专利名称：一种利用实验室饲养的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊菌的方法
技术领域：
本发明涉及了一种培养蜜蜂球囊菌的方法，更具体地涉及了一种利用实验室饲养 的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊菌的方法。
背景技术：
白垩病是一种蜜蜂真菌性疾病，它是由蜜蜂球囊菌引起的。该病原菌主要是在幼虫期 伴随着蜜蜂的食物一起进入蜜蜂幼虫的消化道内，在整个幼虫期基本不会蜜蜂发病，只是 在幼虫发育完全之后，进入蛹期开始，菌丝迅速在蜜蜂幼虫体内生长，充斥整个蜜蜂幼虫体 内，导致蜜蜂死亡，形成的菌丝最后突破蜜蜂的表皮，在蜜蜂体内、体外形成包囊，内含数量 众多的孢子，一般每只蜜蜂幼虫可形成IO9个孢子，这些孢子又可作为下一轮侵染其他蜜蜂 幼虫的病原开始新一轮的侵染过程。在自然情况下，这些蜜蜂球囊菌的孢子可以存活几十 年，蜂群内蜜蜂个体之间存在着非常密切的交互哺育的生物学特性，哺育蜂饲喂蜜蜂的幼 虫，成年蜜蜂之间的相互饲喂等等，蜜蜂球囊菌孢子伴随这一过程迅速在蜂群内所有的蜜 蜂个体内传播。在一个蜂场内不同的蜂群之间因蜂农常规的蜂群管理措施以及蜜蜂的谜巢 等行为导致蜜蜂球囊菌孢子在不同的蜂群之间传播。同时，又因蜜蜂的转地放蜂等养蜂生 产活动，可促进蜜蜂白垩病在更大的地域范围内传播和流行。虽然蜜蜂球囊菌对成年蜜蜂 的危害不大，但球囊菌的孢子通过饲料和成年蜜蜂哺育喂食蜜蜂幼虫时传染给蜜蜂幼虫， 严重危害时，导致蜜蜂幼虫的大量死亡，使得蜂群不能够发展壮大，其生产蜂产品的能力和 在农业中的授粉效能无法发挥，给养蜂业打来沉重的打击。鉴于此，过去数十年来，为应对蜜蜂球囊菌的危害，科技工作者和蜂农开展多种多 样的防治工作，世界范围内，包括一些改善了的养蜂管理措施、多种多样的化学药物、植物 源抑菌剂的开发利用、新型抗生素等等方法应用于蜜蜂球囊菌的防治，但由于种种原因，至 今还没有有效防控蜜蜂白垩病危害的技术与方法。因此，业界还需加大科研的力度，探究蜜 蜂球囊菌流行和侵染蜜蜂的途径，寻找其致病过程中可以利用的环节，开发可以有效控制 球囊菌生长的技术和方法。为研究蜜蜂球囊菌及其侵染蜜蜂的过程和途径，球囊菌的培养是必不可少的一项 工作。过去的养蜂和研究实践中，已经开发形成了一些可以有效培养蜜蜂球囊菌的方法。比 如，自然情况下，球囊菌就可以侵染蜜蜂，我们可以从蜂群中收集染病的蜜蜂幼虫及生长的 球囊菌，但这种培养的球囊菌是以饲养的蜂群为对象，我们无法控制蜜蜂幼虫是否摄入、哪 个日龄的蜜蜂摄入以及摄入球囊菌孢子的数量等等，受多种不可控条件的制约。因此蜂群 内球囊菌的感染和生长过程无法控制，给相关的研究带来困难。针对蜜蜂球囊菌生长的特点，目前已经有利用培养基进行体外培养的技术与方法 (Appl. Envir. Microbiol. , Jul 1987; 53: 1679 - 1684;)，为蜜蜂球囊菌相关生物学 的研究做了很多工作。但这些体外的球囊菌培养方法与其在蜜蜂体内的生长情况还是不一 样的。由于培养基质的不同，球囊菌的生长特性是不一样的。尤其对于研究工作来讲，需要 了解球囊菌在蜜蜂体内萌发、生长和侵染的各个环节，一般蜂群接种培养的方法对球囊菌 的进入蜜蜂体内的时间和进程无法控制，而利用各种培养基进行培养的方式不是在蜜蜂体内，不能代表侵染蜜蜂的生理过程，因而都不能满足工作的需要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种利用实验室饲养的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊 菌的方法，具有重要的科学意义。本发明利用实验室饲养的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊菌的方法，包括以下步骤
(1)蜜蜂幼虫的实验室饲养
