产物ICG-NHS。
[0052]取Cy5.5-NHS0.5mg溶于300yLDMS0中于2mLEP管中，加入溶解有0.34mgTz的 DMS0溶液34yL，再加入4yLTEA(Cy5.5-NHS:Tz的摩尔投料比为1:3)，室温避光搅拌过夜 (12h)，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到绿色固体，真空干燥， 低温保存。
[0053] 实施例5
[0054]点击反应TC0-RGD和Tz_Cy5.5对胃癌细胞的荧光成像实验：
[0055]将浓度为6.66X10-3mol/L的TC0-R⑶储存液，浓度为1.95X10-3mol/L的Tz-Cy5.5 储存液，浓度为2.0X10-3mol/L的Cy5.5-RGD储存液，3.0X10-3mol/L的RGD储存液，分别以 RPMI1640培养液稀释成工作液。待培养细胞系SGC7901处对数生长期时，常规消化，用含 10%的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成1X106/mL的单细胞悬体，加入EP管中。
[0056] 实验组A:将TC0-R⑶加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5%的⑶2的培养箱中 继续培养2.5小时后，用PBS清洗两次;再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5 %的C02的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
[0057] 对照组B:将R⑶加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5%的⑶2的培养箱中继续 培养2.5小时后，用PBS清洗两次;再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5 % 的C02的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
[0058] 对照组C:将Cy5.5-R⑶加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5 %的C02的培养箱 中培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
[0059] 如图2,细胞核荧光染色采用DAPI染料(蓝色荧光通道），近红外荧光染色采用A、B、 C三组探针(红色荧光通道），A为基于点击化学探针TC0-RGD/Tz-Cy5.5，B为对照组RGD/Tz-Cy5.5(无点击化学特性），C为对照组Cy5.5-RGD(探针与多肽直接偶联）。与B和C两组探针相 对比，探针A对胃癌细胞具有较高的特异结合性，活细胞膜通透性，对细胞质进行选择性染 色，发出红色荧光，细胞核几乎无荧光;探针B对胃癌细胞具有一定的染色能力，这是因为游 离的Cy5.5无特异性，其可以对大多数细胞进行染色;而探针C对胃癌细胞染色能力最差，说 明传统肿瘤特异性标记方式C，即将探针与多肽直接偶联的方式，会导致特异性因子和探针 之间的互相干扰，降低多肽的特异性靶向识别能力的同时，也影响荧光染料对细胞的染色 能力。
[0060] 实施例6
[0061 ]点击反应TC0-GEBP11和Tz_Cy5.5对胃癌细胞的荧光成像实验：
[0062]将浓度为 2.88X10-3mol/L的TC0-GEBP11 储存液，浓度为 1.95X10-3mol/L的Tz-Cy5 · 5储存液，浓度为2 · 0X10-3mol/L的Cy5 · 5-GEBP11储存液，3 · 0X10-3mol/L的GEBP11储 存液，分别以RPMI1640培养液稀释成工作液。待培养细胞系SGC7901处对数生长期时，常规 消化，用含10 %的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成1X106/mL的单细胞悬体，加入EP 管中。
[0063] 实验组D:将TC0-GEBP11加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5%的C02的培养箱 中继续培养2.5小时后，用roS清洗两次;再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37 °C5%的C02的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
[0064] 对照组E:将GEBP11加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5%的C02的培养箱中继 续培养2.5小时后，用PBS清洗两次;再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5 %的C02的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
[0065] 对照组F:将Cy5.5-GEBP11加入其中，使得其终浓度为5μΜ，在37°C5%的C02的培养 箱中培养〇. 5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
[0066] 如图3,细胞核荧光染色采用DAPI染料(蓝色荧光通道），近红外荧光染色采用D、E、 F三组探针（红色荧光通道），D为基于点击化学探针TC0-GEBPll/Tz-Cy5.5，E为对照组 GEBP11/Tz-Cy5.5(无点击化学特性），F为对照组Cy5.5-GEBP11 (探针与多肽直接偶联）。为 了进一步验证，又采用了GEBP11多肽，探针D表现出点击化学探针的优越性，对胃癌细胞具 有较高的特异结合性，具有活细胞膜通透性，对细胞质染色。
[0067] 实施例7
[0068]点击反应TC0-GEBP11和Tz-Cy5.5对胃癌小鼠在体光学分子成像实验：
[0069]胃癌裸鼠荷瘤模型的建立:调整带有荧光素酶的SC7901-luc人胃癌细胞为对数生 长期后用0.25%胰蛋白酶消化，含10 %的胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，PBS溶液洗涤两 次后，用PBS溶液制备成单细胞悬液，稀释成细胞密度为1X107/mL，用lmL注射器抽取肿瘤 细胞悬液(2X106)接种于裸鼠前肢背部外侧皮下，每组6只裸鼠，带肿瘤体积长至50mm3左右 进行光学成像检测。
[0070] 实验组D:将TC0-GEBP11以8nM/200yL/mouse通过尾静脉注射到所建立的胃癌裸鼠 荷瘤模型上。孵化24小时后再将Tz-Cy5.5以4nM/200yL/mouSe通过尾静脉注射到胃癌裸鼠 荷瘤模型上，以2-3%异氟烷吸入麻醉小鼠，采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像，连 续观测48小时。
