8] 图1提供了本发明的测定系统的简化概述。
[0049] 图2提供了用于检测核酸的本发明的测定系统的一个实施方式的简化概述。
[0050] 图3是图2中概述的测定的一个实施方式的代表性描绘。
[0051] 图4示出了用于本发明的测定系统的组合编码方案的一个实施方式的一般机制。
[0052] 图5提供了图4中所示的组合编码方案的实施方式的简化的、具体的实例。
[0053] 定义
[0054] 本文使用的术语旨在具有本领域普通技术人员所理解的普通且常用的含义。除非 特别指明，以下定义旨在帮助读者理解本发明，而不旨在改变或以其他方式限制这些术语 的含义。
[0055] 如本文所用的术语"抗体"旨在表示完整的免疫球蛋白或抗体或能够特异性结 合抗原的免疫球蛋白分子的任何功能片段（抗体和抗原是本文所定义的"结合配偶体 (binding partner) "）。如本文所用的"抗体"意在包括完整的抗体以及能够结合目的抗 原或抗原片段的任何抗体片段。这些肽的实例包括完整的抗体分子、抗体片段例如Fab、 F (ab'）2、CDR、VL、VH和抗体的能够特异性结合抗原的任何其他部分。用于本发明的测定的 抗体对在本发明的测定中所检测的蛋白质（即，生物靶）或用于检测的蛋白质（即，探针） 具有免疫反应性或免疫特异性，且因此与它们特异性且选择性地结合。
[0056] 如本文所用的术语"结合剂"是指特异性结合目的生物分子的任何剂。
[0057] "互补的"或"基本上互补的（substantially complementary) "是指核苷酸或核 酸之间，诸如例如双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物和单链核酸上的引物结合位 点之间的杂交、或碱基配对或双链体的形成。通常，互补的核苷酸是A和T (或A和U)，或C 和G。当核苷酸的一条链（经最佳比对和比较且具有适当的核苷酸插入或缺失）与另一条 链的至少约80%，通常至少约90 %至约95%，和甚至约98 %至约100 %配对时，两条单链 RNA或DNA分子被表述为是基本上互补的。
[0058] "杂交"是指其中两条单链多核苷酸非共价地结合形成稳定的双链多核苷酸的过 程。所得的（通常）双链的多核苷酸是"杂交体（hybrid)"或"双链体"。"杂交条件"将通 常包括约小于1M，通常小于约500mM且可以小于约200mM的盐浓度。"杂交缓冲液"是缓冲 盐溶液，例如5% SSPE或其他的本领域已知的这类缓冲液。杂交温度可以低至5°C，但是通 常大于22°C，且更通常地大于约30°C，且通常超过37°C。杂交通常在严格条件，即在这种条 件下引物将与其靶子序列（subsequence)杂交而不会与其他的非互补序列杂交的条件下 进行。严格条件是序列依赖性的且在不同的环境中是不同的。例如，对于特异性杂交，较长 的片段可能需要比短片段高的杂交温度。因为其他因素可能影响杂交的严格性，包括互补 链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所以参数的组合比单独的任何 一个参数的绝对测量更重要。通常严格条件被选择为比在特定的离子强度和PH下特定序 列的T ni低约5°C。在约7. 0至约8. 3的pH下和至少25°C的温度下，示例性的严格条件包括 至少0.0 lM至不大于IM的钠离子浓度（或其他盐）的盐浓度。例如，5xSSPE (pH 7. 4下的 750mM NaCl、50mM磷酸钠、5mM EDTA)和约30°C的温度的条件适合等位基因特异性的杂交， 但是合适的温度取决于杂交区域的长度和/或GC含量。
[0059] "连接"是指在温度驱动的反应中在两种或更多种核酸，例如寡核苷酸和/或多核 苷酸的末端之间形成共价键或连接（linkage)。键或连接的性质可极大地不同且连接可酶 促地或化学地进行。如本文所用的，连接通常酶促地进行以在一个寡核苷酸的5'碳末端核 苷酸与另一个核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯连接。
[0060] 本文所用的"核酸"、"寡核苷酸"、"oligo"或语法等价形式通常是指共价连接在一 起的至少两个核苷酸。核酸通常会包含磷酸二酯键，但是在某些情况下可包括具有可选骨 架，例如亚磷酰胺、二硫代磷酸酯或甲基亚磷酰胺（methylphophoroamidite)连接；或肽核 酸骨架和连接的核酸类似物。其他类似物核酸包括具有双环结构（包括锁核酸）、刚性骨架 (positive backbone)、非离子骨架和非核糖骨架的类似物核酸。可对核糖-磷酸骨架进行 修饰以增加分子的稳定性；例如，在某些环境中PNA:DNA杂交体可显示出更高的稳定性。
[0061] "引物"是指天然或合成的寡核苷酸，其与多核苷酸模板形成双链体后能够充当核 酸合成的起始点并从其3'端沿模板延伸致使形成延伸的双链体。延伸过程期间添加的核 苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常通过DNA聚合酶延伸引物。
[0062] 术语"SNP"或"单核苷酸多态性"指个体之间的遗传变异；例如，生物体的DNA中可 变的单一含氮碱基的位置。发现SNP遍布基因组；个体之间的许多遗传变异归因于SNP位 点的变异，且通常该遗传变异引起个体之间的表型变异。用于本发明的SNP及其相应的等 位基因可衍生自任意几种来源，例如公共数据库（U.C. Santa Cruz Human Genome Browser Gateway(http://genome, ucsc. edu/cgi-bin/hgGateway)或 NCBI dbSNP 网址(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/SNP/)或可如美国专利第 6, 969, 589 号；和名称为"Human Genomic Polymorphisms"的美国公布第2006/0188875号中所述经实验确定。