号公开了可用于本发明的测定系统的某些一般目的 的应用流体学（fluidics)工具，允许用相对简单的硬件精确地操纵气体、液体和固体以完 成非常复杂的分析操作。
[0107] 在更具体的实例中，一个或多个流通池 （flow cell)可与来自上文的附着基材的 生物样品连接。流通池可包括与其连接的入口管和出口管并且任选地，外部栗用来将试剂 递送到流通池并经过生物样品。流通池被设置为仅将试剂递送到生物样品的某些部分，限 制递送到生物样品的任何具体部分的试剂的量和类型。
[0108] 在另一个方面，可将微流体系统集成到其上布置生物样品的基材中或从外部附接 到基材的顶部。用于容纳并携带流体的微流体管道可通过与基材邻接的应用流体层形成在 平面基材上和/或其上方。可根据选择性地开放和关闭布置在试剂池之间的阀来选择和递 送流体试剂。
[0109] 栗通常包括用于移动流体和/或设置在流体中的试剂的任何机构。在某些实例 中，栗可被设置成使流体和/或试剂移动经过具有小体积的管道（即，微流体结构）。除了 其他方法外，栗可通过对流体和/或携带流体的结构施加正压或负压来机械地操作，或通 过电场的适当应用来电动地操作，或两者兼有。示例性的机械栗可包括注射栗、蠕动栗、旋 转栗、加压气体、移液器等。机械栗可被微型机械化、模制等。示例性的电动栗可包括电极 且可通过电泳、电内渗（electroendoosmosis)、电毛细管、双向电泳（包括其行波形式）和 /或类似的方法操作。
[0110] 阀通常包括用于调控流体通过管道的任何机构。阀可包括例如，可被选择性地变 形以部分或完全地关闭管道的可变形的构件，可选择性地延伸进入通道以部分或完全地堵 塞管道的可移动的突出部，电毛细管结构和/或类似的结构。
[0111] 开口垫圈可与生物样品的顶部附接并可将样品和试剂注射到垫圈中。合适的垫圈 材料包括但不限于氯丁橡胶、腈和硅橡胶。可选择地，防水反应室可由夹在基材上的生物样 品和化学上惰性的防水材料例如但不限于黑色电镀铝、热塑性塑料（例如，聚苯乙烯、聚碳 酸酯等）、玻璃等之间的垫圈形成。
[0112] 在可选的实施方式中，测定系统包括确定目的生物样品的特征和组织的成像装 置。所获得的图像例如可用来设计试剂的安置模式。成像装置是任选的，因为人们可使 用例如显微镜来代替观察生物样品，分析生物样品的组织并具体说明递送测定试剂的空 间模式。递送系统（如果包括的话）可包含微电路构造，所述微电路构造包括成像器例 如基于C⑶或IGFET(例如，基于CMOS)的成像器和例如通过引用并入本文的美国公布第 20090197326号中描述的用于试剂递送的超声喷雾器。另外，应注意虽然图4和5使用x，y 网格构型阐述，可使用其他构型，诸如，例如遵循组织样品的拓扑学；靶向组织中的某些组 的细胞、细胞层和/或细胞类型，及类似的构型。
[0113] 在又一个替代方案中，试剂递送系统使用半导体技术例如掩蔽和喷涂控制试剂递 送到生物样品表面上的具体模式。通过使用掩蔽物保护特定区域免于暴露，可避免生物样 品的特定区域暴露于试剂。可使用传统技术例如喷涂或流体流将试剂引入到生物样品。掩 蔽递送的使用促成基材表面上模式化的递送方案。
[0114] 在本发明的优选的方面，试剂递送的设备基于喷墨印刷技术。存在多种不同的喷 墨机制（例如，热式、压电式）且已显示与含水墨制剂和有机墨制剂的相容性。数组独立驱 动的喷嘴可用来同时递送多种试剂，并达到非常高的分辨率。
[0115] 为了靶向特定的目的位点，待测定的生物样品的信息图像可用来辅助试剂递送方 法及相关的编码方案。可使用图像处理（例如，通过免疫组织化学或其他染色化学方法区 分的细胞类型的图像）结合测定系统的其他特征来鉴定生物样品的取样区域。在某些方 面，使用软件将图像信息自动翻译成试剂递送模式。因此非常准确地记录并比对生物样品 的试剂递送的机构（mechanism)是本发明的测定系统的重要组成部分。机构例如在载玻片 上的基准标志（fiducial marker)和/或其他非常精准的物理定位系统的使用可适用于该 目的。
