一种鉴别半夏品种资源的方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别半夏品种资源的方法，包括基因组DNA提取、PCR扩增18SrDNA序列和序列测定与分析的步骤，其中半夏基因组DNA的提取采用将一定量待测半夏样品的新鲜叶片组织放入离心管中，再加入温水预热后的适当体积配比的SDS与CTAB混合抽提液，混摇5min，用移液枪的枪头伸入上述离心管底部，缓慢顺时针旋转挑取丝状粘稠物质，获得基因组DNA，然后采用植物18SPCR引物18SF和18SR进行18SrDNA序列PCR扩增，随后测序，在NCBI的GenBank数据库中比对分析，从而判断其进化关系与种属来源。本发明的方法快速有效、简单便捷、可操作性强，能够准确鉴定半夏种属来源，确定道地半夏药材资源，为保护半夏种质多样性奠定理论基础，具有较大的应用价值。
【专利说明】一种鉴别半夏品种资源的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，涉及中药材半夏通过分子生物学鉴定确定其品种资源的方法。
【背景技术】
[0002]半夏属天南星科草本植物，其块茎入药，是我国大宗传统中药材之一，用药历史悠久。据报道，半夏具有降逆去燥、止咳化痰、抗肿瘤、抗早孕等多种药理作用。近年来，市场对半夏需求的不断加大，野生半夏资源的驯化和人工栽培应运而生。由于半夏繁殖率低，人工种植的半夏主产区种子供不应求，使得各地药农不得不到外地引种，种质资源交流频繁，造成道地药材资源消失殆尽。
[0003]半夏的生产正如许多中药材一样，种茎的特性千差万别，有的是不同物种(如掌叶半夏和水半夏)，它们属于伪品，不符合现代药材深加工对原材料的要求，对实施现代化中成药生产极为不利。品种混杂，品质不均是目前半夏产业面临的主要问题。然而，迄今为止，还没有成熟的鉴别半夏品种资源的技术方法。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种半夏品种资源的鉴定方法，该方法快速有效、简单便捷、可操作性强，能够准确鉴定半夏种属来源。
[0005]具体来说，本发明所采用的技术方案如下:
一种鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
(1)半夏基因组DNA的提取:选取一定量的待测半夏样品的新鲜叶片组织，放入离心管中；按每克叶片组织2000 μ L的比例加入温水预热后的适当体积配比的SDS与CTAB混合抽提液，混摇5min ;用移液枪的枪头伸入上述离心管底部，缓慢顺时针旋转挑取丝状粘稠物质，获得基因组DNA，将其溶于水中；取溶解后溶液适量，进行1%_2%琼脂糖电泳检测；
(2)18SrDNA序列PCR扩增:将上述所得DNA溶液稀释50-100倍；准备植物18SPCR引物18SF和18SR ;如下建立PCR扩增体系共50-100 μ L:水20-500 μ L,缓冲液1-5 μ L, 18SF引物1-5μ L，18SR引物1-5 μ L，上述稀释后的DNA溶液作为模板1-5 μ L, dNTP 1_5μ L，MgC121-5 μ L，rTaq酶1-5 μ L ;将上述体系中的材料依次加入PCR管中，放入PCR仪中，设置PCR反应条件，开始反应，反应结束后，得到所需的18SrDNA序列；
(3)序列测定与分析:将上述所得的序列进行测序，得到序列信息；在NCBI的GenBank数据库中下载用于比对和进化树分析的天南星科半夏属植物的ISSrDNA序列，运用分子信息分析软件对所得半夏样品ISSrDNA序列和网上报道的序列进行比对分析，从而判断其进化关系与种属来源。
[0006]优选地，步骤(1)的SDS与CTAB混合抽提液中SDS与CTAB的体积配比为1_10:1，更优选为2:1或3:1或4:1。
[0007]优选地，步骤(1)的“温水预热”是指在30-100°C的水温下预热Ι-lOOmin，更优选为在60-70°C的水温下预热30-40min。
[0008]优选地，步骤(2)的“引物18SF”的序列是指5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3';“引物 18SR” 的序列是指 5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
[0009]优选地，步骤(2)的PCR反应条件是指每个循环条件如下:94°C:l_5min ；55°C:IO-1OOs ；72°C:l-10min ;共 10-100 个循环。
[0010]优选地，步骤(3)的“天南星科半夏属植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌叶半夏(P.pedatisecta)、盾叶半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鹞落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂叶半夏(P.tripartita)。
[0011]有益效果:本发明的方法具有快速有效、简单便捷、可操作性强等优点，能够准确鉴定半夏种属来源，对指导药农种植《中国药典》规定的半夏类药材具有重要意义。此外，通过确定道地半夏药材资源，为保护半夏种质多样性奠定理论基础，具有较大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是实施例1中所鉴别的两种湖北荆州半夏的型态特征。
[0013]图2是实施例2中所鉴别的两种南京半夏的型态特征。
【具体实施方式】
