一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子影像应用领域，涉及近红外分子影像技术中基于点击化学的肿瘤 标记探针、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 分子影像技术在细胞分子水平上实现在体生理、病理的实时、无创、动态成像，可 用于研究活体内疾病或肿瘤的发生、发展及转移等过程，其中近红外荧光分子影像具有无 辐射、灵敏高、生物组织光损伤小等优点，在肿瘤在体监测研究领域中展现出巨大的潜力。 近红外荧光探针实现了目标组织的可视化示踪检测，是活体内光学分子影像成功的先决条 件。一般荧光探针利用病变基因、分子、组织等特异性因子(如核酸、多肽、蛋白质、抗体等） 与荧光物相偶联，使得荧光探针具有了特异靶向识别的功能，再将具有特异性功能的荧光 探针注射入活体体内，从而实现肿瘤的在体靶向监测。但是这种将染料与肿瘤特异分子直 接偶联的方法由于染料与特异性因子相互之间的干扰，一般存在特异性差的问题。
[0003] 点击化学（ClickChemistry)属于正交反应的一种（BioorthogonalChemistry)， 通过高效、高选择性的化学反应来完成模块化的骨架连接，直接点击模块构建各类新化合 物的组合化学新方法，具有如下几个特征：（1)符合绿色化学，原料易得、产率高、立体选择 性好、易纯化、副产物对环境友好；（2)反应快速、高通量模块化合成，例如无铜点击化学-四 嗪和环辛烯衍生物的反应速率常数大约为210-2,800,0001^84(?83,37°〇;(3)反应条件 温和，对水、温度、氧不敏感，可以在生理条件下进行；（4)其反应模块几乎不与生物分子反 应，不干扰细胞正常的生理功能。因此，点击化学能成为生物化学和药物研究等领域的研究 热点。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术不足，本发明旨在提供一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方 法及其应用，肿瘤标记探针包括分别带有肿瘤特异性因子和荧光标记的点击反应模块，应 用时将特异因子预靶向肿瘤组织后，利用点击化学高选择性、高效、快速的反应特点，再标 记荧光物质，避免荧光物质与特异因子之间的相互干扰，解决现有肿瘤标记探针或方法特 异性差的问题，并有效降低肝肾等对探针或药物的代谢清除，从而提高探针的生物利用度 和监测灵敏度。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0000] -种基于点击化学的肿瘤标记探针，包括肿瘤特异因子点击反应模块TC0-TL以及 荧光标记点击反应模块Tz-FL，两个模块可通过点击化学反应快速结合;TC0-TL和Tz-FL的 结构式如下：
[0009]其中，TC0为含环辛烯基团类化合物，TL为肿瘤特异性因子;Tz为含四嗪基团类化 合物，FL为荧光标记物；
[0010] TC0-TL和Tz-FL通过点击化学反应结合后的结构式如下：
[0012]需要说明的是，荧光标记物FL可选自花菁染料、罗丹明染料、荧光素染料或量子 点。
[0013]需要说明的是，肿瘤特异性因子TL可选自核酸、多肽、蛋白、酶、糖类、抗体、单克隆 抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
[0014] 作为优选，所述Tz为(苄胺-4-基)-3-四嗪。
[0015]作为优选，所述TC0为5-琥珀酰亚胺酯环辛烯。
[0016]上述基于点击化学的肿瘤标记探针的制备方法，包括步骤:利用肿瘤特异性因子 TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TC0的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应 模块TC0-TL，利用含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光标记物FL的活化羧基反应，得 到荧光标记点击反应模块Tz-FL。
[0017]需要说明的是，利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TC0 的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应模块TC0-TL的具体方法为：
[0018] 将TC0-NHS溶于DMS0中，加入溶于TL肽的DMS0溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜 反应，然后用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到粉末状固体TC0-TL，真空干燥， 低温保存。
[0019] 需要说明的是，含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光物质FL的活化羧基反 应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL的方法如下：
[0020] 取FL，加入DIC和NHS，反应溶剂选用DMS0，于室温条件下避光搅拌，反相TLC监测； 反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到固体，真空干燥，得到产物 FL-NHS;然后取FL-NHS溶于DMS0中，加入溶解有Tz的DMS0溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过 夜，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到Tz-FL固体，真空干燥，低 温保存。
[0021] 上述基于点击化学的肿瘤标记探针可在肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像进 行应用。
[0022]需要说明的是，应用包括如下步骤:先将肿瘤特异因子点击反应模块TC0-TL提前 注射入活体体内或体外活细胞中，让革G分子充分革E1向目标组织或细胞，再将荧光标记点击 反应模块Tz-FL注射入活体体内或体外活细胞中，利用TC0和Tz之间的点击化学反应，从而 使荧光物质快速偶联于肿瘤特异性因子上，然后利用成像技术进行成像。
