专利名称：一种利用ssr指纹图谱鉴别紫云英品种的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，更具体涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别绿肥作物紫 云英品种的方法。
背景技术：
紫云英(学名-Jistragalus ^iflicm)是豆科黄芪属的植物。属一年生或越年生草 本。又称红花草、翘摇。广泛分布于北纬25 33度地区，多生长在溪边、山坡及潮湿处。中 国早在明、清时代就已在长江中下游地区大面积种植。紫云英主根较肥大，一般入土 40 50厘米，侧根入土较浅。紫云英主根、侧根及地表的细根上都能着生根瘤，以侧根上居多 数。茎呈圆柱形，中空，柔嫩多汁，有疏茸毛。栽培品种株高一般80 120厘米，野生的只 有10 30厘米。叶多数为奇数羽状复叶，具7 13枚小叶。小叶全缘，倒卵形或椭圆形。 花为伞形花序，一般腋生，少顶生，常有小花8 10多，族生在花梗上，排列成轮状。荚果两 列，联合成三角形，稍弯，无毛，顶端有喙。每荚有种子4 10粒，种子肾状，种皮光滑，一般 黄绿色。千粒重3 3. 5克。现在中国南方多用作稻田冬季绿肥栽种，一般在秋季套播于 晚稻田中，作早稻的基肥。紫云英除用作绿肥外，还能直接或青贮紫云英作饲料，营养价值 颇高。目前，紫云英的品种鉴别以生育特性与形态外观为主按生育期和成熟期可分 早、中、晚3个类型。紫云英的主要优良品种，早熟种有信阳种、乐平种、闽紫1号等，中熟种 有余江大叶籽、萍宁3号、常德种、闽紫6号等，晚熟品种有宁波大桥种、浙紫5号等。由于 紫云英异花传粉，杂交率较高，单靠形态观察与生长特性难以准确地进行品种的鉴别。为了 更好地进行品种识别，达到保护品种知识权益的目的，需要有更为快速、准确的进行品种鉴 别的方法。
发明内容
本发明提供了一种利用SSR指纹图谱鉴别紫云英品种的方法，可以更准确地从植物基 因的分子水平鉴别紫云英品种资源。本发明利用SSR指纹图谱用于鉴别紫云英品种，其中涉及一种紫云英基因 组中特定的SSR位点，所述特定的SSR位点的序列由6条序列组成，其序列由短到长 排歹丨J 为① ACACACACAACACACACAAACACA ；② ACACACACACACACACAAACAAACACAAACAC ； ③ CTCTCTCTGATCTCTCTCTCCCTCTCCC TCTCCCTCTCCCTCT ；④ CTCTTCCTCTTCTTCTCTTTCATATG CTCCACT CTTCCTCTCTTCTTCTCT ；⑤ CCC ACACCACCACTCACCAACATCACCACTCACACACCAGCACCTTC CACTCCCTTCAACCACCCCCACCACTACTCAAACACCACCATCTCACCA ； ACACACACACACACACACACACGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGAGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACGTGCGCGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGCGT GCGTGTGTGTGTGTGT。
上述紫云英基因组中特定的SSR位点的两侧设计的引物序列由6对引物对组成， 引物对序列如下① EG6-54 上游CGCCCATAAATCTCTTCCA 下游CTCCCTTTGATCAATCTCGC ；
②EG6-167 上游TTTCACTTCTAGAAATTTGTTGACA，下游ATGGATGGTCAACTCGGTAAC ；
③Bm2-8 上游:GCTCGGCCTTTCACATGG,下游GAGAAATAGGTACCAGTTCTAGGG ；
④Lm2-44 上游GATTGACAAAGTCTGCCG，下游ATGCTCCCCTCTTCACACA ；⑤ EG6-170 上 游GGCCAACACTCACTACCCTCAT，下游CAACCAACGATCACTCCCACC ；⑥ YAGT37 上游 CGCCCATAAATCTCTTCCA，下游TGCGCACACACAACG。引物的筛选方法，包括下列步骤紫云英 总DNA的提取；用亲和磁珠富集紫云英基因组中的SSR位点，SSR位点两侧引物的设计筛 选；PCR扩增；PCR产物电泳及染色，根据电泳结果筛选具有多态性的引物。其中所述紫云英总DNA提取方法，以紫云英品种幼苗或成熟植株的叶片或茎段中 的一种或两种为材料，提取基因组DNA，具体的操作步骤为①称取0. 1克植物组织，用去离 子水冲洗干净，迅速转入1. 5ml离心管中；②加入液氮，迅速用电钻捣碎，加入600mlCTAB ； ③65°C水浴lh，混勻；④加等体积的氯仿一异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24 :1，混勻；