[0014]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种半夏品种资源的鉴定方法，从而准确鉴定半夏种属来源，指导药农种植《中国药典》规定的半夏类药材。
[0015]在一个实施方案中，本发明提供的方法可以如下实施:
(O半夏基因组DNA的提取:选取0.5g待测半夏样品的新鲜叶片组织，放入商用EP管(规格1.5mL或2mL)中；加入温水预热后的适当体积配比的SDS与CTAB混合抽提液1000 μ L，混摇5min ;用移液枪的枪头(规格200 μ L或1000 μ L)伸入上述EP管底部，缓慢顺时针旋转挑取丝状粘稠物质，即所得基因组DNA，将其溶于50 μ L纯水中；取溶解后溶液3-5 UL,进行1%-2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0016](2) 18SrDNA序列PCR扩增:将上述所得DNA溶液稀释50-100倍；准备植物18SPCR引物18SF和18SR ;建立PCR扩增体系共50-100 μ L，如下:纯水20-500 μ L，商用缓冲液l_5yL，18SF引物l_5yL，18SR引物1-5 μ L，上述稀释后的DNA溶液作为模板1-5 μ L，商用dNTP 1-5 μ L,商用MgC12 1-5 μ L,商用rTaq酶1_5 μ L ;将上述体系中的材料依次加入商用PCR管(规格0.2mL或0.5mL)中，放入PCR仪中，设置PCR反应条件，开始反应。反应结束后，得到所需的18S rDNA序列。
[0017](3)序列测定与分析:将上述所得的序列送至测序公司测序，得到序列信息；在NCBI的GenBank数据库中下载用于比对和进化树分析的天南星科半夏属植物的18SrDNA序列，运用MEGA等分子信息分析软件对所得半夏样品18S rDNA序列和网上报道的序列进行比对分析，从而判断其进化关系与种属来源。
[0018]所述步骤(1)的“SDS与CTAB混合抽提液”是指SDS与CTAB的体积配比为1_10:
I;优选2:1或3:1或4:1。所述步骤(1)的“温水”是指30-100°C的水温，优选60-70°C。所述步骤(1)的“预热”时间为Ι-lOOmin,优选30_40min。[0019]所述步骤(2)的“引物18SF”的序列是指5' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3';所述步骤(2)的“引物 18SR” 的序列是指 5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
[0020]所述步骤(2)的“设置PCR反应条件”是指每个循环条件如下:94°C:l-5min ；55°C:IO-1OOs ；72°C:l-10min ;共 10-100 个循环。
[0021]所述步骤(3)的“天南星科半夏属植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌叶半夏(P.pedatisecta)、盾叶半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鹞落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂叶半夏(P.tripartita)。
[0022]本发明的方法具有快速有效、简单便捷、可操作性强等优点，能够准确鉴定半夏种属来源，对指导药农种植《中国药典》规定的半夏类药材具有重要意义。此外，通过确定道地半夏药材资源，为保护半夏种质多样性奠定理论基础，具有较大的应用价值。
[0023]下面将结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
[0024]实施例1:
选取两种湖北荆州地区的半夏HBB-01和HBD-02，如图1。分别取0.5g两种待测半夏样品的新鲜叶片组织，放入商用EP管(规格1.5mL)中；加入65°C温水预热后的体积配比为
2:1的SDS与CTAB混合抽提液1000 μ L，混摇5min ;用移液枪的枪头(规格200 μ L)伸入上述EP管底部，缓慢顺时针旋转挑取丝状粘稠物质，即所得基因组DNA，将其溶于50 μ L纯水中；取溶解后溶液3 μ L，进行1%琼脂糖电泳检测。建立PCR扩增体系共50 μ L，如下:纯水35 μ L，商用缓冲液5 μ L，18SF引物I μ L，18SR引物I μ L，上述所得DNA溶液稀释100倍作为模板2 μ L,商用dNTP 4 μ L,商用MgC12 1.5 μ L,商用rTaq酶0.5μ L。将上述体系中的材料依次加入商用PCR管(规格0.2mL)中，放入PCR仪中，设置PCR反应条件，每个循环条件如下:94°C:4min ；55°C:30s ；72°C:2min ;共35个循环，进行反应。反应结束后，得到所需的ISSrDNA序列片段。将上述所得的序列送至测序公司测序，得到序列信息；在NCBI的GenBank数据库中下载用于比对和进化树分析的天南星科半夏属植物的18SrDNA序列,运用MEGA等分子信息分析软件对所得半夏样品ISSrDNA序列和网上报道的序列进行比对分析，得出如下结论:HBB_01为半夏(Pinellia ternata),为《中国药典》中规定的半夏类药材品种；HBD-02为三裂叶半夏(P.tripartita)，为药用半夏的混淆品。
[0025]实施例2:
选取两种江苏南京地区的半夏NJ-01和NJ-02，如图2。分别取0.5g两种待测半夏样品的新鲜叶片组织，放入商用EP管(规格1.5mL)中；加入65°C温水预热后的体积配比为
