用合成探针标记融合蛋白的制作方法

专利名称：用合成探针标记融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及将标记从底物转移到融合蛋白的方法，所述融合蛋
白具有特定设计来接受所述标记的蛋白质部分；新的特异性底物以及新的蛋白质，其接受适合于这种方法的特异性底物的标记。
背景技术：
对于改良的标记技术存在持续需求，所述标记技术允许特异性地标记目标蛋白质以便在体外或体内条件下分离和/或跟踪这些目标蛋白质。 一个具体的方法公开在WO 02/083937中，其描述了一种检测和域操纵目标蛋白的方法，其中该蛋白质被融合于0、烷基鸟嘌呤-DNA垸基转移酶(AGT)并且该AGT融合蛋白与携带标记的特异性AGT底物接触，由此该标记被转移到该融合蛋白。该AGT融合蛋白然后利用该标记进行检测并且任选地进一步进行操纵。野生型AGT的几种突变体显示出比野生型AGT( WO 2004/031404; Juillerat, A.等，Chem. Biol.10:313-317， 2003; Gronemeyer， T.等，Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316，2006)更适合于这种标记方法，并且宽范围的取代苄基鸟嘌呤和相关的杂芳基甲基鸟嘌呤化合物被描述用于将标记转移到包含AGT和AGT突变体的融合蛋白(WO 2004/031405)。简单的02-苄基-胞嘧啶是已知的。Freccero, M.等，J. Am. Chem.Soc. 125:3544-3553, 2003通过胞嘧啶与邻醌甲基化物(o-quinonemethide)的反应获得02-邻羟基苄基胞嘧啶。Ward, A.D,和Baker, B. R.,J. Med. Chem. 20:88-92, 1977描述了从2-氯-4-氨基嘧啶与苄醇的钠盐获得的02-苄基胞嘧啶。

发明内容
本发明涉及被称为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的新蛋白质，其衍生自0、烷基鸟嘌呤-DNA垸基转移酶；以及涉及ACT的底物，其特异性地将标记转移到这些ACT以及转移到包含这类ACT的融合蛋白。根据本发明的底物是式(I)的取代胞嘧啶，
其中，
R,是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH2-的任选取代的不饱和烃基、环烃基或杂环基；R2是连接体；并且
L是一个标记或多个相同或不同的标记。本发明进一步涉及将标记从这些式(I)底物转移到烷基胞嘧啶转移酶(ACT)和ACT融合蛋白的方法。


SI:包含AGT和ACT的融合蛋白的体外双重标记实验，其利用携带荧光标记的特异性底物苄基鸟嘌呤(BG)和苄基胞嘧啶(BC)进行。实验如下进行用BGFL、 BGCy5、 BCFL、 BCCy5或者BGCy5/BCFL或BGFL/BCCy5的等摩尔混合物温育GST-ACT1和6xHis-NAGT的等摩尔混合物。荧光染料标记的蛋白质混合物通过SDS-PAGE进行分析，参见实施例12。GST-ACT1:ACT 1 (SEQIDNO:l)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。6xHis-AGT: NAGT(SEQIDNO:2)与短肽6xHis的融合蛋白。BGFL和BGCy5:分别用携带荧光素的连接体以及Cy5取代的苄基鸟嘌呤，参见Juillerat, A.等，Chem. Biol.10:313-317,2003，和化合物11 (实施例9) 。 BCFL:化合物5 (实施例4) 。 BCCy5:化合物IO (实施例8)。 利用携带荧光标记(FL)的底物苄基鸟嘌呤(BG)和
苄基胞嘧啶(BC)的ACTIO标记实验，证明对BC的选择性。温育不同时间后SDS凝胶实验的荧光读数被显示在上部，其
10对应于底部的图。从ACT形成的ACT-荧光素偶联物的百分比(％ ACT-FL)对温育时间(min)被显示。通过用BGFL或BCFL温育0.5 pM的GST-ACT10混合物进行该实验。GST-ACT10: ACT 10 (SEQ ID NO:12)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。BGFL禾卩BCFL:参 见图1的说明。发现的结合常数:kBc^ll30士150M"S";kBG 10M-'S-'。 [10] Ml:尿素诱导的ACT1、 ACT9和ACTIO解折叠。 [11]显示的是所形成的ACT-荧光素的百分比(％ACT-FL)。在O M尿素[(NH2)2CO]下所获得的值被设定为100%。蛋白质(0.5 一)在 添加有尿素(O至8M)的动力学缓冲液(kinetic buffer) (50 mM HEPES， pH7.2， 1 mMDTT)中温育30分钟。然后该溶液被调节至20 BCFL 并且温育2小时。样品然后在SDS缓冲液中在95'C下沸腾5分钟(min)。 荧光素染料标记的蛋白质混合物通过SDS-PAGE进行分析。该数据组 用Y= 100/(1 +10、(1(^(:1/200'扭1151(^6))进行拟合，以得到半解折叠尿 素浓度C1/2。对于不同突变体，发现下列Cl/2值ACT1 2.8±0.1 M; ACT9 4.1 ±0.1 M; ACTIO 5.1±0.2 M。
具体实施例方式本发明涉及称为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的新蛋白质，其衍生 自0、垸基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，特别适合于从式(I)底物转移标记。垸基胞嘧啶转移酶(ACT)被定义为这样的蛋白质(a)由170 至220个氨基酸，优选175至l卯个氨基酸，最优选177至185个氨 基酸组成；(b)包含至少一个半胱氨酸；(c)与02-苄基胞嘧啶进行反 应，由此至少与在相同条件下与06-苄基鸟嘌呤的反应一样快地将苄基 取代基转移至(b)的半胱氨酸的巯基官能上。本发明的ACT在基于AGT的噬菌体展示的定向进化方法中 从编码AGT的DNA加以制备。作为基于噬菌体展示的定向进化的起 始点，编码突变体NAGT ( SEQ ID NO:2， Gronemeyer, T.等，Protein Eng. Des.Sel. 19:309-316,2006)的DNA被使用。WAGT对苄基鸟嘌呤衍生 物所展示出的活性比野生型""AGT (Juillerat， A.等，Chem. Biol. 10:313-317, 2003)高大约50倍并且它本身已经通过利用噬菌体展示的 定向进化和苄基鸟嘌呤底物获得。残基Tyrll4、Lysl31、Serl35、Va1148、Glyl56、 Glyl57、 Glul59的密码子经由饱和诱变被随机化。噬菌粒 pAK100中的转化产生107个独立克隆的突变体AGT文库。为了选择， 噬菌体文库与作为底物的BCFL——携带荧光素的苄基胞嘧啶(化合物 5)——温育，以标记与苄基胞嘧啶进行反应的突变体。这允许随后通 过利用覆盖有抗荧光素抗体的磁珠富集相应的噬菌体。经过6轮对 BCFL活性的筛选后，克隆ACT1至克隆ACT8通过DNA测序进行分 析(表l，以单字码显示的氨基酸)。在随后的测试中，明显的是，来 自克隆ACT1至克隆ACT8的蛋白质对4 M尿素变性仅显示有限的稳 定性。为了改善这一点，对同一文库进行再筛选。来自最佳分离的克 隆的蛋白质被列为ACT9并且在4 M尿素中显示出良好的稳定性，但 是对苄基胞嘧啶具有有限的反应性。接着，如下获得ACTIO:通过编 码ACT9的DNA的易错PCR，接着进行随后的噬菌体选择，这导致残 基Met60Ile、 Alal21Val和Leul53Ser进一步的修饰，作为具有高反应 性和对尿素变性的高稳定性的ACT变体。所述克隆被表达并且所述蛋 白质被纯化为谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白。对苄基胞嘧啶具有特异性的这10种蛋白质被称为烷基胞嘧 啶转移酶(ACT) I至IO，并且是本发明的主题。在本发明中考虑的另外的蛋白质是
