专利名称：一种测定维生素h的生物学检测方法
技术领域：
本发明涉及一种测定维生素H的生物学检测方法。
背景技术：
维生素H，又称生物素，是人体不可缺少的营养物质，常被用作医药及食品添加剂等。随着人们对维生素H生理功能的认识，维生素H已广泛地用于畜牧业生产和研究中，来提高家禽的生产性能和饲料利用率。此外，维生素H还应用在非放射性标记技术及发酵工业等领域。目前检测维生素H的方法主要有微生物法、高效液相色谱、荧光法和酶联免疫法等。报道的微生物法有比浊法和滤纸片法。但是现有的检测结果来看，其检测结果准确度和灵敏度不令人满意，误差大，并且需要庞大的仪器和设备。而管碟法则操作简单，不需要昂贵的食品，但其一般常用于抗生素类物质的检测，而在维生素H含量检测方面还未有报道。
发明内容
本发明提供一种操作简单，准确度和灵敏度高，不需要昂贵的检测仪器的一种测定维生素H的生物学检测方法，为了实现该技术目的，技术方案如下一种测定维生素H含量的生物检测方法，包含以下步骤a.配制指示菌悬液；b.在培养皿中加入步骤a中配制好的指示菌悬液，将若干个浓度已知的维生素H 的标准溶液放入培养皿中，培养一定时间后，测量出指示菌生长圈的生长直径，绘制出维生素H的浓度的对数与指示菌生长直径的标准曲线并计算出回归方程；c.将未知浓度的维生素H的溶液经过a b的步骤处理后得出的指示菌生长直径代入步骤b中的标准曲线，查出未知浓度的维生素H的浓度，或通过回归方程计算。如上所述的测定维生素H含量的生物检测方法，其中步骤a中的配制指示菌悬液的步骤为取产氨短杆菌保藏斜面，接种至新鲜牛肉膏蛋白胨培养基斜面，30°C培养18 20h,连续活化2 3次后，用无菌生理盐水洗下菌苔，并适当稀释，使菌悬液在600nm波长处的吸光度为1.5左右。如上所述的测定维生素H含量的生物检测方法，其中在步骤b中的已知浓度的维生素 H 的标准溶液分别为 15 μ g/L、30 μ g/L、45 μ g/L、60 μ g/L、75 μ g/L、90 μ g/L、105 μ g/ L、120 μ g/L、135 μ g/L的9个浓度维生素H标准溶液。如上所述的测定维生素H含量的生物检测方法，其中步骤b中培养指示菌的步骤为在90mm的无菌培养皿中先加入20mL下层培养基，凝固后再加入5mL含适量指示菌液的上层培养基，在凝固的培养基平板上等距离均勻放置4个牛津杯，在平板相对的2个牛津杯中各加入标记为中心浓度的75 μ g/L的维生素H标准液，另外2个加入其它一种浓度的维生素H标准液，加样量均为200 μ L，所述的9种维生素H标准液，每个浓度1式3皿，30°C培养48h，分别计算全部培养皿中心浓度生长圈平均直径，每种浓度标准液培养皿中心浓度生长圈的平均直径及其各自浓度标准液生长圈的平均直径，全部培养皿中心浓度生长圈平均
3直径与每种浓度标准液培养皿中心浓度生长圈的平均直径之差与各自浓度标准液生长圈的平均直径之和是标准曲线方程中的指示菌生长圈的生长直径。如上所述的测定维生素H含量的生物检测方法，其中所述的下层培养基组成为 葡萄糖 1. Og/mL,硫酸胺 0. 4/mL,尿素 0. 1/mL, K2HPO4O. 13/mL, MgSO4O. 03/mL,琼脂 2/mL， ZnCl28mg/L, VB15mg/L, D-泛酸钙 lOmg/L, pH7. 2 7. 4。如上所述的测定维生素H含量的生物检测方法，其中在步骤b中加入的上层指示菌与下层培养基的体积比为8%。本方法灵敏度和准确度较高，RSD4. 984% 7. 573%，结果较好，可以满足一般检测维生素H浓度需要。且该方法简便快速，无需大型仪器便于推广应用。
图1为生物素浓度对数值与生长圈直径之间的线性曲线。