[0023]本发明的有益效果在于:提供了一种包括带肿瘤特异性因子的点击反应模块和带 荧光标记的点击反应模块的肿瘤标记探针，两个点击反应模块之间可以通过点击反应快速 结合，利用该肿瘤标记探针进行肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像，将特异因子预靶向 肿瘤组织或细胞后，利用点击化学高选择性、高效、快速的反应特点再标记荧光物质，可避 免荧光物质与特异因子之间的相互干扰，可有效实现肿瘤组织或细胞的在体监测或体外标 记，有效降低肝肾等对探针或药物的代谢清除，从而提高探针的生物利用度和监测灵敏度。
【附图说明】
[0024]图1为基于TCO/Tz点击化学反应的肿瘤标记探针原理；
[0025] 图2为探针A、B、C对SGC7901细胞标记荧光成像图，A为实验组TC0-RGD/Tz-Cy5.5，B 为对照组RGD/Tz-Cy5.5，C为对照组Cy5.5-RGD;
[0026] 图3为探针D、E、F对SGC7901细胞标记荧光成像图，D为实验组TCO-GEBPll/Tz-Cy5 · 5，E为对照组GEBP11/Tz-Cy5 · 5，F为对照组Cy5 · 5-GEBP11;
[0027] 图4是探针D、E、F的在体成像，D为实验组TCO-GEBP11 /Tz-Cy5.5，E为对照组 GEBP11/Tz-Cy5 · 5，F为对照组Cy5 · 5-GEBP11。
【具体实施方式】
[0028] 以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方 案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实 施例。
[0029] 一种基于点击化学的肿瘤标记探针，包括肿瘤特异因子点击反应模块TC0-TL以及 荧光标记点击反应模块Tz-FL，两个模块可通过点击化学反应快速结合，反应原理如图1所 示。TC0-TL和Tz-FL的结构式如下：
[0032] 其中，TC0为含环辛烯基团类化合物，TL为肿瘤特异性因子;Tz为含四嗪基团类化 合物;FL为荧光标记物；
[0033] TC0-TL和Tz-FL通过点击化学反应结合后的结构式为：
[0035]进一步地，荧光标记物FL可选自花菁染料、罗丹明染料、荧光素染料或量子点，如 Cy3、Cy5、Cy5·5、Cy7、ICG、ICG-Der-01、ICG-Der-02、ICG-Der-03、IR820、A1exaFluor750、 AlexaFluor700、AlexaFluor680、AlexaFluor660、AlexaFluor647、AlexaFluor 635、AlexaFluor633、AlexaFluor610、AlexaFluor594、AlexaFluor568、Alexa Fluor555、AlexaFluor546、AlexaFluor532、AlexaFluor514、AlexaFluor500、 AlexaFluor488、FITC等。
[0036] 进一步地，肿瘤特异性因子TL可选自核酸、多肽、蛋白、酶、糖类、抗体、单克隆抗 体、双特异性抗体或多特异性抗体。包括RGD、RGDS、GRGES、GRGDS、GRGDNP、c(RGDfC)、c (RADfC)、c(RADfV)、c(RGDyC)、c(RGEfK)、c(RGDyE)、c(RGDfE)、c(RGDfK)、c(RADfK)、c (R⑶fV)、c(RADyK)、E[c(RGDfK)]2、E[c(RGDyK)]2、GXl、GEBPll、TPS、CA15-3、CEA、CA125、 CA153、CA199、CA724、NSE、PSA、CA242、0-HCG、PSA、G3BP、AFP、AFP-L3、DCP、AFU、Flt-l、KDR、 Flt-4、NP-l、NP-2、pHLIP、T7、T12、MMPs、SF等。
[0037] 作为优选，所述Tz为(苄胺-4-基)-3-四嗪。
[0038]作为优选，所述TC0为5-琥珀酰亚胺酯环辛烯。
[0039]实施例1
[0040]肿瘤特异因子点击反应模块TC0-RGD的制备：
[0041]将TC0-NHS0.64mg溶于 128yLDMS0中于2mLEP管，加入溶于 1.5mgR⑶肽的DMS0 溶液70yL，再加入2yLTEA，室温避光搅拌过夜反应（12h)，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方 法纯化分离得到白色粉末状固体TC0-RGD，真空干燥，低温保存。T⑶-NHS是商品级的，也可 以通过以下方法制得:取TC0，加入DIC和NHS，反应溶剂选用DCM，于室温条件下避光搅拌， HPLC监测；反应结束后，用乙醚析出产物的方法纯化分离得到固体，真空干燥，得到产物 TC0-NHS〇 [0042]实施例2
[0043]肿瘤特异因子点击反应模块TC0-GEBP11的制备：
[0044] 将TC0-NHS0.5mg溶于50yLDMS0中于2mLEP管，加入溶解有2mgGEBP11 肽的DMS0 溶液250yL，再加入4yLTEA，室温避光搅拌过夜反应（12h)，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的 方法纯化分离得到白色粉末状固体TC0-GEBP11，真空干燥，低温保存。
[0045] 实施例3
[0046] 荧光标记点击反应模块Tz-Cy5.5的制备：
[0047] 取lmgCy5.5于2mL的EP管中，加入7yLDIC，4.6mgNHS(Cy5.5:DIC:NHS的摩尔投 料比为1:40:40)，反应溶剂选用DMS0 500yL，于室温条件下避光搅拌6h，反相TLC监测。反应 结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到蓝色固体，真空干燥，得到产物 Cy5.5-NHS〇
[0048]取Cy5.5-NHS0.5mg溶于300yLDMSO中于2mLEP管中，加入溶解有0.28mgTz的 DMS0溶液28yL，再加入4yLTEA(Cy5.5-NHS:Tz的摩尔投料比为1:3)，室温避光搅拌过夜 (12h)，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到蓝色固体，真空干燥， 低温保存。
[0049] 实施例4
[0050] 荧光标记点击反应模块Tz-ICG的制备：
[0051]取lmgICG于2mL的EP管中，加入8.5yLDIC，6.3mgNHS(ICG:DIC:NHS的摩尔投料 比为1:40:40)，加入反应溶剂DMS0/DCM( 170yL/180yL)，于室温条件下避光搅拌4h，反相TLC 监测。反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到绿色固体，真空干燥， 得到