-ACT,其是ACT1至8的同源物并且在除了位置114、 131、 135、 148、 157和159之外的位置上的一个、两个或三个氨基酸不同于ACT l至8;以及
-ACT,其是ACT1至10的同源物并且在除了位置60、 114、 121、 131、 135、 148、 153、 157和159之外的位置上的一个、两个或三个氨 基酸不同于ACTl至lO。也被考虑在内的是ACT1(SEQIDN0 1)的类似物，其中，
位置114上的氨基酸为A、 E、 N、 R或S;
位置131上的氨基酸为N、 S、 T或V;
位置135上的氨基酸为D、 N或T;
位置148上的氨基酸为D、 E或Q;
位置157上的氨基酸为A、 G、 L、 T、 P或W;和
位置159上的氨基酸为E、 F、 M、 R或S。[18]同样被考虑在内的是ACT10(SEQIDNO 12)的类似物，其中，
位置60上的氨基酸为M或I;
位置114上的氨基酸为A、 E、 N、 R或S;
位置121上的氨基酸为A或V;
位置131上的氨基酸为N、 S、 T或V;
位置135上的氨基酸为D、 N或T;
位置148上的氨基酸为D、 E、 Q或V;
位置153上的氨基酸为L或S;
位置157上的氨基酸为A、 G、 L、 T、 P或W;和
位置159上的氨基酸为E、 F、 M、 R、 S或L。优选被称为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)l、 2、 7、 8和10的蛋 白质。特别优选具有在SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列的蛋白质 ACTIO。还优选ACTIO的同源物，其在除了位置60、 114、 121、 131、 135、 148、 153、 157和159之外的位置上的一个氨基酸上与ACTIO 不同。表1. NAGT和ACT 1至10的氨基酸序列
60 114 121 131 135 148 153157 159 NAGTMYAKSVLGE SECJIDNO:2本发明进一步涉及产生烷基胞嘧啶转移酶的方法，其特征在
于编码AGT或ACT的DNA在可达10个的氨基酸位置上通过饱和
诱变被随机化，所获得的文库被转化到合适的噬菌粒中，期望的噬菌 体通过与携带标记的苄基胞嘧啶反应进行选择，然后，所述标记转移 到其上的噬菌体采用覆盖有针对所述标记的抗体的磁珠进行分离。本 发明也涉及这种定向进化方法的产物。
ACT1 ACT2 ACT3 ACT4 ACT5 ACT6 ACT7 ACT8 ACT9 ACTIO
SEQ ID NO:l
SEQ ID NO: 12
MRESEERFFIJ
GWPAKELTPP
EQDEEEQEVV
DDTDSADNDD
SVTNTRVNNN
AAAAAAAAAV
RASNAESEEE
MMMMMMMMMI
13[22]饱和诱变在本领域中是己知的并且例如如Dube, D. K.和Loeb， L. A., Biochemistry, 28:5703-5707， 1989所述进行。采用噬菌体和噬菌粒的定向进化方法也是众所周知的，并且 被描述在例如Smith, G. P.和Petrenko, V.A., Chem. Rev. 97:391-410， 1997; Hoess， R. H. et al.， Chem. Rev. 101 :3205-3218， 2001中。优选的方 法在系统中利用噬菌粒pAKlOO，如Krebber， A.， Bornhauser, S.， Burmester， J.， Honegger， A.， Willuda， J.， Bosshard， H. R. and Pltickthun, A., J. Immunol. Methods 201 :35-55， 1997所述。适合于选择期望克隆的化合物是如式(I)所描述并且是本发明 主题的底物，尤其是其中R,是对位取代苯基的式(I)底物。被转移到期 望ACT的这种底物的标记可以是其抗体容易获得的任何标记，并且不 限于荧光染料标记或任何其它光谱标记。利用携带抗特定标记的抗体的磁珠进行分离在本领域中也是 众所周知的，并且被描述在例如Gronemeyer等，Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316, 2006中。在进一步的方面，本发明涉及式(I)化合物，
其中，是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH2-的任选取 代的不饱和烃基、环烃基或杂环基； R2是连接体；并且
L是一个标记或多个相同或不同的标记。
作为芳族基的R,优选是苯基或萘基，尤其是苯基，例如在对位或
间位被R2取代的苯基。杂芳族基R,是单环或双环杂芳基，其包括零个、 一个、两个、 三个或四个环氮原子以及零个或一个氧原子以及零个或一个硫原子， 条件是至少一个环原子是氮、氧或硫原子，并且其具有5个至12个环 原子，优选5个或6个环原子；并且其除了携带取代基R2外可以未被取代或者被一个或多个尤其是一个选自下列的另外的取代基取代低 碳烷基，如甲基；低碳烷氧基，如甲氧基或乙氧基；卤素，如氯、溴 或氟；卤代低碳垸基，如三氟甲基；或羟基。优选地，单环或双环杂芳基R,选自2H-吡咯基、吡咯基、咪 唑基、苯并咪唑基、吡唑基、刚唑基、嘌呤基、吡啶基、吡嗪基、嘧 啶基、哒嗪基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基(quinolyl)、 2,3-二氮杂 萘基、1,5-二氮杂萘基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹啉基(quinolinyl)、蝶 啶基、中氮茚基(indolizinyl) 、 3H-吲哚基、吲哚基、异吲哚基、瞎唑 基、异離唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、呋咱基(fUrazanyl)、 苯并[d]-吡唑基、噻吩基和呋喃基。更优选地，单环或双环杂芳基选自 吡咯基；咪唑基，如1 H-咪唑-l-基；苯并咪唑基，如l-苯并咪唑基； n引唑基，尤其是5』引唑基；吡啶基，例如2-、 3-或4-吡啶基；嘧啶基， 尤其是2-嘧啶基；吡嗪基；异喹啉基，尤其是3-异喹啉基；喹啉基， 尤其是4-或8-喹啉基；吲哚基，尤其是3-吲哚基；噻唑基；三唑基； 四唑基；苯并[d]-吡唑基；噻吩基；和呋喃基。在本发明的特别优选的实施方式中，杂芳基R,是噻吩基，尤 其是2-噻吩基，其在3-、 4-或5-位上，优选在4-位上，携带另外的取 代基R2;或者是3-噻吩基，其在4-位上携带另外的取代基R2。任选取代的不饱和烃基R,是l-烯基，其在l-或2-位上，优选 在2-位上携带另外的取代基R2，或者l-炔基。被考虑在l-烯基中的取 代基是例如低碳垸基，如甲基；低碳烷氧基，如甲氧基；低碳酰氧基， 如乙酰氧基；或卤代基，如氯代基。在本发明特别优选的实施方式中， &是l-炔基。任选取代的不饱和环烃基是在1-位上不饱和的、具有5至7 个碳原子的环烯基，例如1-环戊烯基或l-环己烯基，其在任何位置上 携带另外的取代基R2。被考虑的取代基是例如低碳烷基，如甲基；低 碳烷氧基，如甲氧基；低碳酰氧基，如乙酰氧基；或卤代基，如氯代 基。任选取代的不饱和杂环基具有3至12个原子，1至5个选自 氮、氧和硫的杂原子，以及在将该杂环基与OCHr中的亚甲基连接的 位置上的双键。被考虑的取代基是例如低碳垸基，如甲基；低碳烷氧
