013] Y = 2.19*AbCLC stage+1.45*BmiR-192-5p+l .81*CmiR-29a-3p;
[0014] ABac stage取值0或1，0代表为早期，1代表为晚期；
[0015] BmiR-192-5p取值0或1，0代表miR-192-5p为低表达，表达量2-^"〈2.24;1代表其为高 表达，表达量2-mgt2 2.24;
[0016] CmiR-29a-3p取值0或1，0代表miR-29a-3p为低表达，表达量2-m gt〈1.37; 1代表其为高 表达，表达量1.37;
[0017] 当Y值〈1.81时为患者生存风险低危，Y值>1.81时，患者为生存风险中高危。
[0018] 其中，所述表示为相应血清microRNA表达量，其计算方法属于本领域的公知 常识。
[0019] 本发明的第二个方面，涉及miR-29a-3p和miR-192-5p组合的应用，包括：
[0020] 在作为评估肝癌预后危险度的分子标记物的应用;或者
[0021] 在制备用于评估肝癌预后危险度的肝癌血清miRNA检测试剂盒的应用。
[0022]本发明的第三个方面，涉及一种用于评估肝癌预后危险度的肝癌血清miRNA检测 试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、qPCR反应体系和内参体系，该检测试剂盒包括用 于配制反转录反应体系的试剂、用于配制qPCR反应体系的试剂和用于配制内参体系的试 剂。其中：
[0023]用于配制反转录反应体系的试剂至少包括分别针对miR-29a-3p、miR-192-5p和线 虫cel-miR-39的特异性莖环法反转录引物液;还包括反转录酶液、dNTP混合液、核糖核酸酶 抑制剂液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。
[0024]优选的，所述特异性莖环法反转录引物液的商品名:Bulge-Loop?RT Primer，供应 商:ribobio，该特异性莖环法反转录引物液包括cel-miR-39特异性莖环法反转录引物液 (其引物套餐编号为miRQ0000010-1-l)、miR-29a-3p特异性茎环法反转录引物液(其引物套 餐编号为miRQ0000086-1-l)和miR-192-5p特异性茎环法反转录引物液(其引物套餐编号为 miRQ0000222-l_l);所述反转录酶液和反转录缓冲液的商品名：Reverse Transcriptase M-MLV，供应商：TaKaRa，商品号：Code No. 2641A;所述dNTP混合液的商品名：dNTP Mi xture， 供应商：TaKaRa，商品号:Code No. 4030;所述核糖核酸酶抑制剂液的商品名：Recombinant RNase Inhibitor，供应商：TaKaRa,商品号：Code Νο·2131Α。
[0025]所述反转录反应体系的总体积为25μ1;其中，优选的，总RNA样品2μ1、特异性莖环 法反转录引物液2μ1、反转录酶液0.5μ1、dNTP混合液2μ1、核糖核酸酶抑制剂液0.5μ1、反转 录缓冲液5μ1和无核酸酶纯水13μ1;所述总RNA样品中含有内参cel-miR-39液。
[0026]优选的，反转录前的总RNA样品的制备，是在抽提250μ1血清总RNA过程中加入的体 积为2μ1的内参cel-miR-39液，所述内参cel-miR-39液使用浓度为0.05ρηιο1/μ1。
[0027] 用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括分别针对miR-29a-3p、miR-192-5p和线虫 cel-miR-39的正向引物液和反向通用引物液;还包括SYBR Green混合液、R0X Reference Dye II液和纯水。
[0028] 优选的，所述SYBR Green混合液的商品名：SYBRS.Premix Ex Taq? II，供应商： TaKaRa，商品号：Code No · RR820A;所述正向引物液的商品名：Bulge-Loop? Forward Primer，供应商:ribobio,该正向引物液包括cel-miR-39正向引物液(其引物套餐编号为 miRQ0000010-1-l)、miR-29a-3p正向引物液（其引物套餐编号为miRQ0000086-1-l)和miR-192-5p正向引物液(其引物套餐编号为miRQ0000222-1-l);所述反向通用引物液的商品名： Bulge-Loop? ReversePrimer，供应商:ribobio，该反向通用引物液包括cel-miR-39反向通 用引物液(其引物套餐编号为miRQ0000010-1-l)、miR-29a-3p反向通用引物液(其引物套餐 编号为miRQ0000086-1-l)和miR-192-5p反向通用引物液(其引物套餐编号为miRQ0000222-1 _1) 〇
[0029] 本发明中的引物套餐编号为"miRQOOOOOlO-1-Γ的商品包括cel-miR-39的特异性 茎环法反转录引物液、正向引物液和反向通用引物液。本发明中的引物套餐编号为 "miRQ0000086-1-l"的商品包括miR-29a-3p的特异性茎环法反转录引物液、正向引物液和 反向通用引物液。本发明中的引物套餐编号为"miRQ0000222-1-l"的商品包括miR-192-5p 的特异性茎环法反转录引物液、正向引物液和反向通用引物液。
[0030] 所述qPCR反应体系的总体积为20μ1;其中，优选的，所述SYBR Green混合液的体积 是9μ1，所述正向引物液的体积是0.8μ1，所述反向通用引物液的体积是0.8μ1，所述R0X Reference