一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物和鉴别方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于分子生物学的泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物和鉴别方法，其特点是：设计了特定引物序列：上游引物序列为：5'-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3'(SEQ ID NO.1所示)；下游引物序列为：5'-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3'(SEQ ID NO.2所示)。鉴别方法：采用常规方法提取泥鳅或大鳞副泥鳅样品的DNA；进行PCR扩增；PCR扩增结束后，取适量扩增产物进行凝胶电泳检测，确定扩增片段大小，进行鉴别。鉴别方法准确、高效。本发明解决了传统的形态学区分法操作困难、分辨成功率低的问题。特别在仔、稚鱼阶段泥鳅和大鳞副泥鳅很难从外形上分辨，本发明可提供一种方便、准确的鉴别方法。
【专利说明】一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物和鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于分子生物学的泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物和鉴别方法，属于水产生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]大鱗副泥嫩(Paramisgurnusdabryanus)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，嫩科(Cobitidae), (Paramisgurnus)。泥嫩(Misgurnus angui I Iicaudatus)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鳅科(Cobitidae)，泥鳅属(Misgurnus)。大鳞副泥鳅与泥鳅近缘，外形相似且常同域存在，在我国淡水水域中分布极其广泛。在国内，大鳞副泥鳅和泥鳅均被视为滋补强身的佳品，市场需求缺口大，市场价格年年攀升。国际市场上，大鳞副泥鳅和泥鳅是中国传统的外贸出口商品，在日本、韩国和中国港澳台地区尤其受欢迎。大鳞副泥鳅比泥鳅具有更快的生长速度和更高的经济价值，所以广大养殖户更愿意选择养殖大鳞副泥鳅。但是这两种鱼在外形上很难区分，时常发生泥鳅苗种与大鳞副泥鳅苗种的混淆，并且有不法商贩以泥鳅苗种冒充大鳞副泥鳅苗种，造成养殖户的经济损失。国内外学者利用大鳞副泥鳅与泥鳅在外部形态的差别，建立了若干种区分两者的方法。但传统的形态学区分方法操作起来比较困难，尤其在仔、稚鱼阶段不易辨别。
【发明内容】
[0003]本发明针对目前现有基于形态学判别泥鳅和大鳞副泥鳅方法的不足，提供一种能够同时鉴别泥鳅和大鳞副泥鳅两个物种的鉴别引物以及鉴别方法。
[0004]随着分子标记的发展，如限制性片段长度多态性标记(RFLP)、扩增片段长度多态性标记(AFLP)和随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、微卫星标记(SSR)已经广泛应用于动植物的物种鉴别研宄中。线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)具有分子量小，拷贝数多等特点，已成为鱼类进化生物学和群体遗传学研宄的重要分子遗传标记。不同种生物在线粒体DNA上存在着一定的差异，利用这些差异序列，可快速准确进行种质鉴别。本发明利用大鳞副泥鳅和泥鳅线粒体DNA序列上的差异，设计一对鉴别特异性引物，利用PCR扩增的产物片段大小来区分这两种鱼，为鉴别大鳞副泥鳅和泥鳅提供更加准确的方法。
[0005]本发明提供一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物，包括上游引物和下游引物。上游引物的序列为:5’-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3’ (SEQ ID N0.1所示)；下游引物的序列为:5’ -TGGCATTTCATCAGGGGTG-3’ (SEQ ID N0.2 所示)。
[0006]本发明所采用的技术方案为:
[0007]一种利用上述引物进行泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别的方法，步骤如下:
[0008](I)采用常规方法提取泥鳅或大鳞副泥鳅样品的DNA ；
[0009](2)以步骤⑴所述方法得到的DNA为模板，以上述引物对DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0010](3)对步骤⑵获得的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有285bp的一条带时，该被测样品为泥鳅；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有214bp的一条带时，该被测样品为大鳞副泥鳅。
[0011]所述步骤(2) PCR扩增的反应体系为:总体积为25 μ L，反应体系中各成分浓度或含量为:PCR 缓冲液 1mmoI/L, dNTP 0.2mmol/L，Mg2+L 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L，下游引物10 ymol/L，DNA聚合酶1U,泥鳅或大鳞副泥鳅样品DNA20ng，余量为双蒸水。
[0012]所述步骤⑵中PCR扩增使用的PCR扩增程序为:94°C预变性5min ;然后30个循环，每个循环包括94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸60s ;最后在72°C下延伸8min。
[0013]本发明与现有技术相比的优点:
[0014]本发明所阐述的方法是首次基于线粒体DNA序列差异所建立的一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别新方法。本发明利用泥鳅和大鳞副泥鳅线粒体基因组中的差异，设计了一对特异性引物，利用在泥鳅和大鳞副泥鳅上PCR扩增产物大小的差异对这两种鱼进行鉴另O。利用本发明，能快速高效的对泥鳅和大鳞副泥鳅进行种质鉴别，解决了因为专业鱼类分类学知识和经验不足而造成物种误判的问题。本发明尤其适用于苗种阶段，也就是仔、稚鱼阶段泥鳅和大鳞副泥鳅的鉴别，为解决目前泥鳅和大鳞副泥鳅苗种市场的混乱局面提供一种准确快捷、客观公正的鉴别方法。本发明同时可用于研宄泥鳅和大鳞副泥鳅种群分布、资源评估等研宄。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为实施例二的泥鳅和大鳞副泥鳅样品PCR产物电泳检测结果，其中M为DNAladder (DL500)，Mal_Ma6为泥鳅样品，Pdl_Pd6为大鳞副泥鳅样品。
[0016]图2为实施例三的泥鳅和大鳞副泥鳅样品PCR产物电泳检测结果，其中M为DNAladder (DL2000)，Mal-15为泥鳅样品，Pdl-15为大鳞副泥鳅样品。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步阐述。
[0018]实施例一:本发明提供一对基于线粒体DNA序列差异的鉴别泥鳅和大鳞副泥鳅两个物种的引物，引物序列为:
[0019]上游引物:5’-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3’(SEQ ID N0.1 所示)；
[0020]下游引物:5’-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3’ (SEQ ID N0.2 所示)。
[0021]实施例二:
[0022]本发明提供一种基于实施例一所述引物鉴别泥鳅和大鳞副泥鳅的方法。本实施例中泥鳅样品采集于浙江舟山，大鳞副泥鳅样品采集于河北秦皇岛，根据传统形态学方法进行物种鉴别。按照常规酚/氯仿法进行DNA提取，将采集的样本置于400 μ L裂解液(NaC150mmol/L, Tris-Cl(pH = 8.0)30mmol/L，EDTA(pH8.0)lOOmmol/L,I % SDS,Proteinase K 200 μ g/mL)中，在50°C温育至澄清，之后使用等体积的饱和酸:氯仿:异戊醇(25: 24: I)抽提I遍，再用等体积异丙醇沉淀，再用0.4mL 75%乙醇清洗沉淀，之后用TE溶解，并在一 20°C保存备用。利用实施例一所述的引物对样品进行PCR扩增。PCR反应体系为 25 μ L，各种成分浓度为:PCR 缓冲液 10mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Mg2+L 5mmol/L，上游引物和下游引物各10 ymol/L，DNA聚合酶1U,泥鳅或大鳞副泥鳅样品DNA20ng，用双蒸水补足到25 μ Lo PCR反应程序为94°C预变性5min ;然后30个循环，每个循环包括94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸60s ;最后在72°C下延伸8min。
[0023]PCR反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察拍照。电泳结果显示，6尾形态学判定为泥鳅的样品均出现一条大小为285bp的条带；6尾形态学判定为大鳞副泥鳅的样品均出现一条大小为214bp的条带。本方法的鉴别结果与基于形态学判定的结果一致，证明本方法的可靠性。
[0024]实施例三:
[0025]如实施例二中所述的鉴别泥鳅和大鳞副泥鳅的方法，不同之处在于本实施例中的泥鳅和大鳞副泥鳅样品采集于辽宁盘锦，且PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色，扫描仪扫描记录。
[0026]结果显示，15尾形态学判定为泥鳅的样品均出现一条大小为285bp的条带；15尾形态学判定为大鳞副泥鳅的样品均出现一条大小为214bp的条带。本方法的鉴别结果与基于形态学判定的结果一致，证明本方法的可靠性。
[0027]本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的序列为:5’-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3’ ； 所述下游引物的序列为:5’-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3’。
2.一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别方法，其特征在于，鉴别步骤如下: (1)提取泥嫩或大鱗副泥嫩样品的DNA； (2)以步骤(I)中的DNA为模板，以所述引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物； (3)对步骤⑵获得的PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有285bp的一条带时，该被测样品为泥鳅；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有214bp的一条带时，该被测样品为大鳞副泥鳅。
3.如权利要求2所述的一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)PCR扩增的反应体系为:总体积为25 μ L，反应体系中各成分浓度或含量为:PCR缓冲液10mmol /T,, dNTP 0.2mmol/L, Mg2+L Smmol /I,,上游引物 10 μ mol/L，下游引物 10 μ mol/L，DNA聚合酶1U,泥鳅或大鳞副泥鳅样品DNA20ng，余量为双蒸水。
4.如权利要求2所述的一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增使用的PCR扩增程序为:94°C预变性5min ;然后30个循环，每个循环包括94°C变性45s，55°C退火45s，72°C延伸60s ;最后在72°C下延伸8min。
5.如权利要求2所述的一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述电泳分析采用2%琼脂糖凝胶电泳分析。
6.如权利要求2所述的一种泥鳅和大鳞副泥鳅种质鉴别方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述电泳分析采用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
【文档编号】C12N15/11GK104498604SQ201410775974
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】侯吉伦, 刘永富, 刘海金, 王桂兴, 张晓彦 申请人:中国水产科学研究院北戴河中心实验站