15基，如甲氧基；低碳酰氧基，如乙酰氧基；或卤代基，如氯代基。特别地，任选取代的不饱和杂环基是部分饱和的杂芳族基， 如上文对于杂芳族基&所定义。这种杂环基的实例是异隨唑垸基，尤 其是3-异嗯唑烷基，其在5-位上携带另外的取代基；或者5-异螺唑烷 基，其在3-位置上携带另外的取代基。连接体基团R2优选是柔性连接体，其将标记L或多个相同或 不同的标记L连接于底物。在预想的应用的背景下，即在将底物转移 到包含ACT的融合蛋白的背景下，选择连接体单元。它们也增加了所 述底物在适当的溶剂中的溶解性。所用的连接体在实际应用的条件下 是化学稳定的。所述连接体既不干扰与ACT的反应也不干扰标记L的 检测，但是可被构造以便在式(I)化合物与包含ACT的融合蛋白反应之 后及时在某一点被切割。连接体R2是具有1至300个碳原子的直链或支链亚烃基，其 中任选地
(a) —个或多个碳原子被氧置换，特别地，其中每隔两个碳原子被 氧置换，例如具有1至100个乙烯氧基单元的聚乙烯氧基；
(b) —个或多个碳原子被携带氢原子的氮置换，并且相邻的碳原子 被氧代(oxo)取代，其代表酰胺官能-NH-CO-;
(c) 一个或多个碳原子被氧置换并且相邻的碳原子被氧代取代，其 代表酯官能-O-CO-;
(d) 两个相邻碳原子之间的键是双键或三键，其代表官能-chk:h-
或-C三C-;
(e) —个或多个碳原子被下列基团置换亚苯基、饱和或不饱和的 亚环烃基、饱和或不饱和亚双环烃基、桥连杂芳基或者桥连饱和或不 饱和杂环基；
(f) 两个相邻碳原子被下列置换二硫键-S-S-; 或者两个或多个、尤其是两个或三个亚烃基和/或上文(a)至(f)所定
义的改性亚烃基的组合，其任选地含有取代基。所考虑的取代基是例如低碳垸基，如甲基；低碳烷氧基，如 甲氧基；低碳酰氧基，如乙酰氧基；或卤代基，如氯代基。考虑的另外的取代基是例如当a-氨基酸，特别是天然存在的a-氨基酸被掺入连接体R2时获得的那些取代基，在所述连接体R2中碳 原子被酰胺官能-NH-CO-置换，如(b)所定义。在这种连接体中，亚烃 基R2的部分碳链被基团-(NH-CHR-COV置换，其中n在1至100之间 并且R代表cx-氨基酸的不同残基。另外的取代基是产生可光致断裂连接体R2的取代基，如邻硝 基苯基。特别地，该取代基邻硝基苯基位于与酰胺键相邻的碳原子上， 例如在基团-NH-CO-CH2-CH(邻硝基苯基)-NH-CO-中与酰胺键相邻的 碳原子上，或者作为聚乙二醇链中的取代基，例如在基团-0-CH2-CH(邻 硝基苯基)-O-中。考虑的其它可光致断裂连接体是例如苯甲酰甲基、烷 氧基苯偶姻(alkoxybenzoin)、苄硫醚和新戊酰二醇(pivaloyl glycol) 衍生物。如上文(e)所定义的置换碳原子的亚苯基是例如1，2-、 1，3-或优 选1，4-亚苯基。在具体的实施方式中，亚苯基进一步被硝基取代并且与 如上面(a)、 (b)、 (c)、 (d)和(f)所提及的其它置换相组合；代表可光致断 裂基团；并且例如是4-硝基-l,3-亚苯基，如在-CO-NH-CH2-4-硝基-l,3-亚苯基-CH(CH3)-0-CO-中的4-硝基-l,3-亚苯基，或者是2-甲氧基-5-硝 基-l，4-亚苯基，如在-012-0-2-甲氧基-5-硝基-1，4-亚苯基-01(013)-0-中的2-甲氧基-5-硝基-l,4-亚苯基。代表可光致断裂连接体的其它具体 实施方式是例如-1 ，4-亚苯基-CO-CH2-0-CO-CH2-(苯甲酰甲基)、-1,4-亚 苯基-CH(OR)-CO-l，4-亚苯基-(烷氧基苯偶姻)或者-3，5-二甲氧基-l+亚 苯基-CH2-0-(二甲氧基苄基部分)。如上文(e)所定义的置换碳原子的饱 和或不饱和亚环烃基衍生自具有3至7个碳原子的环垸基，优选地衍 生自环戊基或环己基，并且例如是1，2-或1,3-亚环戊基；1,2-、 1,3-或优 选1,4-亚环己基；或者也可以是例如在1-或2-位上不饱和的1,4-亚环己 基。如上文(e)所定义的置换碳原子的饱和或不饱和亚双环烃基衍生自 具有7个或8个碳原子的双环烷基，并且例如是双环[2.2.1]庚烯或双环 [2.2.2]辛烯，优选1，4-双环[2.2，1]庚烯，其任选地在2-位上不饱和或者 在2-和5-位上双重不饱和；以及1，4-双环[2.2.2]辛烯，其任选地在2-位上不饱和或者在2-和5-位上双重不饱和。如上文(e)所定义的置换碳 原子的桥连杂芳族基例如是亚三唑烷基(triazolidene)，优选1，4-亚三唑 烷基，或者是亚异嗯唑烷基(isoxazolidene)，优选3，5-亚异瞎、唑烷基。如上文(e)所定义的置换碳原子的桥连饱和或不饱和杂环基例如衍生自 如上面r,中所定义的不饱和杂环基，例如亚异瞎唑烷基(isoxazolidene)， 优选3，5-亚异嗯唑垸基，或者全饱和杂环基，其具有3至12个原子， 其中的1至3个是选自氮、氧和硫的杂原子，例如吡咯烷二基 (pyrrolidinediyl)、哌啶二基、四氢呋喃二基、二嗯烷二基、吗啉二基或 四氢噻吩二基，优选2，5-四氢呋喃二基或2,5-二隨烷二基。考虑的具体 杂环基是糖部分，例如a-或p-呋喃糖基或者oi-或卩-吡喃糖基部分。连接体r2中的环亚结构降低了分子柔性，如通过r2内可旋 转键的数目所测定，其导致更好的膜渗透速率，这对于所有体内标记 应用来说是重要的。连接体R2优选是具有1至25个碳原子的直链亚烃基或者具 有4至100个乙烯氧基单元的直链聚乙二醇基团，其任选地通过
《11=(:11-或~(:^:-基团连接于基团r,。进一步优选的是具有i至25个
碳原子的直链亚烃基，其中碳原子任选地被酰胺官能-nh-co-置换，并 且任选地携带可光致断裂亚单元，例如邻硝基苯基。进一步优选的是 支链连接体，其包括具有3至6个乙二醇单元的聚乙二醇基团以及其 中碳原子被酰胺键置换的亚烃基，并且进一步携带取代的氨基和羟基 官能。其它优选的支链连接体具有树枝状(树状)结构，其中胺、酰 胺和/或醚官能置换亚烃基的碳原子。特别优选的连接体r2是具有2至20个碳原子的直链亚烃基， 其中一个或两个碳原子被氮置换并且所述直链亚烃基在与所述氮相邻 处任选地被氧代(oxo)取代。另一特别优选的连接体R2是具有10至40个碳原子的直链亚 烃基，其任选地被氧代取代，其中3至12个碳原子被氧置换并且一个 或两个碳原子被氮置换，任选地在氮相邻处被氧代取代。连接体R2可携带一个或多个相同或不同的标记，例如1至100 个相同或不同的标记，特别是1至5个，优选一个、两个或三个，特 别是一个或两个相同或不同的标记。低碳烷基是具有1至7个、优选1至4个c原子的烷基，并 且是直链的或支链的，优选地，低碳烷基是丁基，如正丁基、仲丁基、 异丁基、叔丁基，丙基，如正丙基或异丙基，乙基或甲基。更优选地，
18低碳烷基是甲基。在低碳烷氧基中，低碳烷基如上文所定义。低碳垸氧基优选 指正丁氧基、叔丁氧基、异丙氧基、乙氧基或甲氧基，特别是甲氧基。在低碳酰氧基中，低碳酰基具有甲酰或低碳烷基羰基的含义， 其中低碳烷基如上文所定义。低碳酰氧基优选指正丁酰氧基、正丙酰 氧基、异丙酰氧基、乙酰氧基或甲酰氧基，特别是乙酰氧基。卤素是氟、氯、溴或碘，特别是氯。底物的标记L可以由本领域技术人员根据融合蛋白所预期的 应用进行选择。标记使得携带标记L的标记融合蛋白容易进行检测或 者与其环境分离。考虑的其它标记是那些能够感应并诱导标记融合蛋 白和/或底物的环境变化的标记；或者这样的标记，其由于底物的物理 和/或化学特性而有助于操纵融合蛋白并且被特异引入所述融合蛋白。 在本发明的上下文中所理解的标记是这样的取代基，其不同于氢或标 准官能团，特别是不同于氢、羟基、氨基、卤素、羧酸酯、酰胺、羧 酸酯、腈、氰酸酯、异氰酸酯、磺酸酯、磺酰胺、磺酸酯、醛、酮、 醚和硫醚取代基。标记的实例包括光谱探针例如荧光团或生色团、磁探针或造
