空间编码的生物学测定的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2011年4月5日，申请号为201180017696. 3,发明名称为"空 间编码的生物学测定"的申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2011年4月5日递交的美国专利申请第13/080,616号和2010年4 月5日递交的美国临时专利申请第61/321，124号的权益并被本文通过引用并入。
技术领域
[0004] 本发明涉及生物分子的测定，且更具体地涉及用于同时确定大量生物分子在固体 样品中的空间分布的测定。
【背景技术】
[0005] 在以下讨论中，将为了背景和介绍的目的描述某些制品和方法。本部分包含的任 何内容都不应被解释为"承认"是现有技术。申请人明确地保留在适当的时候，根据适用的 法律条文证实本文述及的制品和方法不构成现有技术的权利。
[0006] 全面的基因表达分析和蛋白质分析已成为理解生物学机制的有用工具。这些工 具的使用已促进参与发育和各种疾病例如癌症和自身免疫病的基因和蛋白质的鉴定。传 统方法例如不同转录物的原位杂交和其他多重检测已揭示出基因表达的空间模式并已帮 助阐明发育和疾病的分子基础。使得能够定量分析每个样品的许多RNA序列的其他技术 包括微阵列（参见，Shi,等人，Nature Biotechnology，24(9):1151_61(2006);及 Slonim 和 Yanai, Plos Computational Biology, 5(10): e100 0543 (2009));基因表达的系列分析 (SAGE)(参见 Velculescu,等人，Science, 270(5235) :484-87(1995))、qPCR 的高通量实 现（参见 Spurgeon,等人，Plos ONE, 3(2): el662 (2008))和原位 PCR(参见 Nuovo, Genome Res.，4:151-67 (1995))。尽管这些方法是有用的，但是它们不能在样品中的许多空间位置 同时测量许多基因的表达或多种蛋白质的存在和/或活性。激光捕获显微切割已允许在少 数位置分析许多基因，但是其非常昂贵、费力且不能很好地调整。虽然某些2D格式的PCR 测定保留了空间信息（参见Armani,等人，Lab on a Chip, 9 (24) :3526-34 (2009))，但是这 些方法具有低的空间分辨率，因为它们依赖于向孔中物理转移组织，这还阻止了随机接近 组织样品和高水平的多重检测（multiplexing)。
[0007]目前，不存在以高分辨率同时分析大量的基因、蛋白质或其他生物活性分子的空 间表达模式的运行方法。因此存在对组织中的生物分子的可重现的、高分辨率的空间图谱 的需要。本发明解决了该需要。
【发明内容】
[0008] 提供该概述以便以简化的方式介绍以下在详述中进一步描述的概念的节选。该概 述不旨在确定要求保护的主题的关键或必不可少的特征，也不旨在用来限制所要求保护的 主题的范围。从随后的包括在附图中示出并在所附权利要求中定义的那些方面的书面详述 中，所要求保护的主题的其他特征、细节、实用性和优点将是明显的。
[0009] 本发明包括提供组织中生物活性的高分辨率空间图谱的测定系统。该测定系统包 含能够高水平多重检测的测定，其中以指定的空间模式为生物样品提供编码探针；能够根 据该空间模式控制递送试剂的设备；和提供本质上为数字的读出的解码方案。简言之，本发 明提供了观看许多位置中的许多生物靶的能力，提供了以高度并行的测序数据分析对原位 杂交的分辨。
[0010]因此，在某些实施方式中，本发明提供了确定多种生物靶在样品中的多个位点的 丰度或活性或两者的空间模式的测定系统，其中该测定系统进行下列步骤：提供附着到支 持体的样品；以已知的空间模式将用于多种生物靶的编码探针递送到样品中的多个位点， 其中每个编码探针包含可与生物靶相互作用的探针区域和确定编码探针被递送的位点的 位置的代码标签（coding tag);促使编码探针与生物靶相互作用；将与生物靶相互作用的 编码探针和未与生物靶相互作用的编码探针分离；测定编码探针的序列的全部或一部分， 以及将多种生物靶的丰度或活性或两者与样品中的位点的位置相关联。
[0011] 在本发明特定的方面，生物靶包含核酸且编码探针是寡核苷酸，且在某些方面，对 于多种核酸靶中的每一种存在两种编码的探针。在某些方面，多种生物靶包含蛋白质，编码 探针的探针区域是蛋白质且代码标签包含寡核苷酸。在某些方面，多种生物靶包含酶。在 某些方面，编码探针的探针区域包含抗体、适体或小分子。
[0012] 在本发明特定的方面，所述生物靶可以是核酸且所述编码探针可以是寡核苷酸。 优选地，其中对于多种核酸靶中的每一种可存在两种编码探针。
[0013] 在本发明特定的方面，所述多种生物靶可以是蛋白质，所述编码探针的所述探针 区域可以是蛋白质且所述代码标签可包含寡核苷酸。优选地，其中所述多种生物靶可包含 酶。
[0014] 测定系统的某些方面还在分离步骤和测定步骤之间包含扩增步骤。在某些方 面，测定步骤通过核酸测序进行，且在优选的方面，测序是高通量数字核酸测序（high throughput digital sequencing)〇
[0015] 在本发明的某些方面，被测定的多种生物靶和样品中的多个位点的乘积大于20， 在某些方面，被测定的多种生物靶和样品中的多个位点的乘积大于50,在某些方面，被测 定的多种生物靶和样品中的多个位点的乘积大于75、100、150、500、750、1，000、5, 000、 10, 000、25, 000、50, 000、100, 000、500, 000 或 1，000, 000 或更大。在其他方面，并行测定 至少五万个编码探针的序列，在其他方面，并行测定至少十万个编码探针的序列，在某些方 面，并行测定至少五十万个编码探针的序列，且在某些方面，并行测定至少一百万、一千万、 一亿、十亿、一百亿、一千亿或更多个编码探针的序列。