具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释。本具体实施例中使用的材料或试剂来源如下(一)材料供试菌种产氨短杆菌(Corynebcterium ammoniagenes) 1. 0925，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。培养基产氨短杆菌采用牛肉膏蛋白胨培养基。检测平板采用合成培养基。下层培养基(g/dL)葡萄糖 1. 0，硫酸胺 0. 4，尿素 0. 1，K2HPO4O. 13，MgSO4O. 03，琼脂 2，ZnCl28mg/ L，VB^mg/L, D-泛酸钙10mg/L, ρΗ7· 2 7. 4。上层培养基除琼脂1. 4g/dL含量外，其余成分同下层培养基。(二)试剂D_维生素H标准品(上海三杰生物技术有限公司)；琼脂为日本进口分装(上海思吉生物制品有限公司)；Vbi (BR，上海伯奥生物科技有限公司)；D-泛酸钙(BR， 中国医药集团上海化学试剂公司)；其余均为分析纯试剂。主要仪器设备生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；756型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，Icm比色皿；生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；数显恒温水浴锅(上海申腾生物技术有限公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；手提式压力蒸气灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司)。检测实施例一 . (1)指示菌悬液的制备取产氨短杆菌保藏斜面，接种至新鲜牛肉膏蛋白胨培养基斜面，30°C培养18 20h。连续活化2 3次后，用无菌生理盐水洗下菌苔，并适当稀释，使菌悬液在600nm波长处的吸光度为1. 5左右。(2)维生素H标准液的制备取维生素H标准品适量，精确称量，用蒸馏水稀释制备 15、30、45、60、75、90、105、120、135μ g/L 的 9 个浓度维生素 H 标准溶液。二 .标准曲线制作(1)在90mm的无菌培养皿中先加入20mL下层培养基，凝固后再加入5mL含适量指示菌液的上层培养基。在凝固的培养基平板上等距离均勻放置4个牛津杯，在平板相对的2个牛津杯中各加入75 μ g/L的维生素H标准液(中心浓度)，另外2个加入其它一种浓度的维生素H标准液，加样量均为200L。步骤一中所述的9种维生素H 标准液，每个浓度1式3皿，30°C培养48h。①测定维生素H时，在双层平板的上层培养基中加入菌悬液的量会影响生长圈的大小和质量，为了确定培养基中指示菌液的加入量，按步骤一中的指示菌液制备方法制作的菌悬液，分别以4 %、6 %、8 %、10 %和12 %的体积比加入上层培养基中，按1. 2. 3标准曲线制作方法制作培养皿，培养结果见表1。由表1可见菌浓度为8%以上时，指示菌生长较密，生长圈清晰，因此本实验确定菌液加入量为8%。表一菌悬液加量对生长圈生长情况的影响
悬菌液加量/%平板生长圈生长情况、4模糊6较清晰8清晰10清晰12清晰由表可以看出菌浓度为8%以上时，指示菌生长较密，生长圈清晰，因此本实验确定菌液加入量为8%。(2)测量指示菌生长圈直径大小，分别计算全部培养皿中心浓度生长圈平均直径 (T)，每种浓度标准液培养皿中心浓度生长圈的平均直径Ui)及其各自浓度标准液生长圈的平均直径4。为减少不同培养皿及不同批次检测的误差，各浓度维生素H标准液生长圈的平均直径Cli需要进行修正，修正直径Di的计算方法为Di = ‘+(Τ-、)。以维生素H浓度的对数值为横坐标，生长圈平均修正直径为纵坐标绘制标准曲线。(3)根据步骤二 .(1)标准曲线制作中的方法，得到标准曲线如图1所示。由图1 可见，除最后2点(即120和135 μ g/L两点)有所偏离外，其余各点浓度基本成直线关系。 