[0116] 本发明优选地包括一整套适合该测定系统的软件。任选地，寡核苷酸设计软件用 来设计待进行特定测定的编码核苷酸（且在其中测定核酸的实施方式中，为靶特异性寡核 苷酸）并可被集成为该系统的一部分。还任选地，可将用于试剂递送和数据分析（即，序列 分析）的算法和软件集成在一起以确定测定结果。集成数据分析是特别有用的，因为由于 规模的结果，所产生的数据组的类型可能是巨大的。为分析通过该测定系统产生的空间上 关联的数据而专门设计的算法和软件工具，包括模式分析软件和可视工具增强了由该测定 系统所产生的数据的价值。
[0117] 在某些方面，该测定系统包含用于进行和实施试剂质量控制例如，寡核苷酸库的 完整性和序列保真性的程序。特别地，根据例如挥发性、在关键温度下的稳定性及化学相容 性的因素配制试剂以与试剂递送设备相容并可通过集成在测定系统内的设备来分析这些 试剂。
[0118] 测序
[0119] 许多方法可用来鉴定本发明的测定系统的编码探针中的代码标签和探针序列。可 使用例如质谱（例如，LC-MS/MS的Maldi-T)、核磁共振成像或优选地，核酸测序的技术来检 测代码标签。用于对本发明的代码标签解码的技术的实例可在例如通过引用并入本文的美 国公布第20080220434号中找到。例如，代码标签可以是寡核苷酸质量标签（0ΜΤ或质量标 签）。例如，在通过引用整体并入本文的美国公布第20090305237号中描述了这些标签。在 又一个替代方案中，可扩增编码探针并与微阵列杂交。这将需要进行单独的扩增反应，其中 每次扩增是对特定的空间代码或代码的子集特异的，通过使用代码特异性引物来实现。每 次扩增还将并入不同的可分辨标记（例如，荧光团）。杂交后，可通过可分辨标记的相对丰 度测定映射到样品中不同的空间位置的特定靶的相对量。
[0120] 在一个特别优选的方面，所得的根据该测定系统的代码标签是高通量、下一代 测序的底物，并使用高并行下一代测序方法来确认代码标签的序列，例如用SOLiD?技 术(Life Technologies, Inc.)或 Genome Ananlyzer(Illumina，Inc.) 〇 该下一代测 序方法可使用例如一轮测序（one pass sequencing)方法或使用双末端测序进行。下 一代测序方法包括但不限于诸如在例如Drmanac美国专利第6, 864, 052 ;6, 309, 824 ; 和6,401，267号；和Drmanac等人，美国专利公布2005/0191656中公开的基于杂交的 方法；通过合成测序（sequencing-by-synthesis)的方法，例如美国专利第6, 210, 891 ; 6, 828, 100 ；6, 969, 488 ；6, 897, 023 ；6, 833, 246 ；6, 911, 345 ；6, 787, 308 ；7, 297, 518 ； 7, 462, 449 和 7, 501, 245 号；美国公布申请第 20110059436 ;20040106110 ;20030064398 和 20030022207 号；Ronaghi,等人，Science,281:363-365 (1998);和 Li,等人，？『〇。· Natl. Acad. Sci.，100:414-419(2003);基于连接的方法，例如美国专利第5, 912, 148和 6, 130, 073 号；和美国专利申请第 20100105052、20070207482 和 20090018024 号；纳米 孔测序例如美国专利申请第 20070036511 ;20080032301 ;20080128627 ;20090082212 号； 和Soni和Meller, Clin Chem 53:1996-2001(2007))，以及其他方法，例如美国专利申请 第 20110033854 ;20090264299 ;20090155781 和 20090005252 号；还参见 McKernan,等 人，Genome Res. ,19:1527-41 (2009)和 Bentley,等人，Nature 456:53-59 (2008)，为了所 有目的将所有这些文献通过引用整体并入本文。