影剂；放射性标记分子；这样的分子，其是能特异性地与配偶体结合 的特异性结合对的一部分；被认为与其它生物分子相互作用的分子； 被认为与其它生物分子相互作用的分子文库；能交联到其它分子上的 分子；在暴露于11202和抗坏血酸盐后能产生羟基的分子，如系留金属 螯合物(tethered metal-chdate);在光照射后能产生反应性基团的分子， 例如孔雀绿；共价连接于固相支持体的分子，其中所述支持体可以是 载玻片、微量滴定板或本领域技术人员所知的任何聚合物；核酸或其 衍生物，其能与其互补链进行碱基配对；脂质或其它疏水性分子，具 有膜插入特性；具有期望的酶促性质、化学性质或物理性质的生物分 子；或者具有上述所列任何特性的组合的分子。另外的标记L是带正电荷的线性或支化聚合物，其已知促进 所连接的分子在活细胞质膜上的转移。这对于这样的底物特别重要， 所述底物另外具有低的细胞膜渗透性或者对活细胞的细胞膜实际上是 不可渗透的。非细胞可渗透的ACT底物在与这种基团L偶联后将变成细胞可渗透。这种细胞膜转运增强基团L包括，例如，具有6-15个精 氨酸残基的D-和/或L-精氨酸的线性聚(精氨酸)；具有6-15个亚单 元的线性聚合物，所述亚单元每个都携带胍盐基团；具有6至高达50 个亚单元的低聚物或短长度聚合物，其一部分已连接胍盐基团；和/或 HIV-tat蛋白质的序列的部分，特别是亚基Tat49-Tat57 (以一字母氨基 酸码表示为RKKRRQRRR)。 ACT底物通过如上文所定义的连接体R2 共价连接于该基团L，其优选在活细胞内是不稳定的并且可以被降解， 例如通过被细胞内酯酶断裂酯基R2而降解，这直接导致或者在由酯官 能的断裂所引起的进一步反应中导致ACT底物与增强细胞膜渗透性的 单元L的分离。优选作为标记L的是光谱探针，以及这样的分子，其是能特 异性地与配偶体结合的特异性结合对的一部分，即所谓的亲和标记。 还优选作为标记L的是共价连接于固相支持体的分子。优选的光谱探 针是荧光团。当标记L是荧光团、生色团、磁标记、放射性标记或类似物 时，检测通过适合于所述标记的标准方法进行并且不论该方法被体外 或体内应用。如果L是荧光团，则该方法可以与绿色荧光蛋白(GFP) 的应用相媲美，所述绿色荧光蛋白被基因融合于目标蛋白，并且允许 在活细胞中进行蛋白质研究。标记L的具体实例还是展示非线性光学 特性的硼化合物。特别优选的是这样的标记，其使得一个底物的L (L,) 是两个相互作用的光谱探针IVL2的一个成员并且另一底物的L(L。是 另一成员，其中能量可以在供体与受体(猝灭剂)之间当它们非常接 近时(小于10纳米的距离)通过动态淬灭或静态淬灭而非辐射地转移。 在携带的标记底物与ACT融合蛋白以及携带L2的另一种标记底物 (例如，苄基鸟嘌呤型)与另一相应的融合蛋白如AGT融合蛋白的反 应后，这种标记对L,/L2改变了其光谱特性。这种标记对L，/L2的实例 是下列详细解释的FRET对。考虑的具体荧光团是Alexa Fluor染料，其包括Alexa Fluor 350、488、532、546、555、635和647 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008， USA,还可参见Panchuk-Voloshina, N.等，J. Histochem. & Cytochem. 47:1179-1188， 1999);香豆素，例如7-二甲氨基-香豆素-4-乙酸(由
20Invitrogen Molecular Probes作为产品D374供应的琥珀酰亚胺酯)、7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸和7-二乙氨基-香豆素-3-甲酸；花青 (Cyanine)-3 (Cy3)、花青5 (Cy5)和花青5.5 (Cy5.5) (Amersham-GE Healthcare, Solingen，德国)；ATT0 488、 ATTO 532、 ATTO 600和 ATTO 655 (Atto-Tec， D57076 Siegen,德国)；DY-505、 DY-547、 DY-632 和DY-647 (Dyomics， Jena，德国)；以及5(6)-羧基荧光素和二氟-5(6)-羧基荧光素(Oregon Green)。式(I)底物上的这些特定标记可以与已知的 AGT-苄基鸟嘌呤系统进行组合，其中苄基鸟嘌呤上的标记是猝灭剂， 其与在与ACT反应的式(I)底物上的荧光团形成FRET对。这种猝灭剂 是QSY35、 QSY 9和QSY 21 (Invitrogen Molecular Probes); BHQ-1、 BHQ-2和BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA 94949， USA 的Black Hole Quencher ); ATTO 540Q和ATTO 612Q (Atto-Tec， D57076 Siegen,德国)；4-二甲氨基-偶氮苯-4'-磺酰基衍生物(Dabsyl)以 及4-二甲氨基偶氮苯-4'-羰基衍生物(Dabcyl)。取决于标记L的特性，包含目标蛋白和ACT的融合蛋白可以 在与底物的反应后被结合于固相支持体上。与包含ACT的融合蛋白反 应的底物的标记L当开始与ACT反应时可以已经连接于固相支持体， 或者可以随后即转移到ACT之后被用于将标记的ACT融合蛋白连接 于固相支持体。所述标记可以是特定结合对的一个成员，所述特定结 合对的另一成员共价地或者通过任何其它方法连接于或可连接于所述 固相支持体。考虑的特定结合对例如是生物素和抗生素蛋白或链霉抗 生物素蛋白。所述结合对的任一成员可以是底物的标记L，另一个成员 被连接于所述固相支持体。允许方便地结合于固相支持体的标记的进 一步的例子是例如麦芽糖结合蛋白、糖蛋白、FLAG标签或者反应性取 代基，所述反应性取代基允许在这种取代基与固相支持体表面上的互 补官能团之间的化学选择性反应。反应性取代基与互补官能团的这种 配对的实例例如是胺和活性羧基，其形成酰胺；叠氮化物和丙炔酸衍 生物，其经历1，3-偶极环加成反应；胺和另一胺官能团，其与加入的活 化性双二羧酸衍生物类型的双官能连接体试剂反应，产生两个酰胺键; 或者本领域已知的其它组合。合适的固相支持体的实例例如是玻璃表面如载玻片、微量滴定板和合适的传感元件，尤其是官能化聚合物(例如以珠的形式)； 化学改性的氧化物表面，例如二氧化硅、五氧化钽或二氧化钛；或者 还有化学改性的金属表面，例如贵金属表面如金或银表面。然后，不 可逆地连接和/或点滴ACT底物可被用于以空间分辨的方式、尤其是通 过点滴将ACT融合蛋白连接在固相支持体上，形成蛋白质微阵列、 DNA微阵列或小分子阵列。当标记L在暴露于外部刺激物后能产生反应性基团例如羟基 时，则产生的基团可使ACT融合蛋白以及与该ACT融合蛋白非常接 近的那些蛋白质失活，这允许研究这些蛋白质的作用。这种标记的实 例是系留金属螯合物络合物，其经暴露于11202和抗坏血酸盐后产生羟 基；以及生色团例如孔雀绿，其经激光照射后产生羟基。声色团和激 光用于产生羟基作为声色团辅助性激光诱导失活(CALI)在本领域中 也是已知的。在本发明中，用携带作为标记L的生色团例如孔雀绿的 底物标记ACT融合蛋白以及随后的激光照射以时间控制和空间分辨的 方式使得标记的ACT融合蛋白以及与所述ACT融合蛋白相互作用的 那些蛋白质失活。该方法在体内或体外都可以被应用。此外，与该ACT 融合蛋白非常接近的蛋白质同样可以如下进行鉴别通过借助特异性 抗体检测该蛋白质的片段，通过在高分辨率二维电泳凝胶上那些蛋白 质的消失，或者通过经由分离和测序技术如质谱或借助N-端降解的蛋 白质测序来鉴定断裂的蛋白质片段。当标记L是可交联于其它蛋白质的分子，例如，含有官能团 如马来酰亚胺、活性酯或叠氮化物的分子以及本领域技术人员已知的 其它分子时，使这种标记ACT底物与ACT融合蛋白——所述ACT融 合蛋白与其它蛋白质相互作用——接触(体内或体外)，导致ACT融 合蛋白经由标记而与它的相互作用蛋白质发生共价交联。