专利名称：一种新型分离宫颈脱落细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离宫颈脱落细胞的方法。
背景技术：
宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，居女性恶性肿瘤的第二 位，其死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。近年来，宫颈癌患者以每年2% 4%的速度增长，与 此同时，相对于发达国家，在发展中国家，由于宫颈筛查工作不完善，宫颈癌的发病率是发 达国家的6倍，并且其中80%的患者确诊时已是浸润癌，而宫颈癌存在着一个较长的可逆 转癌前病变期，所以早期发现癌前病变进行干预治疗是防治宫颈癌的关键。现阶段筛查宫颈癌的主要方法包括宫颈刮片脱落细胞学检查、宫颈上皮液基细胞 学检查等，但也存在一定的局限性，在上述两种细胞学检查中，涂片内所见的癌前病变是从 良性到恶性的一个渐变阶段的综合征象，包括1、宫颈涂片内的角化细胞数目持续增多，涂 片的细胞呈雌激素持续影响的现象，角化程度相当于周期中期排卵前的最高水平；2、有异 型的或早熟的角化细胞；3、细胞巨大，或细胞细小；4、核异常巨大，活跃而不成熟，核染色 质浓染，胞浆内常有颗粒；5、有各层鳞状上皮细胞的核分叶与多核；6、底层细胞增生，核周 常有晕；7、严重的储备细胞增生。目前临床上采用的较为广泛的宫颈上皮液基细胞学检查在标本程序化的处理过 程中，细胞只经过一次分离处理就直接进入制片步骤，虽然也在一定程度上分离了粘液、血 细胞、炎性细胞等，但制片后，镜下仍可见部分粘液，尤其是炎性的中性粒细胞，影响异常细 胞的检出率，假阴性、假阳性以及不满意涂片率较高，不能为临床提供较为准确的辅助诊断
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发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种新型分离宫颈脱落细 胞的方法，以期提高制成涂片的质量，帮助检验医师得出准确结论，以及辅助临床医师的诊 断。本发明解决技术问题采用如下技术方案
本发明分离宫颈脱落细胞的方法的特点是按如下步骤操作
a、取宫颈脱落细胞于PBS磷酸缓冲液中，涡旋混勻得细胞悬液；
b、将步骤a所得细胞悬液加入粘液分离液中；经离心、弃上清液后再次加入PBS磷酸缓 冲液，重悬沉淀物，得到重悬的细胞悬液；
C、将步骤b所得重悬的细胞悬液加入中性粒细胞分离液Ficoll中，经离心、弃上清液， 所得沉淀物即为纯净细胞。本发明分离宫颈脱落细胞的方法的特点也在于
所述步骤a中的PBS磷酸缓冲液的体积百分比浓度为10%，用量为5ml ； 所述步骤b中的粘液分离液用量为3ml ；用于重悬沉淀物的PBS磷酸缓冲液按体积百
3分比的浓度为10%，用量为3ml ；
所述步骤c中的中性粒细胞分离液Ficoll的用量为3ml。本发明分离宫颈脱落细胞的方法的特点还在于
所述步骤b中离心的条件为100-4000g，时间为10秒-10分钟；所述步骤c中的离心 条件为200-10000g，时间为10-30分钟。所述步骤b中离心的条件为200g，时间为2分钟；所述步骤c中的离心条件为 2000g，时间为20分钟。所述各步骤均在常温下进行。与已有技术相比，本发明有益效果体现在
1、本发明通过两步法分离纯化细胞，大大提高了制成涂片的质量，提高临床宫颈脱落 细胞标本分离的清晰度；
2、本发明方法适合于大规模的细胞分离，其效果稳定、可靠；
3、以本发明方法分离的细胞可以直接用于基因组提取、核型分析、细胞培养、细胞转基 因、细胞诱导分化、细胞治疗等研究，同时也可用于密度梯度分离液制备、不同质量分子或 化合物的分离等用途；
4、本发明方法在细胞生物学、功能基因组学、临床治疗等领域中具有较高的实际应用 价值，市场前景广阔；尤其为子宫颈癌癌前病变的初筛以及防治提供有力的指导意义，临床 价值深远。
图la、图Ib为使用常规液基细胞学技术LCT制备的宫颈脱落细胞形态学标本； 图2a、图2b为用本发明方法制备的宫颈脱落细胞形态学标本；
图3为利用本发明方法分离出的人子宫颈脱落细胞在体外培养时的图片。
