分析的SNP的任何一侧）和在301和303看到的连接区域。促使寡核苷酸探 针与生物样品中的靶核酸（未示出）杂交。在步骤302处，寡核苷酸探针之一被延伸以并 入SNP序列并与另一个探针连接以形成包含靶核酸区域309和连接区域301和303的延伸 的探针。
[0088] 将包含代码标签（在315和317处看到）、连接区域（在311和313处看到）和引 物区域（在319和321处看到）的两种编码剂在步骤304与延伸的探针相组合并连接以形 成编码的靶特异性寡核苷酸。再次地，与图1相比，在分开的步骤中递送探针和编码剂。这 样做允许使用下文描述的组合实施方式。在优选的实施方式中，一对编码寡核苷酸内的编 码寡核苷酸与靶序列的一侧或另一侧（即，靶序列的5'或3'端）特异性连接。另外，通常 编码寡核苷酸和探针的连接区域和引物区域是通用的；也就是，在构建探针和编码寡核苷 酸中使用的连接区域和引物区域的组合是恒定的，且只有探针的靶特异性区域和编码核苷 酸的代码标签不同。但是，又在替代实施方式中，连接区域和引物区域不是通用的，并在探 针和编码剂之间不同。
[0089] 连接以后，洗脱、汇集编码探针，并任选地通过PCR向编码探针加入测序接头。在 替代实施方式中，测序引物可与编码寡核苷酸连接，或测序引物序列可被包括作为编码寡 核苷酸的一部分。如图3中所看到的，每个测序接头包含与编码探针上的引物区域319和 321相容的引物区域319或321。现在准备将包含第一接头327、第一引物区域319、第一代 码标签315、连接区域311和301、靶区域309、连接区域313和303、第二代码标签317、第二 引物区域325和第二接头329的最终构建体输入到数字高通量测序程序中。
[0090] 图3中例示了延伸反应和连接反应的组合，但是应当理解多种反应可用来偶联编 码寡核苷酸和靶特异性寡核苷酸，包括仅连接（例如，对于与靶核酸序列的连续部分杂交的 寡核苷酸）。可选择地，可采用使用了另外的寡核苷酸的测定，例如在GOLDENGΑ??? 测定中（参见 Fan,等人，Cold Spring Symp. Quant.Biol. ,68:69-78(2003); (Illumina, Inc.，San Diego, CA))〇
[0091] 在其他实施方式中，本发明的测定系统还可用来分析生物样品中的肽或蛋白质、 抗体的存在、酶活性和其他蛋白质的活性、翻译后修饰、肽的活性和非活性形式以及肽的异 构体（isoform)。因此，探针可包含酶的活性区域、免疫球蛋白的结合结构域、蛋白质的特定 结构域、完整的蛋白质、合成的肽、引入突变的肽、适体和类似物。
[0092] 在某些方面，探针是酶或酶原（proenzyme)例如激酶、磷酸酶、酶原（zymogen)、蛋 白酶或其片段的底物。在某些方面，探针是用来检测参与一种或多种信号转导通路的蛋白 质例如激酶或磷酸酶的磷酸化底物。在本发明的另一个特定的方面，探针是仅与单独的蛋 白酶或蛋白酶种类结合的特定蛋白酶底物。在其他方面，探针是酶的不同加工形式、异构体 和/或结构域。基于蛋白质的探针通常与寡核苷酸编码剂共辄或以其他方式与其连接。在 该实例中的寡核苷酸编码剂还将包括促进蛋白质探针鉴定的核苷酸序列组分。
[0093] 在某些方面，本发明提供了用于评价样品中的不同位置之间和/或样品之间生物 靶的量和/或活性的差异的测定。该方法包括确定来自生物样品的多个编码结果和评价生 物靶在生物样品中的每个位置的数量的差异。
[0094] 组合实施方式
[0095] 为了将编码效率最大化，可使用在编码寡核苷酸中利用成对代码标签的组合方 法。通过将靶特异性信息和编码标签去偶联，所需要的寡核苷酸的数目急剧减少，伴随成本 减少。