[0016] 在某些方面，已知的空间模式通过样品的组织学特征确定。还在某些方面，软件程 控的硬件进行递送步骤、分离步骤、测定步骤和关联步骤中的至少两个步骤。
[0017] 在某些方面，编码探针的探针区域是蛋白质且分离步骤通过用亲和捕获剂捕获与 生物靶相互作用的编码探针实现。在某些方面，编码探针的探针区域是核酸且分离步骤通 过洗涤样品实现。
[0018] 在其他实施方式中，提供了测定多种核酸靶在样品中的多个位点的丰度或活性或 两者的空间模式的测定系统，其中该测定系统进行以下步骤：提供附着到支持体的样品； 以已知空间模式将用于多种核酸靶的寡核苷酸探针递送到样品中的多个位点；促使寡核苷 酸探针与核酸靶杂交；从样品中洗掉未杂交的编码寡核苷酸探针；根据已知空间模式将一 种或多种编码剂（encoding agent)递送到样品中的多个位点的位置，其中递送到每个位点 的编码剂的组合是不同的；将编码剂和寡核苷酸探针偶联以形成编码探针；使用高通量测 序测定编码探针的序列的全部或一部分，以及将多种生物靶的丰度或活性或两者与样品中 多个位点的位置相关联。
[0019] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于20。
[0020] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于50。
[0021] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于75。
[0022] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于 10, 000。
[0023] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于 100, 000〇
[0024] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于 1，000, 000〇
[0025] 在某些方面，至少十万个编码探针的序列可被并行测定。
[0026] 在某些方面，至少一百万个编码探针的序列可被并行测定。
[0027] 在某些方面，对于所述多种核酸靶中的每一种可递送两种寡核苷酸探针。
[0028] 在某些方面，所述偶联步骤可通过连接进行。
[0029] 在某些方面，所述偶联步骤可通过延伸然后连接进行。
[0030] 在某些方面，还可在所述偶联步骤和所述测定步骤之间包含扩增步骤。
[0031] 本发明的其他实施方式提供了测定多种蛋白质靶在样品中的多个位点的丰度或 活性或两者的空间模式的测定系统，其中该测定系统进行以下步骤：提供附着到支持体的 样品；以已知空间模式将用于多种蛋白质靶的编码探针递送到样品中的多个位点，其中每 个编码探针包含可与蛋白质靶相互作用的蛋白质探针区域和确定编码探针被递送的位点 的位置的代码标签，且代码标签是编码探针的蛋白质探针区域的一部分；促使编码探针与 蛋白质靶相互作用；将与蛋白质靶相互作用的编码探针和未与蛋白质靶相互作用的编码探 针分离；通过高通量测序测定编码探针的序列的全部或一部分，以及将多种蛋白质靶的丰 度或活性或两者与样品中的多个位点的位置相关联。
[0032] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于20。
[0033] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于50。
[0034] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于75。
[0035] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于 IOOo
[0036] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于 500。
[0037] 在某些方面，被测定的所述多种生物靶与所述样品中的所述多个位点的乘积可大 于 1000。
[0038] 在某些方面，至少一万个编码探针的序列可被并行测定。
[0039] 在某些方面，至少十万个编码探针的序列可被并行测定。
[0040] 在某些方面，至少一百万个编码探针的序列可被并行测定。
[0041] 在某些方面，还可在所述偶联步骤和所述测定步骤之间包含扩增步骤。
[0042] 在某些方面，所述蛋白质靶可以是酶，且所述编码探针的所述探针区域可以是酶 的底物、推定底物或两者。
[0043] 在某些方面，所述编码探针的所述探针区域可以是亲和捕获剂。优选地，所述编码 探针的所述探针区域可以是抗体。优选地，所述编码探针的所述探针区域可以是适体。
[0044] 在某些方面，将与所述蛋白质靶相互作用的编码探针和未与所述蛋白质靶相互作 用的编码探针分离可通过亲和捕获剂实现，所述亲和捕获剂区分与所述蛋白质靶相互作用 的编码探针和未与所述蛋白质靶相互作用的编码探针。
[0045] 在某些方面，所述代码标签可以是寡核苷酸。
[0046] 其他实施方式提供了测定多种生物靶在样品中的多个位点的丰度或活性或两者 的空间模式的测定系统，其中该测定系统进行以下步骤：提供附着到支持体的样品；以已 知空间模式将用于多种生物靶的编码探针递送到样品中的多个位点，其中每个编码探针包 含可与生物靶相互作用的探针区域和确定编码探针被递送的位点的位置并鉴定生物靶的 代码标签；促使编码探针与生物靶相互作用；测定编码探针的序列的全部或一部分，以及 将多种生物靶的丰度或活性或两者与样品中位点的位置相关联。
[0047] 基于待检测的分子和该检测系统所需要的试剂，本发明的测定系统可采用多种检 测机制。以下更详细地描述了可用于本发明的测定系统的示例性的方法。
【附图说明】
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