[0121] 测定系统的应用
[0122] 在阅读本公开内容后将对于本领域技术人员明显的是：存在将受益于可同时测量 生物靶在生物样品中的量和空间位置的高通量多重测定系统的许多重要的生物研究、诊断 和药物开发的领域。例如，组合估计不同RNA转录物的相对丰度的能力和重新构建遍及许 多位置的丰度的空间模式的图像（可能和组织中的单个细胞一样小或甚至比它还小）的能 力使得许多不同的基础研究领域成为可能。以下是示例性的用途且绝不意味着在范围上是 限制性的。
[0123] 在一个实例中，以与CT扫描中的重新构建图像的方式相似的方式通过分析一系 列的组织切片确定基因表达的3维模式。该方法可用来测量疾病病理中例如在癌性组织和 /或经损伤、炎症或感染的组织中基因表达的变化。通过本发明的测定系统，获得了关于复 杂组织中的基因表达和蛋白质定位的更详细的信息，导致对正常和疾病状态中的功能和调 控的新认识，并提供了可被检验的新假设。例如，本发明的测定系统可使得从许多单独的研 究和较大的项目如 ENCODE (Birney,等人，Nature, 447:799-816 (2007))和 modENCODE 获得 的认识能够在组织水平上整合。该测定系统还辅助计算机尝试来模仿系统生物学领域基因 表达的相互作用网络。
[0124] 该测定系统还提供了分析体细胞变异例如癌症中的体细胞突变或响应于受感染 的生物体的变异性的新方法。例如，肿瘤通常是高度异质性的，包含癌细胞以及在异常局部 环境中的遗传学上正常的细胞。癌细胞进行突变和选择，且在该过程中形成局部克隆并不 是不常见的。在肿瘤环境中鉴定相对稀少的体细胞突变可使得研究关键突变在克隆变异体 的选择中的作用成为可能。可分析在癌细胞和遗传学上正常的细胞中与血管生成、炎症或 其他癌相关过程有关的转录模式以获得对癌症生物学的认识并有助于开发用于治疗癌症 的新型治疗剂。在另一个实例中，个体对感染性生物体具有不同的敏感性，且本发明的测定 系统可用来研究微生物与组织或组织内的多种细胞类型之间的相互作用。
[0125] 重要的是，因为在任何给定的反应中由于只测定了少数位置，信噪比（signal to noise)可急剧增加，所以除了提供空间上相关的信息，本发明允许检测稀少突变的灵敏性 大幅增加。在对混合的样品中的稀有突变的典型测定中，批量处理该样品，即，将核酸从许 多细胞提取到单一的池中。因此，如果突变存在于10, 〇〇〇个细胞中的一个细胞内，必须针 对来自~10, 〇〇〇个细胞的正常DNA的背景检测该突变。相比之下，通过本发明的测定系统， 可分析许多细胞，但是单独的细胞或少数几组细胞将被空间代码系统鉴定。因此，在本发明 的测定系统中，背景成数量级地减少，极大地增加了灵敏性。此外，可观察突变细胞的空间 组织，这对于在癌症组织切片中检测关键突变可能是特别重要的。已有的分子组织学分析 正在产生对癌症生物学的认识，且可能具有用于诊断的潜力。本发明的技术有希望极大地 增加这些方法的力量。
[0126] 实施例
[0127] 提供以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何实施和使用本发明的完整公 开和描述，且这些实施例不意在限制发明人所认为的其发明的范围，这些实施例也不意在 代表或意味着以下实验是所进行的全部实验或仅有的实验。本领域技术人员应理解可如具 体实施方式中展现的那样对本发明进行许多改变和/或修改而不偏离宽泛地描述的本发 明的精神或范围。因此，无论在哪个方面，应认为该实施方式是说明性而不是限制性的。
[0128] 已经进行努力以确保关于所使用的数字（例如，量、温度等）的准确性但是