利用24孔板来饲喂蜜蜂的幼虫直至蜜蜂幼虫发育完全；培养箱培育条件温度为 34. 5°C，湿度彡80% ；化蛹后，用滤纸吸干体表的饲料后，置入垫有滤纸的24孔板内完成蛹 期的发育；
(2)接种孢子的准备
接种用的孢子来自于患病蜂群的染病幼虫，采集这些形成孢子的染病幼虫，用勻浆器 磨碎幼虫，移至加有灭菌水的烧杯内，加玻璃珠，搅拌4小时以上，制备成接种用的孢子母 液；
(3)接种:
将准备好的孢子母液加入调配好的蜜蜂幼虫的饲料内，使孢子终浓度为IO4-IO6个/毫 升；接种的对象为第3-5日龄的蜜蜂幼虫；接种方法为在给第3-5日龄的蜜蜂幼虫更换饲 料时，将混有孢子的饲料饲喂蜜蜂24小时，随后就转为正常的没有孢子的饲料饲喂；
(4)低温处理
接种时采用30°C处理4个小时的低温处理，之后转入正常的培养箱内进行饲养。其中所述饲喂蜜蜂幼虫的饲料配方按重量比为蜂王浆50%，无菌水37%，蜂蜜12%， 酵母浸膏1% ；所述蜜蜂幼虫的实验室饲养具体方法为从蜂箱内移取2日龄的蜜蜂幼虫至 盛有蜜蜂幼虫饲料的24孔板内，置于培养箱内培养，以后每24小时，重新制备一份加有饲 料的24孔板且把蜜蜂幼虫移入，放入培养箱直至蜜蜂幼虫发育完全。所述接种时，接种的对象优选为第四日龄的蜜蜂幼虫；接种方法为在给第四日 龄蜜蜂幼虫更换饲料时，将混有孢子的饲料饲喂蜜蜂24小时，第五日龄及随后就转为正常 的没有孢子的饲料饲喂。本发明的显著优点
1.本发明在实验室内饲养蜜蜂幼虫的方法，该方法可以让我们
不依赖于蜂群，在实验室内开展蜜蜂幼虫的饲喂工作。2.蜜蜂染白垩病幼虫体内形成了大量的包囊和孢子，其分 布是不均勻的，为保证孢子的均一和饲喂蜜蜂后每只蜜蜂的摄入量一致，要制备分散良好 的球囊菌孢子悬浮液。本发明提供了一种制备接种用蜜蜂球囊菌孢子的方法。3.本发明提供了一种给蜜蜂幼虫接种蜜蜂球囊菌孢子的 安全有效方法。自然情况下，蜜蜂球囊菌对蜜蜂幼虫的感染就是通过污染了的食物进入蜜 蜂体内的。本发明利用这一特性，将球囊菌孢子混入蜜蜂的饲料内，通过蜜蜂自身的取食行 为自动摄入球囊菌孢子，省力、有效。4.本发明提供了一种为便于球囊菌生长而采取的对蜜蜂 幼虫的处理方法。本发明中在蜜蜂幼虫接种球囊菌孢子后，进行适当的低温处理，大大促进
4了球囊菌的生长速度和效率。
图1为在实验室利用24孔板饲养的不同发育时期的蜜蜂幼虫；其中A、B、C、D、E 分别表示第3、4、5、6日龄和刚化蛹的蜜蜂幼虫。图2为用实验室饲养蜜蜂幼虫培养的蜜蜂球囊菌。
具体实施例方式
本发明利用实验室饲养的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊菌的方法，包括以下步骤 蜜蜂幼虫的实验室饲养
实验室内利用24孔板来饲喂蜜蜂的幼虫。饲料配方为蜂王浆占50%，无菌水37%，蜂蜜 12%，酵母浸膏1%。培育条件温度为34. 5°C，湿度>80%。具体操作方法为按配方调制能 够完成一次发育的蜜蜂的人工饲料量，按蜜蜂日龄的大小加适量饲料到24孔板内，剩余饲 料至于冰箱内保存。从蜂箱内移取2日龄的蜜蜂幼虫至盛有饲料的24孔板内，置于培养箱 内培养，以后每24小时，重新制备一份加有饲料的24孔板且把蜜蜂幼虫移入，放入培养箱 直至蜜蜂幼虫发育完全，化蛹后，用滤纸吸干体表的饲料后，置入垫有3层滤纸的24孔板内 完成蛹期的发育，具体培养的各日龄蜜蜂幼虫见图1，可见各日龄的蜜蜂幼虫均能正常生长 发育并化蛹。利用这种方法培养的蜜蜂幼虫都能够正常发育，与在蜂箱内哺育的蜜蜂幼虫 发育情况基本一致。在此基础上可以开展许多以蜜蜂幼虫为对象的活体实验，避免了蜂群 内诸多不可控制因素的制约。接种孢子的准备
接种用的孢子来自于患病蜂群的染病幼虫，采集这些形成孢子的染病幼虫，用勻浆器 磨碎幼虫，移至加适量灭菌水的烧杯内，加玻璃珠，在磁力搅拌器上搅拌4小时以上，制备 成接种用的孢子母液。这一过程旨在将蜜蜂幼虫体内形成的包囊打破，释放内部大量的孢 子。完全释放后，在生物显微镜下进行孢子计数，确定孢子母液的浓度后备用。接种