3:1的SDS与CTAB混合抽提液1000 μ L，混摇5min ;用移液枪的枪头(规格200 μ L)伸入上述EP管底部，缓慢顺时针旋转挑取丝状粘稠物质，即所得基因组DNA，将其溶于50 μ L纯水中；取溶解后溶液3 μ L，进行1%琼脂糖电泳检测。建立PCR扩增体系共100 μ L，如下:纯水60 μ L，商用缓冲液10 μ L，18SF引物5 μ L，18SR引物5 μ L，上述所得DNA溶液稀释100倍作为模板5 μ L,商用dNTP 10 μ L,商用MgC12 3 μ L,商用rTaq酶2μ L。将上述体系中的材料依次加入商用PCR管(规格0.2mL)中，放入PCR仪中，设置PCR反应条件，每个循环条件如下:94°C:4min ；55°C:30s ；72°C:2min ;共35个循环，进行反应。反应结束后，得到所需的ISSrDNA序列片段。将上述所得的序列送至测序公司测序，得到序列信息；在NCBI的GenBank数据库中下载用于比对和进化树分析的天南星科半夏属植物的18SrDNA序列，运用MEGA等分子信息分析软件对所得半夏样品ISSrDNA序列和网上报道的序列进行比对分析，得出如下结论:NJ-01为半夏(Pinellia ternata),为《中国药典》中规定的半夏类药材品种；NJ_02为掌叶半夏(P.pedatisecta)，为药用半夏的伪品。
[0026]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
[0027]上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属【技术领域】普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
【权利要求】
1.一种鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)半夏基因组DNA的提取:选取一定量的待测半夏样品的新鲜叶片组织，放入离心管中；按每克叶片组织2000 μ L的比例加入温水预热后的适当体积配比的SDS与CTAB混合抽提液，混摇5min ;用移液枪的枪头伸入上述离心管底部，缓慢顺时针旋转挑取丝状粘稠物质，获得基因组DNA，将其溶于水中；取溶解后溶液适量，进行1%_2%琼脂糖电泳检测； (2)18SrDNA序列PCR扩增:将上述所得DNA溶液稀释50-100倍；准备植物18SPCR引物18SF和18SR ;如下建立PCR扩增体系共50-100 μ L:水20-500 μ L,缓冲液1-5 μ L, 18SF引物l-5yL，18SR引物1-5 μ L，上述稀释后的DNA溶液作为模板1-5μ L,dNTP 1-5μ L,MgC121-5 μ L，rTaq酶1-5 μ L ;将上述体系中的材料依次加入PCR管中，放入PCR仪中，设置PCR反应条件，开始反应，反应结束后，得到所需的18SrDNA序列； (3)序列测定与分析:将上述所得的序列进行测序，得到序列信息；在NCBI的GenBank数据库中下载用于比对和进化树分析的天南星科半夏属植物的ISSrDNA序列，运用分子信息分析软件对所得半夏样品ISSrDNA序列和网上报道的序列进行比对分析，从而判断其进化关系与种属来源。
2.根据权利要求1所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(1)的SDS与CTAB混合抽提液中SDS与CTAB的体积配比为1_10:1。
3.根据权利要求2所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(1)的SDS与CTAB混合抽提液中SDS与CTAB的体积配比为2:1或3:1或4:1。
4.根据权利要求1所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(1)的“温水预热”是指在30-100°C的水温下预热l-100min。
5.根据权利要求4所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(1)的“温水预热”是指在60-70°C的水温下预热30-40min。
6.根据权利要求1所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(2)的“引物18SF”的序列是指5 ' -CCTGGTTGATCCTGCCAG-3 ';“引物18SR”的序列是指5' -TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3'。
7.根据权利要求1所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR反应条件是指每个循环条件如下:94°C:l-5min ；55°C:10-100s ；72°C =1-1Omin ;共10-100个循环。
8.根据权利要求1所述的鉴别半夏品种资源的方法，其特征在于，步骤(3)的“天南星科半夏属植物”是指以下植物:滴水珠(Pinellia.cordata)、石蜘蛛(P.1ntegrifolia)、掌叶半夏(P.pedatisecta)、盾叶半夏(P.peltata)、半夏(P.ternata)、大半夏(P.polyghylla)、鹞落坪半夏(P.yaoluopingensis)、三裂叶半夏(P.tripartita)。
【文档编号】C12Q1/68GK104017892SQ201410280668
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】张文涛, 陈集双, 喻静, 蒋海侠, 宋莲, 张本厚 申请人:南京工业大学大丰海洋产业研究院