[0071] 对照组E:将GEBP11以8nM/200yL/mouse通过尾静脉注射到所建立的胃癌裸鼠荷瘤 模型上。孵化24小时后再将Tz-Cy5.5以4nM/200yL/mouSe通过尾静脉注射到胃癌裸鼠荷瘤 模型上，以2-3%异氟烷吸入麻醉小鼠，采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像，连续观 测48小时。
[0072] 对照组F:将Cy5 · 5-GEBP11以4nm/200yL/mouse通过尾静脉注射到所建立的胃癌裸 鼠荷瘤模型上，以2-3%异氟烷吸入麻醉小鼠，采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像， 连续观测48小时。
[0073] 如图4所示，D为基于点击化学探针T⑶-GEBPll/Tz-Cy5.5，E为对照组GEBPll/Tz-Cy5.5(无点击化学特性），F为对照组Cy5.5-GEBP11 (探针与多肽直接偶联）。对照组F在肿瘤 部位几乎无聚集，这与细胞实验结果一致，探针与多肽直接偶联的方式会导致特异性因子 和探针之间的互相干扰;对照组E游离Cy5.5在肿瘤部位有一定聚集，但在24小时就几乎无 荧光信号，并且背景干扰强，信号强度低;相比，实验组D其荧光信号在注射探针后3-4小时 达到最大值，表现出优异的肿瘤靶向特异性，并且注射探针后48小时监测，其荧光信号依然 明亮。
[0074] 基于点击化学介导的肿瘤特异性荧光探针，可以解决现有传统近红外肿瘤标记探 针或方法特异性差的问题，可以有效降低肝肾等对探针或药物的代谢清除，从而提高探针 的生物利用度和监测灵敏度，并可应用于肿瘤监测和治疗评估的分子成像技术中。
[0075] 对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种想要的 改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，包括肿瘤特异因子点击反应模块 TCO-TL以及荧光标记点击反应模块Tz-FL，两个模块可通过点击化学反应快速结合;TCO-TL 和Tz-FL的结构式如下：其中，TCO为含环辛烯基团类化合物，TL为肿瘤特异性因子;Tz为含四嗪基团类化合物， FL为荧光标记物； TCO-TL和Tz-FL通过点击化学反应结合后的结构式如下：2. 根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，荧光标记物FL可 选自花菁染料、罗丹明染料、荧光素染料或量子点。3. 根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，肿瘤特异性因子 TL可选自核酸、多肽、蛋白、酶、糖类、抗体、单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。4. 根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，所述Tz为(苄胺-4-基)-3-四嗪。5. 根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，所述TCO为5-琥 珀酰亚胺酯环辛烯。6. 权利要求1-5任一所述的基于点击化学的肿瘤标记探针的制备方法，其特征在于，包 括步骤:利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TCO的活化羧基反应， 得到肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL，利用含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光标 记物FL的活化羧基反应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和 含环辛烯基团类化合物TCO的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL的具 体方法为： 将TCO-NHS溶于DMSO中，加入溶于TL的DMSO溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜反应， 然后用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到粉末状固体TC0-TL，真空干燥，低温 保存。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用含四嗪基团类化合物Tz的氨基基 团和荧光标记物FL的活化羧基反应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL的方法如下： 取FL，加入DIC和NHS，反应溶剂选用DMSO，于室温条件下避光搅拌，反相TLC监测；反应 结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到固体，真空干燥，得到产物FL-NHS;然后取FL-NHS溶于DMSO中，加入溶解有Tz的DMSO溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜， 反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到Tz-FL固体，真空干燥，低温 保存。9. 如权利要求1-5任一所述的基于点击化学的肿瘤标记探针在肿瘤活体光学分子影像 及活细胞成像的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤:先将肿瘤特异因子点击反 应模块TCO-TL提前注射入活体体内或体外活细胞中，让革El分子充分革El向目标组织或细胞， 再将荧光标记点击反应模块Tz-FL注射入活体体内或体外活细胞中，利用TCO和Tz之间的点 击化学反应，荧光标记物快速偶联于肿瘤特异性因子上，最后利用成像技术进行成像。
【专利摘要】本发明公开了一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及应用，利用点击化学高选择性、高效、快速的反应特点，设计了一种包括带肿瘤特异性因子的点击反应模块和带荧光标记的点击反应模块的肿瘤标记探针，两个点击反应模块之间可以通过点击反应快速结合。该肿瘤标记探针能高效快速结合于肿瘤组织或细胞，有效延长探针在活体肿瘤组织的寿命和检测时间，有效克服了现有探针特异性差的问题，为肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像以及进一步的肿瘤靶向诊治及生物学研究提供新方向。
【IPC分类】A61B5/00, C09K11/06, C07D403/14, C07K7/06, C07K1/107
【公开号】CN105419781
【申请号】CN201510740333
【发明人】张象涵, 王忠良, 赵娜, 王博, 夏玉琼, 田捷, 张瑞丽, 宁蓬勃, 胡波
【申请人】西安电子科技大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月3日