⑤12000rpm离心6min，取上清液；⑥向上清液中加入2倍体积的无水乙醇或2/3体积的异 丙醇沉淀DNA，-20°C放置20min ；⑦12000rpm离心6min，弃上清液；⑧加75%的乙醇清洗 DNA, 12000rpm离心2min，弃上清液；⑨风干后加入50ul的TE缓冲液溶解DNA，备用。所述PCR扩增，其PCR反应体系为25 μ L的PCR反应体系中包括提取的DNA溶 液 1 yL, 10nmol/L 引物 2 μ L, 2. 5 mmol/LdNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA聚合酶1 U ；PCR反应程序为94°C预变性7min;随后30个循环，每个循环94°C变 性 30 s, 55°C退火 30 s, 72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 10 min。所述PCR产物电泳及染色，采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。本发明的一种利用SSR指纹图谱鉴别紫云英品种的方法，其特征在于所述方法 包括(1)紫云英总DNA的提取；(2)根据所述特定的SSR位点两侧设计引物；(3)对引物 进行PCR扩增；(4)PCR产物经电泳及染色，形成不同紫云英品种的SSR指纹图谱，然后进行 紫云英的品种鉴别。其中所述紫云英总DNA提取方法，以紫云英品种幼苗或成熟植株的叶片或茎段中 的一种或两种为材料，提取基因组DNA，具体的操作步骤为①称取0. 1克植物组织，用去离 子水冲洗干净，迅速转入1. 5ml离心管中；②加入液氮，迅速用电钻捣碎，加入600mlCTAB ； ③65°C水浴lh，混勻；④加等体积的氯仿一异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24 :1，混勻； ⑤12000rpm离心6min，取上清液；⑥向上清液中加入2倍体积的无水乙醇或2/3体积的异 丙醇沉淀DNA，-20°C放置20min ；⑦12000rpm离心6min，弃上清液；⑧加75%的乙醇清洗 DNA, 12000rpm离心2min，弃上清液；⑨风干后加入50ul的TE缓冲液溶解DNA，备用。所述PCR扩增，其PCR反应体系为25 μ L的PCR反应体系中包括提取的DNA溶 液 1 yL, 10nmol/L 引物 2 μ L, 2. 5 mmol/LdNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA聚合酶1 U。PCR反应程序为94°C预变性7min;随后30个循环，每个循环94°C变 性 30 s, 55°C退火 30 s, 72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 10 min。本发明的显著优点
1)以提取的紫云英总DNA为鉴定材料，它可以在紫云英的任何生长时期与生长部位进 行取材提取而不影响反应结果，从而避免紫云英生长状态与生长时期对品种鉴别的干扰与影响；2)采用的分子标记技术为微卫星分子标记，也称SSR标记。这种标记广泛随机分布于 真核生物基因组中，具有高度的多态性、高信息含量、高度的可重复性和共显性遗传方式。 因此，SSR标记方法比其他标记方法具有简便、快捷、特异、稳定、所揭示的等位基因多样性 高等特点；3)通过大量的筛选工作，得到了可在紫云英不同品种中形成多态性的SSR位点， 用这种SSR位点两翼序列设计的引物，可以用于构建紫云英不同品种的指纹图谱，达到鉴 别紫云英品种的目的。
图1为引物EG6-54的指纹带型； 图2为引物EG6-167的指纹带型；
图3为引物Bm2-8的指纹带型； 图4为引物Lm2-44的指纹带型； 图5为引物EG6-170的指纹带型； 图6为引物YAGT37的指纹带型；
图7为紫云英9个参试品种在75bp-300bp范围形成的指纹带型。
具体实施例方式1、紫云英总DNA的提取