具体实施例方式本实施例中的分离宫颈脱落细胞的方法按如下步骤操作
1、使用宫颈脱落细胞专用刷，刷头轻压于宫颈口，顺同一方向旋转2-3圈，以此刷取宫 颈脱落细胞，将刷取物置于5ml的体积百分比浓度为10%的PBS磷酸缓冲液中，涡旋混勻得 细胞悬液；
2、将步骤1所得细胞悬液沿管壁加入3ml的粘液分离液中；经离心、弃上清液后，向离 心后的沉淀物中加入3ml体积百分比浓度为10%的PBS磷酸缓冲液，重悬沉淀物，得到重悬 的细胞悬液；
3、将步骤2所得重悬的细胞悬液沿管壁加入3ml中性粒细胞分离液Ficoll中，经离 心、弃上清液，离心后的沉淀物即为所得的纯净细胞。以上各步骤均在常温下进行；步骤2中离心的条件为100-4000g，优先为 200g;离心时间为10秒-10分钟，优选的离心时间是2分钟；步骤3中的离心条件为 200-10000g，优选为2000g，离心时间为10-30分钟，优选的离心时间为20分钟，所用的粘液 分离液及Ficoll液均为市售的细胞分离液。使用本实施例方法，在七天的时间内完成对将近210对宫颈脱落细胞标本的分离操作，95%以上的粘液、血液和中性粒细胞等混杂成分可被分离除去，获得了满意的效果。图la、lb为使用常规液基细胞学技术LCT制备的宫颈脱落细胞形态学标本，脱落 细胞被较多的中性粒细胞掩盖，使阅片清晰度下降；由图Ia和图Ib两图相比，可见由常规 液基细胞学技术LCT制出的标本效果不稳定。图2a、图2b为用本发明方法制备的宫颈脱落细胞形态学标本，粘液、血液以及中 性粒细胞的分离清除率达到95%以上，且效果稳定可靠。对本实施例分离所得的子宫颈鳞状上皮细胞用常规的方法(即BSA-DMEM培养液+ 青霉素、链霉素10万U/ml+2. 5 μ g/ml两性霉素B)进行原代培养，在细胞铺板后一天用显 微镜观察，观察结果如图3所示。观察结果显示细胞在分离后生长状态良好，形态学上具有 完整性，使宫颈脱落细胞标本中存在的粘液、血液以及中性粒细胞得到有效的去除，增加原 代培养的纯净度，提高后续实验的质量。
权利要求
一种新型分离宫颈脱落细胞的方法，其特征是按如下步骤操作a、取宫颈脱落细胞于PBS磷酸缓冲液中，涡旋混匀得细胞悬液；b、将步骤a所得细胞悬液加入粘液分离液中；经离心、弃上清液后再次加入PBS磷酸缓冲液，重悬沉淀物，得到重悬的细胞悬液；c、将步骤b所得重悬的细胞悬液加入中性粒细胞分离液Ficoll中，经离心、弃上清液，所得沉淀物即为纯净细胞。
2.根据权利要求1所述的分离宫颈脱落细胞的方法，其特征是所述步骤a中的PBS磷酸缓冲液的体积百分比浓度为10%，用量为5ml ；所述步骤b中的粘液分离液用量为3ml ；用于重悬沉淀物的PBS磷酸缓冲液按体积百 分比的浓度为10%，用量为3ml ；所述步骤c中的中性粒细胞分离液Ficoll的用量为3ml。
3.根据权利要求1所述的分离宫颈脱落细胞的方法，其特征是所述步骤b中离心的条 件为:100-4000g,时间为10秒-10分钟；所述步骤c中的离心条件为:200-10000g,时间为 10-30分钟。
4.根据权利要求3所述的分离宫颈脱落细胞的方法，其特征是所述步骤b中离心的条 件为200g，时间为2分钟；所述步骤c中的离心条件为2000g，时间为20分钟。
5.根据权利要求1所述的分离宫颈脱落细胞的方法，其特征是所述各步骤均在常温下 进行。
全文摘要
本发明公开了一种新型分离宫颈脱落细胞的方法，其特征是首先取宫颈脱落细胞于PBS磷酸缓冲液中，涡旋混匀得细胞悬液；将细胞悬液加入粘液分离液中；经离心、弃上清液后再次加入PBS磷酸缓冲液，重悬沉淀物，得到重悬的细胞悬液；将重悬的细胞悬液加入中性粒细胞分离液Ficoll中，经离心、弃上清液，得离心后的沉淀物即为纯净细胞。本发明方法极大地纯化了临床提取的宫颈脱落细胞标本，操作步骤简便，适合于大规模的细胞分离，效果稳定、可靠，可以得到高纯度的目的细胞，具有较高的实际应用价值，市场前景广阔。
文档编号C12N5/071GK101914486SQ20101027686
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者冯定庆, 凌斌, 卫莹, 周颖, 姚凤球, 朱园园, 朱靖, 李彩荣, 李敏, 沈国栋, 王青元, 许乾乾, 雷蕾 申请人:安徽省立医院