将准备好的孢子母液加入调配好的蜜蜂饲料内，使孢子终浓度为IO4-IO6个/毫升。接 种的对象为第3-5日龄的蜜蜂幼虫(若接种幼虫太小，容易引起蜜蜂的死亡，且球囊菌随后 的生长不一致)。方法为给达到接种日龄的蜜蜂幼虫更换饲料时就将混有孢子的饲料饲喂 蜜蜂24小时即可，随后就转为正常的没有孢子的饲料饲喂。处理
由于蜜蜂球囊菌的生长受温度的影响较大，正常蜜蜂幼虫的培养温度为34. 5°C。本发 明研究发现只需30°C短至2个小时的低温处理就足以大大促进蜜蜂球囊菌的生长。这里我 们采用30°C处理4个小时比较稳妥的低温处理，之后转入正常的培养箱内进行饲养。这样接种球囊菌孢子饲养的蜜蜂幼虫，摄入孢子的数量可以得到很好的控制，且 在不同的蜜蜂幼虫之间基本没有差异，可以在任何日龄随意对蜜蜂幼虫接种。接种的蜜蜂 幼虫可以完成幼虫期的发育，在进入预蛹期(第六日龄)之后，接入的孢子开始萌发并迅速 在蜜蜂体内生长，在第7日龄基本所有的蜜蜂幼虫都长满了球囊菌的菌丝(如图2所示)。通 过这种方式培养蜜蜂球囊菌成功率极高，全部蜜蜂幼虫均可成功的长出蜜蜂球囊菌菌丝， 且其生长情况基本一致。为相关的研究与实践工作提供了较好的素材与方法，可以在球囊菌侵染蜜蜂的不同阶段取样，研究蜜蜂球囊菌侵染机理和过程。
权利要求
一种利用实验室饲养的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊菌的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)蜜蜂幼虫的实验室饲养利用24孔板来饲喂蜜蜂的幼虫直至蜜蜂幼虫发育完全；培养箱培育条件温度为34.5℃，湿度≥80%；化蛹后，用滤纸吸干体表的饲料后，置入垫有滤纸的24孔板内完成蛹期的发育；(2)接种孢子的准备接种用的孢子来自于患病蜂群的染病幼虫，采集这些形成孢子的染病幼虫，用匀浆器磨碎幼虫，移至加有灭菌水的烧杯内，加玻璃珠，搅拌4小时以上，制备成接种用的孢子母液；(3)接种将准备好的孢子母液加入调配好的蜜蜂幼虫的饲料内，使孢子终浓度为104 106个/毫升；接种的对象为第3 5日龄的蜜蜂幼虫；接种方法为在给第3 5日龄的蜜蜂幼虫更换饲料时，将混有孢子的饲料饲喂蜜蜂24 小时，随后就转为正常的没有孢子的饲料饲喂；(4)低温处理接种时采用30℃处理4个小时的低温处理，之后转入正常的培养箱内进行饲养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述饲喂蜜蜂幼虫的饲料配方按重量比 为蜂王浆50%，无菌水37%，蜂蜜12%，酵母浸膏1%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蜜蜂幼虫的实验室饲养具体方法为 从蜂箱内移取2日龄的蜜蜂幼虫至盛有蜜蜂幼虫饲料的24孔板内，置于培养箱内培养，以 后每24小时，重新制备一份加有饲料的24孔板且把蜜蜂幼虫移入，放入培养箱直至蜜蜂幼 虫发育完全。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述接种时，接种的对象为第3-5日龄的 蜜蜂幼虫；接种方法为在给第3-5日龄蜜蜂幼虫更换饲料时，将混有孢子的饲料饲喂蜜蜂 24小时，随后就转为正常的没有孢子的饲料饲喂。
全文摘要
本发明提供了一种利用实验室饲养的蜜蜂幼虫培养蜜蜂球囊菌的方法，该方法通过蜜蜂幼虫的实验室饲养，利用蜜蜂球囊菌孢子对蜜蜂接种，并在低温下处理，接种的蜜蜂幼虫可以完成幼虫期的发育。通过这种方式培养蜜蜂球囊菌成功率极高，全部蜜蜂幼虫均可成功的长出蜜蜂球囊菌菌丝，且其生长情况基本一致。本发明的方法省力、有效，可以在短时间内批量获得生长状态基本一致的蜜蜂球囊菌，为相关的研究与实践工作提供了较好的素材与方法。
文档编号C12N1/14GK101946752SQ20101027677
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者李江红, 梁勤, 郑志阳, 陈大福 申请人:福建农林大学