(1)参试紫云英品种1 闽紫1号；2 信阳种；3 宁波大桥种；4 =8324411 ；5 闽紫6 号；6:8410441; 7 :8487711 ;8 弋江籽；9 余江大叶籽；其中闽紫1号、8324411、闽紫6 号、8410441、8487711由福建省农业科学院提供，信阳种由河南省信阳市农业科学研究所提 供，余江大叶籽由江西省农业科学院提供，弋江籽由安徽省农业科学院提供，宁波大桥种由 浙江省农业科学院提供。(2)以紫云英品种幼苗为材料，采用CTAB法提取基因组DNA，由于CTAB法对于 不同作物的提取程序有所不同，我们经过改进，简化了针对紫云英的步骤，具体过程为① 称取0. 1克植物组织植物组织包括紫云英幼苗的茎和叶的部分，用去离子水冲洗干净，迅 速转入1. 5ml离心管中；②加入液氮，迅速用电钻捣碎，加入600mlCTAB(CTAB购自Amresco 公司)；③65°C水浴Ih (每20min反转摇勻一次)；④加等体积的氯仿一异戊醇(体积比24 1)，颠倒混勻；⑤12000rpm离心6min，取上清于新管中；⑥向上清中加入2倍体积的无水乙 醇(或2/3体积的异丙醇)沉淀DNA，-20°C放置20min ’⑦12000rpm离心6min，去上清；⑧ 加75%的乙醇清洗DNA，12000rpm离心2min，去上清；⑨风干后加入50ul的TE缓冲液溶 解DNA，备用；上述使用的有机溶剂均购自北京化工厂。2.用亲和磁珠富集紫云英基因组中特定的SSR序列本步骤应用Invitrogen公 司的Dynal磁珠与生物素标记的微卫星探针(CT) 15、(AG) 15、(GT) 15、(AC) 15与紫云英基因组 DNA酶切片段杂交，酶切使用的内切酶为Ec0RI，MSeI，均购自NEB公司，酶切步骤为；取10 μ g提取的紫云英DNA在50 μ 1反应体系中用限制性内切酶EcoRI和MseI酶切消化3小 时，取5μ1酶切产物电泳检测酶切效果，确定酶切完全。而后按Dynal磁珠的操作说明用 以捕获300-1500 bp含有微卫星序列的DNA片段，连接到pMD18_T载体(购自Takara公 司)中，构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用PMD18-T载体两端的测序接头引物(引物可以直接购自Takara公司也可以按其产品目录提供的序列合成)和根据微卫星核心 序列设计的引物(CT) 15、(AG)15, (GT)15, (AC)15 (由上海生工合成)配合组成引物对用以直接 进行文库PCR筛选，从800个转化子中获得了 236个阳性克隆，对其进行测序分析，获 得了 133个微卫星序列，微卫星序列的富集效率达到16. 7%。3. SSR引物的设计筛选及PCR扩增含有微卫星序列的DNA片段对SSR序列进行 分析，其中35个微卫星重复序列的两端均存在较长的碱基序列(>30bp)。据其设计特异 引物对，对9个品种紫云英全基因组DNA进行2次筛选。PCR反应体系为25 μ L的PCR 反应体系中包括提取的DNA溶液1 yL，10nmol/L引物2 μ L, 2. 5 mmol/LdNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA 聚合酶 1 U。PCR 反应程序为94°C预变性 7min ；随后 30个循环，每个循环94°C变性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30s ；最后72°C延伸10 min0由于SSR引物具有很高的特异性，这些引物对一般的反应结果可以分为不反应、无多 态性以及有多态性。根据PCR的电泳结果只选取带型清晰，且有多态性的引物形成的不同 指纹带型作为品种鉴别的依据。这里不必要进行结果统计，因为统计的结果主要用于构建 品种聚类群，而无助于进行品种间的鉴别。结果共得到可在不同品种中可扩增出带型清晰， 且有多态性的6对引物。证明这些引物对之间的SSR位点在紫云英不同品种的基因组中存 在着明显的多态性，PCR的电泳结果可用于构建品种间的指纹图谱。4.聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色，具体操作程序为①配制6%聚丙烯酰胺凝 胶，吸取PCR产物7μ L和IyL的上样缓冲液，充分混勻上样。上样完毕后140 V电压电 泳。当溴酚蓝指示剂距下边1 cm 2 cm时，结束电泳。②电泳结束后，关闭电泳仪，拿出 玻璃板并用药匙柄小心撬开，移走上层玻璃板，将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝下浸入已 准备好的放有双蒸水的干净的瓷盘中，凝胶即落下，或轻轻用药匙柄把胶剥开一角，即可落 入盘内；③凝胶的固定倒掉瓷盘中的水，加入固定液(100 mL/L乙醇)，在摇床上缓缓摇 动15 min;倒掉瓷盘中的固定液，用双蒸水洗2次；④凝胶的染色倒掉瓷盘中的水，加入 染色液(20 g/L AgNO3),在摇床上缓缓摇动染色20 min;⑤洗胶倒掉瓷盘中的染色液，用 双蒸水洗2次，共计1 min;⑥凝胶的显影加少量显色液(30 g/L Na2CO3)冲洗15 s，再加 一定体积显色液，轻摇瓷盘直到看到清晰的条带，一般为5 min 6 min，时间不要过长，否 则背景会过深；⑦终止显影倒掉瓷盘中的显影液，迅速倒入定影液(100 mL/L HAC),缓 缓摇动2 min 3 min;⑧识读序列倒掉瓷盘中的定影液，用双蒸水洗2次，每次2 min, 将凝胶放在空气中干燥，识读序列。也可用数码相机或凝胶成像仪摄像。5. SSR指纹图谱结果分析及判定6对引物对应的SSR位点在不同紫云英品种中 形成的指纹带型见图1-图6。其中图1能对紫云英参试品种在150bp-300bp范围形成4种 指纹带型；