虽然在本文提供的某 些实施方式中描述了 SNP的使用，但是将应理解其他双等位基因或多等位基因遗传标志也 可使用。双等位基因遗传标志是具有两种多态形式或等位基因的遗传标志。如以上提及的， 对于与性状相关联的双等位基因遗传标志，与对照组相比在实例组的遗传组成中更丰富的 等位基因被称作"关联等位基因 （associated allele) "，而其他等位基因可被称为"非关联 等位基因 （unassociated allele)"。因此，对于与特定性状（例如，疾病或药物反应）相关 联的每种双等位基因多态性，存在相应的关联等位基因。可被用于本文提供的方法的其他 双等位基因多态性包括但不限于多种核苷酸改变、插入、缺失和转位。还将应理解，本文述 及的DNA可包括基因组DNA、线粒体DNA、游离体DNA和/或DNA衍生物例如扩增子、RNA转 录物、cDNA、DNA类似物等。在关联研究中筛选到的多态位点可处于二倍体或单倍体状态且 理想地，将来自遍布基因组的位点。
[0063] 当提及结合配偶体（例如，蛋白质、核酸、抗体或其他亲和捕获剂等等）时，如本文 所用的术语"选择性地结合"、"选择性的结合"及类似术语是指两个或更多个结合配偶体的 具有高亲和力和/或互补性的结合反应以确保在指定的测定条件下的选择性杂交。通常， 特异性结合将是背景信号的标准差的至少三倍。因此，在指定条件下，结合配偶体结合其特 有的"靶"分子而不大量地结合样品中存在的其他分子。
[0064] "测序"、"序列测定"及类似术语是指与核酸的核苷酸碱基序列相关的信息的测 定。该信息可包括核酸的部分以及全部序列信息的鉴定或测定。序列信息可根据不同程 度的统计学可信度或置信度确定。在一个方面，该术语包括对核酸中多个连续核苷酸的同 一性或顺序的测定。"高通量数字测序"或"下一代测序（next generation sequencing) " 是指使用以本质上并行的方式测定许多（通常数千至数十亿）核酸序列的方法测定序列， 即，其中不是一次一个地，而是在大批量程序中准备用于测序的DNA模板，且其中优选地 并行或可选择地使用本身可能并行化的超高通量系列程序读出许多序列。这些方法包括 但不限于焦磷酸测序（例如，如由454Life Sciences，Inc.，Branford, CT商售）；通过连 接测序（例如，如在 S0LiD?technology, Life Technology, Inc. ,Carlsbad, CA 商售）；通 过使用修饰的核苷酸合成测序（例如，在由Illumina, Inc. , San Diego, CA的TruSeq?and HiSeq?technology、由 Helicos Biosciences Corporation, Cambridge, MA 的 HeliScope? 和 Pacific Biosciences of California, Inc. , Menlo Park, CA 的 PacBio RS 商售）， 通过离子检测技术测序（Ion Torrent, Inc. ,South San Francisco, CA) ;DNA纳米球测 序（Complete Genomics, Inc. ,Mountain View, CA);基于纳米孔的测序技术（例如，如由 Oxford Nanopore Technologies, LTD, Oxford, UK开发）及类似的高并行化测序方法。
[0065] 术语"T/被用来指"熔化温度"。熔化温度是一群双链核酸分子被半数解离成单 链的温度。用于计算核酸的T ni的多种等式是本领域熟知的。如由标准参考文献指出的，当 核酸在IM NaCl的水溶液中时，对TJ直的简单估算可通过等式Tni= 81. 5+0. 41 (% G+C)来 计算（参见，例如 Anderson 和 Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization(1985))。其他参考文献（例如，Allawi 和 SantaLucia, Jr. ,Biochem istry，36:10581-94 (1997))包括可选的计算方法，对于Tni的计算这些方法考虑了结构和环 境以及序列的特征。
【具体实施方式】
[0066] 除非另外指明，本文描述的技术的实践可采用有机化学的、聚合物技术、分 子生物学（包括重组技术）、细胞生物学、生物化学和测序技术的传统技术和说明， 这些都在从事本领域的人员的技术范围内。这些传统技术包括聚合物阵列合成、多 核苷酸的杂交和连接，以及使用标记检测杂交。对合适技术的具体阐述可参考本文 的实例获得。然而，当然也可使用其他等效的传统技术。这些传统技术及说明可在 标准实验室手册如 Green,等人，编辑，Genome Analysis:A Laboratory Manual Series (第 I-IV 卷）（1999) ;Weiner，Gabriel，Stephens,编辑，Genetic Variation:A Laboratory Manual(2〇〇7) ;Dieffenbach，Dveksler，编辑，PCR Primer:A Laboratory Manual (2003) ；Bowte11 和 Sambrook, DNA Microarrays : A Molecular Cloning Manual (2003) ；Mount,Bioinformatics : Sequence and Genome Analysis (2004)； Sambrook 和 Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2006);及 Sambrook和 Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2002) (全部来自 Cold Spring Harbor Laboratory Press) ;Stryer, Biochemistry (第 4 版）（1995)W.H. Freeman, New York N.Y. ;Gait, "