[0096] 图4示出了用于本发明的测定系统的组合编码方案的一个实施方式的一般机制， 其中测定了代表性组织切片中的核酸（在416处示出）。图4在A处示出了特异性结合目的 靶核酸402的两个靶特异性/编码寡核苷酸构建体420和422 (例如，在图3的步骤302和 304之间形成）。第一编码探针420包括与例如用于扩增测定产物的通用引发位点或接头相 关联的代码标签408以使得能够使用测序技术404鉴定代码识别剂（coding identifier)。 第二编码探针422包括与例如用于扩增测定产物的通用引发位点或接头相关联的代码标 签406以使得能够使用测序技术410鉴定编码识别剂。
[0097] 图4在B处示出了可用于二十种不同的代码标签al到alO (编码探针420上的代 码标签406)和bl到blO (编码探针422上的代码标签408)的空间模式。例如代码标签al 安置在生物样品上10个离散的区域或斑点（在412中示为第一水平线的斑点）中。代码 标签a2安置在生物样品上在412中第二水平线上的10个斑点中。代码标签a3安置在生 物样品上在412中第三水平线上的10个斑点中，等等。鉴于"a"标签安置在10个水平的 排中，如414中所示，"b"标签安置在10个垂直的排中。例如，代码标签bl安置在生物样 品上在414的第一垂直排的十个离散的斑点中，代码标签b2安置在生物样品上在414的第 二垂直排的十个离散的斑点中，等等。使用该设置允许20个代码标签唯一地界定生物样品 上100个不同的位置。
[0098] 图4在C处示出了与代码标签网格418 -致的代表性组织切片416。箭头表明了 "a"代码标签和"b"代码标签如何安置在与组织切片416 -致的网格418上。如果一旦测 序，代码标签al和b4例如与靶核酸序列相关联，那么该靶核酸序列（即，生物靶）呈现在 组织切片中的位置al、b4处。
[0099] 图5提供了用于本发明的测定系统的编码方案的简化的特定实例。图5示出了包 含al、a2、a3、a4和bl、b2、b3及b4的编码寡核苷酸510。在520处示出了靶特异性寡核苷 酸（TSO)(探针）1和2。在530处示出了安置或分配方案。如图4中例示的网格一样，编码 寡核苷酸al至a4以某种模式（此处，以竖直模式）安置在斑点中，且编码寡核苷酸bl至 b4以某种模式（此处，以水平模式）安置在斑点中。网格虽然被示为具有斑点的正方形，但 实际上是在生物样品（未示出）例如图4中所示的组织切片416上的安置模式。
[0100] 将靶特异性寡核苷酸递送到生物样品中，其中靶特异性寡核苷酸与生物样品中的 靶核酸杂交（如果存在靶核酸的话）。然后通过例如洗涤去除未杂交的靶特异性寡核苷酸。 然后根据在530处所示的空间模式，将编码寡核苷酸递送到生物样品中。编码寡核苷酸与 和生物样品中的靶核酸杂交的任何靶特异性寡核苷酸连接（或，例如，延伸并连接），然后 将连接的构建体从生物样品中洗脱出来，汇集并通过例如PCR或连接加入测序接头（如果 该序列之前未被包含在编码寡核苷酸内的话）。通过例如高通量或"下一代"测序对连接 的构建体测序。在540处示出了所得序列的集合（pool)。仅在a4bl、a4b2、alb3、a2b3、 a3b3、a4b3和a4b4(用水平线示出的位置）获得了靶特异性寡核苷酸I的序列读出。仅在 albl (用竖直线示出的位置）获得了靶特异性寡核苷酸2的序列读出。在位置a2bl、a3bl、 alb2、a2b2和a3b2处（用交叉影线示出的位置）获得了靶特异性寡核苷酸1和2的序列 读出。未在alb4、a2b4或a3b4处（无阴影示出的位置）获得任一个靶特异性寡核苷酸的 序列读出。因此，在进行测定的生物样品中，在生物样品的左侧的大部分并在底部检测到第 一靶核酸，仅在生物样品的左上部分检测到第二靶核酸，且未在生物样品的右上部分检测 到任何一种靶核酸。现在可将两种靶核酸的不同表达映射回生物样品并映射生物样品的这 些位置中的生物结构或细胞类型。除了位置信息，可获得与编码标签的相对丰度相关的信 息。例如，如果发现与a4Tlb2序列相比多达十倍的a4Tlbl序列出现在数据组中，这将表明 靶核酸序列1在a4Tlbl位置比在a4Tlb2位置丰富十倍。