这允许鉴别 与ACT融合蛋白相互作用的蛋白质。光致交联用标记L例如是二苯甲 酮。在交联的特殊方面，标记L是本身为ACT底物的分子，这导致 ACT融合蛋白的二聚化。这种二聚体的化学结构可以是对称的(同型 二聚体)或非对称的(异型二聚体)。考虑的其它标记是例如富勒烯(fUllerenes);用于中子俘获 治疗(neutron capture treatment)的硼垸；核苷酸或低聚核苷酸，例如用于自寻址芯片；肽核酸；和金属螯合物，例如与DNA特异性结合的 铂螯合物。具有期望的酶促性质、化学性质或物理性质的具体生物分子 是氨甲喋呤。氨甲喋呤是酶二氢叶酸还原酶(DHFR)的紧密结合抑制 剂。其中L是氨甲喋呤的式(I)化合物属于众所周知的被称为"二聚化 化学诱导物(CID)"的类别。利用ACT与DNA结合结构域LexA的 融合蛋白以及将DHFR与转录激活结构域B42添加到用其中L是氨甲 喋呤的式(I)化合物体内标记ACT融合蛋白中，诱导了 ACT-LexA融合 蛋白与DHFR-B42融合蛋白的偶联("二聚化")，这导致LexA和 B42空间上接近以及随后的转录刺激。如果底物携带两种或多种标记，这些标记可以相同或不同。 具体的优选组合是两种不同的亲和标记，或者一种亲和标记和一种生 色团标记，尤其是一种亲和标记和一种荧光团标记，或者一对光谱相 互作用标记L,/L2，例如FRET对。优选式(I)化合物，其中R,是苯基，特别是对位取代的苯基。优选式(I)化合物，其中是L是光谱探针例如荧光团。同样优 选这样的化合物，其中L是代表特异性结合对的一部分的分子；以及 这样的化合物，其中L是共价连接于固相支持体的分子。最优选的是实施例中的化合物。本发明进一步涉及检测和/或操纵目标蛋白的方法，其中所述 目标蛋白被掺入ACT融合蛋白中，所述ACT融合蛋白与上文所述的 携带标记的式(I)化合物接触，并且所述ACT融合蛋白在设计来识别和 /或处理所述标记的系统中利用所述标记进行检测并且任选地被进一步 操纵。在本发明的方法中，目标蛋白或肽被融合于ACT。目标蛋白 或肽可以具有任何长度并且具有或不具有二级、三级或四级结构，并 且优选由至少12个氨基酸并可达2000个氨基酸组成。这种目标蛋白 或肽的实例例如是酶、DNA结合蛋白、转录调控蛋白、膜蛋白、核受 体蛋白、核定位信号蛋白、蛋白辅因子、小单体GTP酶、ATP结合盒 蛋白、胞内结构蛋白、具有负责将蛋白质靶向特定细胞区室的序列的 蛋白质、 一般用作标记或亲和标签的蛋白质、以及上述蛋白质的结构域或子结构域。目标蛋白或肽优选通过连接体被融合于ACT,所述连 接体可以被酶切割，例如在DNA阶段被合适的限制性酶切割和/或在 蛋白质阶段可被合适的酶切割。 ACT具有将底物上即式(I)化合物上存在的标记转移到形成融 合蛋白的一部分的ACT的半胱氨酸残基之一上的特性。在优选的实施 方式中，ACT选自上文所定义的ACT1至ACT10及其同源物。特别 优选的是ACTIO。包含目标蛋白和ACT的融合蛋白与具体的式(I)底物接触。对 反应条件进行选择，使得ACT与底物反应并且转移所述底物的标记。 常用的条件是室温下例如约25'C下约pH7的缓冲溶液。然而，可以理 解，ACT也在各种其它条件下反应，并且本文所提及的那些条件不限 制本发明的范围。所述底物的标记由本领域技术人员根据所述融合蛋白的预期 应用进行选择。在包含ACT的融合蛋白与底物接触后，标记L被共价 结合于融合蛋白。然后，标记ACT融合蛋白进一步借助转移的标记进 行操纵和/或检测。标记L可以由多个相同或不同的标记组成。如果底 物包含一个以上标记L，相应的标记ACT融合蛋白也将包含一个以上 标记，其给出了进一步操纵和/或检测标记融合蛋白的更多选择。在本发明意义中的"检测(Detected)"是指，具有携带标记 L的ACT的融合蛋白由于所述标记的特性而可以进行定位，并且融合 蛋白的量可以直接地或者通过参考标准物进行测定。在本发明意义中 的"操纵(Manipulated)"是指，具有携带标记L的ACT的融合蛋白
由于所述标记的特性而可进一步进行反应，例如与体外或体内系统分 离、富集和纯化，即与其它蛋白质和/或非蛋白质材料分离，引入到溶 液中(例如，尤其是如果所述融合蛋白不可溶时)，沉淀(例如，尤 其是如果融合蛋白可溶时)或者另外地固定于固体上，以及还进一步 进行处理，例如通过切割连接体，这分离所述标记并且再生所述融合 蛋白。普通技术人员充分理解由于标记L的特性以及将L连接于融合 蛋白的连接体R2的特性所带来的进一步处理携带标记L的融合蛋白的 许多可能性。在体外，ACT融合蛋白与本发明的底物的反应一般可以在细
24胞提取物中进行或者用提纯或富集形式的ACT融合蛋白进行。如果关于本发明底物的试验在体内或在细胞提取物中进行， 内源性AGT的反应将不会干扰ACT融合蛋白与式(I)底物的反应，因 为所述底物不与内源性AGT相互作用(或者至少不可检测地与内源性 AGT相互作用)，只与ACT相互作用。这是本组合ACT-式(I)底物相 比于现有技术中所述的AGT-苄基鸟嘌呤型底物的标准组合的实质性 优点。如上文所述的式(I)底物上的具体荧光团标记可以与已知的 AGT-苄基鸟嘌呤系统进行组合，其中苄基鸟嘌呤上的标记是猝灭剂， 其与在与ACT反应的式(I)底物上的荧光团形成FRET对。优选的是上 文所列的、作为式(I)底物的标记L的猝灭剂。可选地，式(I)底物上的标记L可以是上述猝灭剂之一，并且 与ACT的反应可以在含有AGT融合蛋白-苄基鸟嘌呤底物组合的混合 物中进行，其中苄基鸟嘌呤上的标记是所提及的荧光团之一。本发明的底物一般通过本领域已知的标准方法进行制备。有 用的原材料是2-氯嘧啶-4-胺或者在嘧啶环的位置2上具有活化离去基 团的另一胞嘧啶衍生物。该化合物然后与式HO-CHrR广R2-L的醇或类 似化合物HO-CH2-RrR2'进行反应，其中112'是连接体R2的母体，其允 许标记L的引入并且由此完成残基R2-L。特别有用的母体R2'是具有氨 基官能的那些母体，所述氨基官能允许与携带羧基官能的标记进行縮 合反应，例如以琥珀酰亚胺酯的形式，这产生掺入酰胺官能的连接体 R2。对于预期的官能度的合适保护基可以由本领域技术人员进行 选择，并且例如被概括在Greene, T.W.和Wuts， P. G. M.， "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991中。本发明进一步涉及将标记从这些式(I)底物转移到垸基胞嘧啶 转移酶(ACT)和ACT融合蛋白的方法。组合ACT-式(I)底物与已知的AGT-苄基鸟嘌呤型底物一起特 别适合于跟踪两种不同的蛋白质，这是因为式(I)底物和苄基鸟嘌呤型 底物将它们的标记分别选择性地转移到ACT和AGT融合蛋白上。为了证实利用ACT进行特异性双重标记的可行性，六组氨酸标记的"AGT (6xHis^AGT)和GST-ACT1融合蛋白的等摩尔混合物用 BGFL、 BGCy5、 BCFL、 BCCy5或者BGCy5/BCFL或BGFL/BCCy5 的等摩尔混合物进行温育。与BGFL或BGCy5的温育导致6xHis-NAGT 的完全标记以及GST-ACT1非常低的标记(在两种情况下估计低于 5%)。以相反的方式，与BCFL或BCCy5的温育导致GST-ACT1的 完全标记以及6xHis^AGT的部分标记(分别为76%和6%)。然而，与BGCy5/BCFL (或BGFL/BCCy5)的等摩尔混合物的 温育导致特异性双重彩色标记，即6xHis-NAGT用Cy5染料(或分别 用荧光素)的特异性标记以及GST-ACT1用荧光素(或分别用Cy5染 料)的特异性标记。在两种情况下，交叉标记已经被评价为小于1%。
表2. NAGT和ACT 1至10作为与BCFL和BGFL的GST-融合蛋白的 活性
kBCFL ksQFL
NAGT 26 28000
n.d.:未测定实施例 縮写