图2能对紫云英参试品种在80bp-150bp范围形成5种指纹带型；图3能对紫云英参试 品种在75bp-100bp范围形成5种指纹带型；图4能对紫云英参试品种在70bp-150bp范围 形成4种指纹带型；图5能对紫云英参试品种在240bp-300bp范围形成3种指纹带型；图6 能对紫云英参试品种在250bp-650bp范围形成3种指纹带型；
下面我们以6个SSR位点中的2个位点为例说明如何根据其电泳的指纹图谱带型对参 试的9个品种进行区别。实施例1一、参试紫云英品种1 闽紫1号；2 信阳种；3 宁波大桥种；4 =8324411 ；5 闽紫6 号；6:8410441; 7 :8487711 ;8 弋江籽；9 余江大叶籽；其中闽紫1号、8324411、闽紫6 号、8410441、8487711由福建省农业科学院提供，信阳种由河南省信阳市农业科学研究所提 供，余江大叶籽由江西省农业科学院提供，弋江籽由安徽省农业科学院提供，宁波大桥种由 浙江省农业科学院提供。二、SSR标记的鉴别结果
1、由不同的SSR位点设计引物扩增形成的参试紫云英样品的带型图谱图7为引物 EG6-54 (图7中右侧)及引物EG6-167 (图7中左侧)对紫云英9个参试品种在75bp_300bp 范围形成的指纹带型(Μ为分子量标准，0为空白对照，1-9为参试样品编号)。2、紫云英品种带型的指纹分析将图7中扩增明显的主带定义为不同带型，如图7 所示分别用大写英文字母Α，B, C, D, Ε, F，G表示，可通过表1将紫云英参试品种的带型的指 纹图谱加以总结。表1紫云英参试品种的带型的指纹图谱分析
“ + ”表示1-9号参试品种所具有的带型。
由表1可见只要根据所用的2个SSR位点的多态性就可将参试的9个样品分为8个 类型，即除3号与9号之间不能区别外，其余样品之间均不同。因而可从分子水平对紫云英 品种加以鉴别。
权利要求
一种紫云英基因组中特定的SSR位点，其特征在于，所述特定的SSR位点的序列由6条序列组成，其序列由短到长排列为①ACACACACAACACACACAAACACA；②ACACACACACACACACAAACAAACACAAACAC；③CTCTCTCTGATCTCTCTCTCCCTCTCCC TCTCCCTCTCCCTCT； ④CTCTTCCTCTTCTTCTCTTTCATATGCTCCACT CTTCCTCTCTTCTTCTCT；⑤CCC ACACCACCACTCACCAACATCACCACTCACACACCAGCACCTTCCACTCCCTTCAACCACCCCCACCACTACTCAAACACCACCATCTCACCA；⑥ACACACACACACACACACACACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACGTGCGCGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGCGTGCGTGTGTGTGTGTGT。
2.一种利用权利要求1所述紫云英基因组中特定的SSR位点的两侧设计的 引物，其特征在于，所述引物序列由6对引物对组成，引物对序列如下①EG6-54 上游:CGCCCATAAATCTCTTCCA 下游CTCCCTTTGATCAATCTCGC ；② EG6-167 上 游:TTTCACTTCTAGAAATTTGTTGACA,下游ATGGATGGTCAACTCGGTAAC ；③ Bm2_8 上 游:GCTCGGCCTTTCACATGG,下游GAGAAATAGGTACCAGTTCTAGGG ；④ Lm2_44 上 游:GATTGACAAAGTCTGCCG,下游ATGCTCCCCTCTTCACACA ；⑤ EG6-170 上游 GGCCAACACTCACTACCCTCAT,下游CAACCAACGATCACTCCCACC ；⑥ YAGT37 上游 CGCCCATAAATCTCTTCCA,下游TGCGCACACACAACG。
3.—种如权利要求2所述的引物的筛选方法，其特征在于所述方法包括下列步骤紫 云英总DNA的提取；用亲和磁珠富集紫云英基因组中的SSR位点，SSR位点两侧引物的设 计筛选；PCR扩增；PCR产物电泳及染色，根据电泳结果筛选具有多态性的引物。