在如图3所示的核苷酸分析的实 例中，通过将代码标签与靶特异性寡核苷酸直接连接，对于η个靶仅需要2n个靶特异性寡 核苷酸。例如，使用图2中概括的组合方法，在10, 000个空间位置测定100个不同的靶将 需要2X 100个靶特异性寡核苷酸和2X 100个编码寡核苷酸。不计算通用引物，测定寡 核苷酸的总数将仅为400 (200个靶特异性的和200个编码的寡核苷酸）。相比之下，如果代 码寡核苷酸未与靶特异性寡核苷酸去偶联，将需要（nX X个位置代码）+ (nX Y个位置代 码），或在上述实例中，不计算通用引物序列，需要20, 000寡核苷酸。此外，虽然图2-5中所 示的实施方式描绘了使用两种编码剂（代码标签）的组合方案，但是可使用三种、四种或更 多种编码剂和代码标签，并通过不同的方法在不同的步骤组合中与探针连接或互相连接。
[0101] 由于本发明的测定系统的空间编码方面，用甚至数目适中的测定就可产生大量的 信息。例如，在样品中的5个或更多个位置测定的5种或更多种生物靶产生25种或更多 种组合。使用数字测序作为读出，每种组合的序列读数的最佳数目取决于所需要的灵敏度 和动态范围，并可调整。例如，如果对于每种组合抽出平均100个读数，对于25种组合的总 数是2500个读数。如果以平均1，000的取样深度在1，000个位置测定1，000个靶，则需要 IO9个读数。这些数字，虽然大，但是在本质上并行的数字测序方法的能力之内，这些方法可 在合理的时间表中并以每个读数非常低的成本产生数十亿或甚至数万亿读数的数据集。因 此，通过改变待检测的位置或待测定的生物靶的数目或两者都改变，并使用数字测序，可获 得大量的信息。在特定的方面，对于两种或更多种生物分子检测多个位置。
[0102] 试剂递送系统
[0103] 本发明的试剂递送系统包括允许向生物样品的离散部分递送试剂的设备，维持编 码方案的空间模式的完整性。本发明的测定系统的试剂递送系统包含任选的成像装置、试 剂递送硬件和控制软件。试剂递送可以多种不同的方式实现。应当注意试剂递送可能一次 针对许多不同的生物样品。本文已例示了单一的组织切片；然而，可同时附着并分析多种生 物样品。例如，可并行分析组织样品的连续切片并组合数据以建立3D图谱。
[0104] 对于本发明的测定系统不可缺的是允许试剂到达生物样品上的空间模式的设 备。用于配制并递送生物分子（例如，寡核苷酸或抗体）和化学试剂（例如，小分子或 dNTP)的技术是本领域已知的且这些设备系统的使用是本领域技术人员已知的并容易适 用本发明的测定系统。合适的试剂递送系统的一个实例是Labcyt eTMEch〇声波移液设备 (Labcyte?Echo acoustic liquid handler)，其可用来以高的准确度和重复性递送包含生 物分子的纳升（nanoliter)尺度的小滴。使用软件来具体说明试剂应被递送的位置，本领 域技术人员可以将该试剂递送装置集成到整个系统中。
[0105] 可用于将剂和/或代码识别剂安置到生物样品上的其他设备包括但不限于喷墨 点涂（ink jet spotting);通过大头针、笔或毛细管的机械点涂；微接触印刷；光化学或光 刻方法；及类似方法。对于多种应用，将生物样品的某些区域分割或隔离成用于不同的试剂 分布和/或生物靶测定的一个或多个测定区域可能是优选的。可使用屏障或管道将这些测 定区域物理地分隔开。
[0106] 在一个示例性的方面，试剂递送系统可以是基于流的系统（flow based system)。 在本发明中用于试剂递送的基于流的系统可包括例如一个或多个栗、阀、流体贮池 （fluid reservoir)、管道和/或试剂储存池的设备。试剂递送系统被设置成使流体移动以接触生 物样品的离散部分。这些试剂的移动可由布置在例如，流体试剂下游的栗来驱动。栗可将 每种流体试剂驱送到（并经过）反应区室。可选择地，可通过重力驱使试剂穿过流体。美 国公布第20070166725和20050239192