BC =苄基胞嘧啶
BG=苄基鸟嘌呤 DTT- 二硫苏糖醇 DMF= 二甲基甲酰胺
730
330
100
<100
350
460
260
600
90
1130
< vnn21 v < <1
o
1234567891
TTTTTTTTTT
cccccccccc
AAAAAAAAAA
26MPLC=中压液相色谱 PBS =磷酸缓冲盐溶液 RT=室温 TFA=三氟乙酸 TEA=三乙胺实施例1: N-(4-((4-氨基嘧啶-2-基氧伸基)苄基)-2,2,2-三氟乙 酰胺(1)
在氩气气氛下将760 mg (3.25 mmol) 2,2,2-三氟-N-(4-羟甲基-苄 基)-乙酰胺溶解于3 mL干燥的二甲基乙酰胺中，并且将273 mg (8.15 mmol)NaH在5分钟(min)内加入。然后加入211 mg (1.63 mmol) 2-氯嘧啶-4-胺并且该溶液在90'C下搅拌过夜。将1 ml水小心加入以猝灭 所有过量的NaH，并且该混合物被倒入50ml0.5NHCl中。粗产物用 乙酸乙酯进行萃取，合并的有机相用盐水进行洗涤并且经MgS04干燥。 溶剂蒸发后，产物通过急骤柱层析(从1:1至3:1的乙酸乙酯:环己烷梯 度)进行纯化。产量350mg(52%)。 ESI-MS m/z 327 [M+H]+。 [83]实施例2: 2-"-(氨甲基)苄氧基)4-氨基嘧啶(2) 将150 mg (0.46 mmol) !<[-(4-((4-氨基嘧啶-2-基氧)甲基)苄基)-2，2，2-三氟乙酰胺(l)溶解于2 ml甲醇中并且用5 ml甲胺(33%乙醇溶液)进行 处理。反应混合物在室温下搅拌过夜并且在真空中去除所有挥发物。 产物被用于下一步，而没有进一步提纯。ESI-MS m/z 231 [M+H]+。
网实施例3:N-f4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-四甲基若丹明 -6-甲酰胺(3)和N-「4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-四甲基若丹明-5-甲酰胺")
将2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2) (3.6 mg, 0.016 mmol)和5(6)-羧基四甲基若丹明琥珀酰亚胺酯(8.2 mg, 0.016 mmol)与2.4 ^ TEA 一起溶解于800 ill DMF中并且在3rC下加热过夜。在真空中蒸发溶剂线性梯度(在20分钟内从95:5至20:80， 0.08% TFA)在C18柱上通过反相MPLC (中压液相色谱)进行分离。 MS (ESI) m/z 643 [M-Cl]+。实施例4: N-「4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-荧光素-6-甲 酰胺(5), BCFL
将2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2) (3.9 mg， 0.017 mmol)和5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(8,3 mg， 0.017 mmol)与2.6…TEA —起溶 解于800 ^ DMF中并且在3rC下加热过夜。在真空中蒸发溶剂并且产 物利用水:乙腈的线性梯度(在20分钟内从95:5至20:80， 0.08% TFA) 在C18柱上通过反相MPLC进行分离。MS(ESI)m/z 589 [M+H]+。取 决于纯化方法，产物也可含有相应的异构体5-甲酰胺。实施例5: N-f4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-二乙酰基荧光 素-6-甲酰胺(6)和N44-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-二乙酰基荧光 素-5-甲酰胺(7)
将2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2) (4.1 mg， 0.018 mmol)和5(6)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(10 mg， 0.018 mmol)与2.7 pi TEA 一起溶解于800 plDMF中并且在3TC下加热过夜。在真空中蒸发溶剂 并且化合物利用水:乙腈的线性梯度(在20分钟内从95:5至20:80， 0.08% TFA)在C18柱上通过反相MPLC进行分离。MS (ESI) m/z 673 [M+H]+。实施例6: N-f4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-DY647-甲酰胺(8)
将2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2) (1.5 mg, 0.007 mmol)和 DY國547-NHS (Dyomics染料)(5 mg, 0.007 mmol)与1.0 pi TEA—起溶解 于500 ^ DMF中并且在31'C下加热过夜。在真空中蒸发溶剂并且产物 利用水:乙腈的线性梯度(在20分钟内从95:5至20:80， 0.08% TFA)在 C18柱上通过反相MPLC进行分离。MS (ESI) m/z 853 [M-Na]、
网实施例7: N-f4-"-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-DY547-甲酰 胺(9)
(9)
将2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2) (1.5 mg， 0.007 mmol)和 DY-547-NHS (Dyomics染料)(5 mg， 0.007 mmol)与1.0 jxl TEA—起溶解 于500 ^ DMF中并且在31'C下加热过夜。在真空中蒸发溶剂并且产物利用水:乙腈的线性梯度(在20分钟内从95:5至20:80， 0.08% TFA)在 C18柱上通过反相MPLC进行分离。MS (ESI) m/z 827 [M-Na]\实施例8: N-『4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基V苄基l-Cv5-甲酰胺 (10)， BCCv5
<formula>formula see original document page 30</formula>
将2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2) (1.5 mg, 0.007腿ol)和 Cy5國NHS (GE健康护理染料(healthcare dye)) (5.4 mg， 0.007 mmol)与 1.0 WTEA—起溶解于500 plDMF中并且在3TC下加热过夜。在真空 中蒸发溶剂并且产物利用水:乙腈的线性梯度(在20分钟内从95:5至 20:80， 0.08% TFA)在C18柱上通过反相MPLC进行分离。MS (ESI) m/z 868 [M-Na]-。实施例9: 06-「4-(05)-氨甲基1-,某鸟嘌呤^1). BGCv5
<formula>formula see original document page 30</formula>
将06-4-氨甲基-节基鸟嘌呤(1.9 mg， 0.007 mmol)和Cy5-NHS (GE 健康护理染料)(5.4 mg， 0.007 mmol)与1.0 TEA —起溶解于500 |il DMF中并且在31'C下加热过夜。在真空中蒸发溶剂并且产物利用水: 乙腈的线性梯度(在20分钟内从95'.5至20:80， 0.08% TFA)在C18柱上通过反相MPLC进行分离。MS (ESI) m/z 908 [M-Na]-。 [91]实施例10:
下列化合物类似于实施例3通过2-(4-(氨甲基)苄氧基)嘧啶-4-胺(2)
进行制备
式12的BC-生物素 o
HN'
式13的BC-PEG-生物素:
式14的BC-360:
NH2
式15的BC-430
M《
H,N'
由式16化合物的混合物组成的BC-俄勒岗绿(Oregon Green):OH
由式17化合物的混合物组成的BC-俄勒岗绿二新戊酰基酉i
由式18的化合物的混合物组成的BC-505:实施例ll:文库构建和噬菌体选择
利用引物1-5和作为模板的WAGT基因(SEQ ID NO:2)的重叠序列 延伸聚合酶链反应(PCR)允许随机化NAGT的残基114、 131、 135、 148、 156、 157和159。 NAGT是^AGT的182个氨基酸突变体，其中 后25个氨基酸被删除并且其具有突变K32I、 L33F、 C62A、 Q115S、 Q116H、 K125A、 A127T、 R128A、 G131K、 G132T、 M134L、 R135S、 N150Q、 1151G、 N152D、 G153L、 A154D、 N157G和S159E (Gronemeyer 等，Protein Eng. Des. Sel. 19:309-316， 2006)。引物1 (N， AGT, SEQ ID NO:3)和引物2 (C, AGT, SEQ ID NO:4)含有S_/H限制性位点；引物3 (SEQIDNO:5)包含随机碱基，用于在位置114上进行随机化；引物4
HN
、
丄
丄
、
入
丄
32(SEQIDNO:6)包含随机碱基，用于位置131和135上进行随机化；引 物5 (SEQ ID NO:7)包含随机碱基，用于在位置148、 156、 157和159 上进行随机化。PCR产物被连接到噬菌体展示载体pAK100并且所得 构建物被电穿孔入大肠杆菌(￡. co//) XLl-蓝(Stratagene， USA)。这产 生包含约107个克隆的文库。文库细胞在37X:下在2YT培养基(25 吗/mL氯霉素，1%葡萄糖，lmMMgCl2)中生长直至光密度006()0达 到0.6。然后将2xl01Q VCS M13辅助噬菌体加入并且该培养物在无摇 动下在37。C下温育30分钟并且在170 rpm下在37'C下温育3小时(h)。 细胞通过离心(4000rpm, 5min，RT)进行收获，重悬于SB-MOPS (50 mM 3-吗啉丙磺酸，25吗/mL氯霉素，70 pg/mL卡那霉素，1 mM MgCl2) 并且在220 rpm下在37t下温育1-4小时，然后在220 rpm下在24°C 下温育过夜。细胞被沉淀并且含有噬菌体的上清液被调节至1 mMDTT 并且在选择前储存于4'C下。对于选择来说，将BCFL (化合物5)加 入到噬菌体溶液(1 mL)中直至终浓度5 pM，在室温下缓慢旋转30 分钟。反应通过加入8pMBC和200^iMBG进行猝灭。使用聚乙二醇 8000 (4% w/v)和NaCl (3% w/v)沉淀噬菌体，在台式离心机中进行离心 (13000 rpm， 4t:)并且重悬于500 PBS中。向该溶液加入500 PBSMM (含4%脱脂奶粉的PBS)并且在室温下缓慢旋转该溶液60分 钟。将200 mL覆盖有抗荧光素抗体的磁珠(用pbs洗涤两次并且用 PBSMM封闭60分钟)加入到噬菌体制剂中并且在4'C下旋转30分钟。 在标记噬菌体固定后，该珠用PBSMM洗涤3次，用PBST (含0.05% 吐温-20的PBS)洗涤5次，用PBS洗涤2次。通过用100 (iL 0.1 M甘 氨酸，pH 2.5温育该珠5分钟来洗脱噬菌体，并且该溶液用50 1 M Tris-HCl pH 8进行中和。大肠杆菌JM101用洗脱的噬菌体进行感染， 在添加有1%葡萄糖和25 pg/mL氯霉素的2YT板上进行铺板，然后在 37'C下温育过夜。第二天，从板上刮下克隆，等分并且在下一轮选择 前储存在-80'C下。进行六轮选择。实施例12:选择的ACT作为GST融合蛋白的表征 根据实施例9的噬菌体选择之后分离的突变体的基因利用分别含 有&w//1和五co及l限制性位点的引物6 (N， AGT, SEQ ID NO:8)和7 (C， AGT， SEQ ID NO:9)进行PCR扩增，所述限制性位点用于随后亚克隆
33至U pGEX-2T载体(Amersham Biosciences, Otelfmgen，瑞士)中。作为 GST-ACT融合蛋白的蛋白质的表达和纯化如以前关于AGT融合蛋白 的描述进行(A. Juillerat, T. Gronemeyer， A. Keppler， S. Grendreizig， H. Pick, H. Vogel, K. Johnsson， Chem. Biol. 10:313， 2003 )。用BCFL (化合 物5)和携带荧光素的BG (BGFL, WO 02/08397)进行标记的反应速率通 过在24'C下在反应缓冲液(50 mM HEPES， pH 7.2, 1 mM DTT, 200 吗/mL BSA)中用合适的荧光底物(2-20 pM)温育相应的ACT蛋白 (0.2-0.4 ^M)进行测定。在不同的时间进行取样，并且标记反应通过加 入4xSDS缓冲液(8% SDS， 10%卩-巯基乙醇，240 mM Tris pH 6.8， 40% 甘油)并且在95'C下温育5分钟进行猝灭。通过在SDS-PAGE凝胶中检 测荧光染料标记蛋白以及利用Pharox FXTM分子成像仪量化荧光强度 来确定反应进程。数据被拟合成准一级反应模型。然后通过将准一级 常数除以荧光底物浓度而获得二级反应速率常数。 [94]实施例13:体外特异性双重标记试验
体外双重标记试验如下进行在24r下在反应缓冲液(50 mM HEPES， pH 7.2， 1 mM DTT， 200 pg/mL BSA)中用BGFL(携带荧光素的 节基鸟嘌呤，WO 02/08397)、 BGCy5(携带荧光染料Cy5的苄基鸟嘌呤， 化合物11，实施例9)、 BCFL(化合物5，实施例4)、 BCCy5 (化合物10， 实施例8) (5 ^M)或者BGCy5/BCFL或BGFL/BCCy5的等摩尔混合物 (各5 |iM)温育GST-ACT1和6xHis-NAGT的等摩尔混合物(终浓度 0.5 nM) 60分钟。标记反应通过加入4xSDS缓冲液(8°/。 SDS， 10%卩-巯 基乙醇，240 mM Tris pH 6.8, 40%甘油)并且在95'C下温育5分钟进行猝 灭。荧光染料标记蛋白混合物如上所述通过SDS-PAGE进行分析。实施例14:哺乳动物细胞表达载体的构建
对于融合蛋白NAGT-NLS3 AGT-卩Gal、 ACT1-NLS3和ACT1卩Gal 在哺乳动物细胞中的表达，"AGT和ACT1基因利用引物8 (N, AGT, SEQ ID NO:10)和9 (C, AGT, SEQ ID NO:l 1 )进行PCR扩增并且被插入 到哺乳动物表达载体pECFP-Nuc (Clontech)或含有P-半乳糖苷酶基因 的哺乳动物表达质粒的Mzd/Bg/II限制性位点。
权利要求
1.式(I)化合物，其中，R1是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH2-的任选取代的不饱和烃基、环烃基或杂环基；R2是连接体；并且L是一个标记或多个相同或不同的标记。
2. 根据权利要求1所述的式(I)化合物，其中R,是苯基。
3. 根据权利要求2所述的式(I)化合物，其中R,是对位取代的苯基。