当标准曲线的维生素H浓度取值范围分别为15 90 μ g/L、15 105 μ g/L、15 120 μ g/ L、15 135 μ g/L,得到的各回归方程见表2。由图1和表2可见，降低维生素H上限浓度， 缩小维生素H检测范围，可提高可信限率和r的值。当维生素H浓度范围取15 90 μ g/L 时，得到剂量浓度(C)的对数与生长圈直径(D)线性关系较良好，因此本具体实施例确定维生素H浓度范围取15 90 μ g/L，其线性方程为D = 16. 3281ogC_9. 8654, r = 0. 9933。表二 不同的线性范围和回归系数
权利要求
1.一种测定维生素H含量的生物检测方法，包含以下步骤a.配制指示菌悬液；b.在培养皿中加入步骤a中配制好的指示菌悬液，将若干个浓度已知的维生素H的标准溶液放入培养皿中，培养一定时间后，测量出指示菌生长圈的生长直径，绘制出维生素H 的浓度的对数与指示菌生长直径的标准曲线并计算出回归方程；c.将未知浓度的维生素H的溶液经过a b的步骤处理后得出的指示菌生长直径代入步骤b中的标准曲线，查出未知浓度的维生素H的浓度，或通过回归方程计算。
2.如权利要求1所述的测定维生素H含量的生物检测方法，特征在于，步骤a中的配制指示菌悬液的步骤为取产氨短杆菌保藏斜面，接种至新鲜牛肉膏蛋白胨培养基斜面，30°C 培养18 20h，连续活化2 3次后，用无菌生理盐水洗下菌苔，并适当稀释，使菌悬液在 600nm波长处的吸光度为士 1.5。
3.如权利要求1所述的测定维生素H含量的生物检测方法，特征在于在步骤b中的已知浓度的维生素H的标准溶液分别为15 μ g/L,30 μ g/L,45 μ g/L,60 μ g/L,75 μ g/L, 90 μ g/L、105 μ g/L、120 μ g/L、135 μ g/L的9个浓度维生素H标准溶液。
4.如权利要求1所述的测定维生素H含量的生物检测方法，特征在于，步骤b中培养指示菌的步骤为在90mm的无菌培养皿中先加入20mL下层培养基，凝固后再加入5mL含适量指示菌液的上层培养基，在凝固的培养基平板上等距离均勻放置4个牛津杯，在平板相对的2个牛津杯中各加入标记为中心浓度的75 μ g/L的维生素H标准液，另外2个加入其它一种浓度的维生素H标准液，加样量均为200 μ L，所述的9种维生素H标准液，每个浓度 1式3皿，30°C培养48h，分别计算全部培养皿中心浓度生长圈平均直径，每种浓度标准液培养皿中心浓度生长圈的平均直径及其各自浓度标准液生长圈的平均直径，全部培养皿中心浓度生长圈平均直径与每种浓度标准液培养皿中心浓度生长圈的平均直径之差与各自浓度标准液生长圈的平均直径之和是标准曲线方程中的指示菌生长圈的生长直径。
5.如权利要求4所述的测定维生素H含量的生物检测方法，特征在于，所述的下层培养基组成为葡萄糖 1. Og/mL，硫酸胺 0. 4/mL，尿素 0. 1/mL，K2HPO4O. 13/mL，MgSO4O. 03/mL，琼脂 2/mL, ZnCl28mg/L, VB^mg/L, D-泛酸钙 lOmg/L, ρΗ7· 2 7· 4。
6.如权利要求1所述的测定维生素H含量的生物检测方法，特征在于在步骤b中加入的上层指示菌与下层培养基的体积比为8%。
全文摘要
本发明涉及一种测定维生素H的生物学检测方法，通过维生素H浓度的对数值与生长圈直径的线性关系，建立一种快速简便检测维生素H含量的方法。本方法可以为微生物法检测维生素H含量提供一种新的选择，并且灵敏度和准确度较高，RSD4.984％～7.573％，检测结果可以满足一般检测维生素H浓度需要，该方法简便快速，无需大型仪器便于推广应用。
文档编号C12Q1/02GK102399849SQ20101027744
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者丁国才 申请人:上海海帝园艺有限公司