4.根据权利要求3所述的引物的筛选方法，其特征在于所述紫云英总DNA提取方法， 以紫云英品种幼苗或成熟植株的叶片或茎段中的一种或两种为材料，提取基因组DNA，具体 的操作步骤为①称取0. 1克植物组织，用去离子水冲洗干净，迅速转入1. 5ml离心管中； ②加入液氮，迅速用电钻捣碎，加入600mlCTAB ；③65°C水浴lh，混勻；④加等体积的氯仿一 异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24 :1，混勻；⑤12000rpm离心6min，取上清液；⑥向上清 液中加入2倍体积的无水乙醇或2/3体积的异丙醇沉淀DNA，_20°C放置20min ；⑦12000rpm 离心6min，弃上清液；⑧加75%的乙醇清洗DNA，12000rpm离心2min，弃上清液；⑨风干 后加入50ul的TE缓冲液溶解DNA，备用。
5.根据权利要求3所述的引物的筛选方法，其特征在于所述PCR扩增，其PCR反应 体系为25 yL的PCR反应体系中包括提取的DNA溶液1 μ L，IOnmol L—1引物2 μ L, 2.5 mmol L-1ClNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA 聚合酶 1 U ;PCR 反应程序 为94°C预变性7min;随后30个循环，每个循环94°C变性30 s, 55°C退火30 s, 72°C 延伸30s;最后72°C延伸10 min。
6.根据权利要求3所述的引物的筛选方法，其特征在于所述PCR产物电泳及染色， 采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。
7.一种利用SSR指纹图谱鉴别紫云英品种的方法，其特征在于所述方法包括(1)紫 云英总DNA的提取；(2)根据权利要求1所述的SSR位点两侧设计引物；(3)对引物进行 PCR扩增；(4)PCR产物经电泳及染色，形成不同紫云英品种的SSR指纹图谱，然后进行紫云英的品种鉴别。
8.根据权利要求7所述的利用SSR指纹图谱鉴别紫云英品种的方法，其特征在于所 述紫云英总DNA提取方法，以紫云英品种幼苗或成熟植株的叶片或茎段中的一种或两种 为材料，提取基因组DNA，具体的操作步骤为①称取0. 1克植物组织，用去离子水冲洗干 净，迅速转入1. 5ml离心管中；②加入液氮，迅速用电钻捣碎，加入600mlCTAB ；③65°C水浴 lh，混勻；④加等体积的氯仿一异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24 :1，混勻；⑤12000rpm 离心6min，取上清液；⑥向上清液中加入2倍体积的无水乙醇或2/3体积的异丙醇沉 淀DNA，-20°C放置20min ；⑦12000rpm离心6min，弃上清液；⑧加75%的乙醇清洗DNA， 12000rpm离心2min，弃上清液；⑨风干后加入50ul的TE缓冲液溶解DNA，备用。
9.根据权利要求7所述的利用SSR指纹图谱鉴别紫云英品种的方法，其特征在于所 述PCR扩增，其PCR反应体系为25 μ L的PCR反应体系中包括提取的DNA溶液1 μ L, IOnmol L-1 引物 2 μ L, 2.5 mmol L-1ClNTP 2 μ L, IOXPCRbuffer 2.5 μ L, Taq DNA 聚 合酶1 U。PCR反应程序为94°C预变性7min ；随后30个循环，每个循环94°C变性30 s, 55°C退火 30 s, 72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 10 min。
全文摘要
本发明提供了一种利用SSR指纹图谱鉴别紫云英品种的方法。本发明涉及的紫云英基因组中特定的SSR位点及其两侧引物序列如SEQ.NO.1-18，利用筛选的引物进行PCR扩增得到的指纹图谱可用于鉴别紫云英品种，鉴别方法主要包括提取紫云英总DNA,用亲和磁珠富集法从基因组DNA中筛选出特定的SSR位点并设计引物，通过对不同紫云英品种的PCR扩增最终得到6个SSR位点的引物对可形成显著条带差异，用其构建的指纹图谱有效地用于鉴别紫云英品种。
文档编号C12Q1/68GK101974516SQ20101051038
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者张辉, 朱炳耀, 林新坚, 陈坚, 陈济琛 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所