4. 根据权利要求1所述的式(I)化合物，其中R2是具有1至300个 碳原子的直链或支链亚烃基，其中任选地(a) —个或多个碳原子被氧置换，特别地，其中每隔两个碳原子被 氧置换，例如具有1至100个乙烯氧基单元的聚乙烯氧基；(b) —个或多个碳原子被携带氢原子的氮置换，并且相邻的碳原子 被氧代取代，其代表酰胺官能-nh-co-;(c) 一个或多个碳原子被氧置换并且相邻的碳原子被氧代取代，其 代表酯官能-o-co-;(d) 两个相邻碳原子之间的键是双键或三键，其代表官能-chk:h-或"c三c-；(e) —个或多个碳原子被下列基团置换亚苯基、饱和或不饱和的亚环烃基、饱和或不饱和的亚双环烃基、桥连杂芳基或者桥连饱和或不饱和杂环基；(f) 两个相邻碳原子被下列置换二硫键-S-S-;或者两个或多个、尤其两个或三个亚烃基和/或如上文(a)至(f)所定 义的改性亚烃基的组合，其任选地含有取代基。
5. 根据权利要求4所述的式(I)化合物，其中R2是具有1至25个 碳原子的直链亚烃基，其中碳原子任选地被酰胺官能-NH-CO-置换。
6. 根据权利要求1所述的式(I)化合物，其中L是光谱探针、代表 特异性结合对的一部分的分子或者共价连接于固相支持体的分子。
7. 根据权利要求6所述的式(I)化合物，其中L是荧光团。
8. 根据权利要求7所述的化合物N-[4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基)-苄基]-四甲基若丹明-5-或6-甲酰胺，或其混合物。
9. 根据权利要求7所述的化合物N-[4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基)-苄基]-荧光素-5-或6-甲酰胺，或其混合物。
10. 根据权利要求7所述的化合物N-[4-(4-氨基嘧啶-2-基氧甲基)-苄基]-二乙酰基荧光素-5-或6-甲酰胺，或其混合物。
11. 根据权利要求7所述的化合物，其为式8的N-[4-(4-氨基嘧啶 -2-基氧甲基)-苄基]-0￥647-甲酰胺。<formula>formula see original document page 3</formula>
12.根据权利要求7所述的化合物，其为式9的N-[4-(4-氨基嘧啶 -2-基氧甲萄-节基]。丫547-甲酰胺。
13.根据权利要求7所述的化合物，其为式10的N-[4-(4-氨基嘧 啶-2-基氧甲基)-苄基]-Cy5-甲酰胺。
14.式12的根据权利要求7所述的化合物BC-生物素。
15.式13的根据权利要求7所述的化合物BC-PEG-生物素。
16.式14的根据权利要求7所述的化合物BC-360。
17.式15的根据权利要求7所述的化合物BC-430。
18.式16之一的根据权利要求7所述的化合物BC-俄勒岗绿或其 混合物。<formula>formula see original document page 5</formula>
19.式17之一的根据权利要求7所述的化合物BC-俄勒岗绿二新
20.<image>image see original document page 6</image>
21. 烷基胞嘧啶转移酶(ACT)，其是这样的蛋白质(a) 由170至220个氨基酸组成；(b) 包含至少一个半胱氨酸；(c) 与02-节基胞嘧啶进行反应，由此至少与在相同条件下与06-节基鸟嘌呤的反应一样快地将苄基取代基转移至(b)的半胱氨酸的巯 基官能上。
22. 权利要求21所述的垸基胞嘧啶转移酶(ACT)，其包含177至 185个氨基酸。
23. 权利要求21所述的烷基胞嘧啶转移酶(ACT)，其选自 根据SEQIDNO:l的蛋白质；由于下列取代而与SEQ ID NO: 1不同的蛋白质戊酰基酯或其混合物。R114A、 S131V、 E148Q、 G157W和M159R; R114S、 S131T、 D135T、 E148D、 G157P和M159E; R114N、 S131N、 G157A和M159S; R114A、 S131T、 D135S、 G157K和M159E; R114E、 S131R、 D135A、 G157E和M159E; R114S、 S131V、 E148Q、 G157L和M159R; R114E、 S131N、 D135N、 G157T和M159F; 以及这样的蛋白质，其在除了位置114、 131、 135、 148、 157禾口 159之外的位置上的一个、两个或三个氨基酸上与之不同。
24. 序列SEQIDNO:l的根据权利要求21所述的蛋白质。
25. 权利要求21所述的烷基胞嘧啶转移酶(ACT)，其选自 根据SEQ ID NO:12的蛋白质；SEQIDNO:12的蛋白质，其中 位置60上的氨基酸为M或I; 位置114上的氨基酸为A、 E、 N、 R或S; 位置121上的氨基酸为A或V; 位置131上的氨基酸为N、 S、 T或V; 位置135上的氨基酸为D、 N或T; 位置148上的氨基酸为D、 E、 Q或V; 位置153上的氨基酸为L或S; 位置157上的氨基酸为A、 G、 L、 T、 P或W;和 位置159上的氨基酸为E、 F、 M、 R、 S或L; 以及这样的蛋白质，其在除了位置60、 114、 121、 131、 135、 148、 153、 157和159之外的位置上的一个、两个或三个氨基酸上与之不同。
26. 权利要求25所述的垸基胞嘧啶转移酶(ACT)，其选自根据SEQ IDNO:12的蛋白质以及这样的蛋白质，其在除了位置60、 114、 121、 131、 135、 148、 153、 157和159之外的位置上的一个氨基酸上与之不 同。
27. 序列SEQ ID NO: 12的根据权利要求25的蛋白质。
28. 产生根据权利要求21所述的烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的方法， 其特征在于编码0、垸基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶、06-烷基鸟嘌呤 -DNA烷基转移酶突变体或烷基胞嘧啶转移酶的DNA在可达10个的 氨基酸位置上通过饱和诱变被随机化，所获得的文库被转化到合适的 噬菌粒中，期望的噬菌体通过与携带标记的苄基胞嘧啶反应进行选择， 然后，所述标记转移到其上的噬菌体采用覆盖有针对所述标记的抗体 的磁珠进行分离。
29. 将标记L从根据权利要求1所述的式(I)化合物转移到根据权 利要求21所述的烷基胞嘧啶转移酶或者包含根据权利要求21所述的 烷基胞嘧啶转移酶的融合蛋白的方法。
30. 检测和/或操纵目标蛋白的方法，其中所述目标蛋白被掺入包 含根据权利要求21所述的烷基胞嘧啶转移酶的融合蛋白中，该烷基胞 嘧啶转移酶融合蛋白与根据权利要求1所述的式(I)化合物接触，并且 所述烷基胞嘧啶转移酶融合蛋白在设计来识别和/或处理所述标记的系 统中利用所述标记L进行检测并且任选地被进一步操纵。
全文摘要
本申请的发明是用合成探针标记融合蛋白。本发明涉及被称为烷基胞嘧啶转移酶(ACT)的新蛋白质，其衍生自O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶；ACT的底物，其用于特异性地将标记转移到这些ACT；以及包含这些的融合蛋白。根据本发明的底物是式(I)的取代胞嘧啶，如右。其中，R₁是芳族基或杂芳族基，或者是双键连接于OCH₂-的任选取代的不饱和烃基、环烃基或杂环基；R₂是连接体；并且L是一个标记或多个相同或不同的标记。本发明进一步涉及将标记L从这些式(I)底物转移到ACT和ACT融合蛋白的方法。ACT-式(I)化合物的系统与已知系统O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)-苄基鸟嘌呤一起特别适合于双重标记研究。
文档编号C07D239/46GK101516857SQ200780033902
公开日2009年8月26日 申请日期2007年7月24日 优先权日2006年7月25日
发明者A·戈蒂尔, A·朱耶拉特, F·博菲尔斯, K·约翰松, M·金德曼 申请人:洛桑联邦理工学院