活跃链霉菌lb-16及利用其制备那西肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种活跃链霉菌。更具体地说，本发明涉及一种活跃链霉菌LB-16及利用其制备那西肽的方法。
【背景技术】
[0002]那西肽(Nosiheptide)又称诺西肽，是一种含有多个噻卩坐环并富含硫多肽类抗生素，与硫链丝菌肽(Th1streton)、盐屋霉素(s1myein)、微球菌素(Mierococcins)、硫肽霉素(T1peptin)属于同一类化合物。那西肽作为一种新型的饲料添加剂，在国内外已得到了广泛的认可，它不但能促进动物生长，提高饲料效率，而且具有不易产生耐药性，无残留，安全性高，对环境友好等特点，该产品在日本、东南亚和中国台湾等地也在广泛使用。但目前国内企业所需的那西肽主要依赖进口。
[0003]生产那西肽的方法主要为发酵法，申请号为201310027757.5的专利中给出了一种利用半光胺酸来提高那西肽产量的方法，但是该方法比较简单，也没有给出提取方法，作为工业化大生产有一定的难度。申请号为201210469137.2的专利公布一种利用活跃链酶菌接到斜面培养基中得到种子液，然后发酵培养得到那西肽的方法，该方法虽然操作简单，但是生产得到那西肽的收率低，同样也不适合工业化。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0005]本发明还有一个目的是提供一种生产力强、菌丝产量高的活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB—16;
[0006]本发明又一目的是提供一种产生活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16的方法，产品生成率和分离纯化效率均较高；
[0007]本发明再一目的是提供一种利用活跃链霉菌Streptomyces actuosus LB-16制备那西肽的方法，提取率和生物效价均较高。
[0008]为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种活跃链霉菌Streptomycesactuosus LB-16:
[0009]其分类命名为活跃链霉菌Streptomyces actuosus，所述活跃链霉菌LB-16被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为:CGMCC N0.11732，保藏时间为:2015年11月25日，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，本发明中称为活跃链霉菌LB-16。
[0010]—种产生所述的活跃链霉菌LB-16的方法，包括如下步骤:
[0011]步骤一、将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯于距离所述单孢子液35cm处照射20?30s，稀释培养的温度为28 °C，相对湿度为40?50%，24h后平皿倒置培养，然后培养6?7天后，选取长势较好的单个菌落，接种于斜面培养基，获得突变的活跃链霉菌CNlO;
[0012]步骤二、将步骤一得到的突变的活跃链霉菌CNlO用pH6.0的Tr i S_Hc I溶液处理，得到第二孢子悬浮液，将亚硝基胍溶于PH6.0的Tris-Hcl溶液，得到亚硝基胍的原液，然后将第二孢子悬浮液和亚硝基胍的原液以体积比为1:1混合，使亚硝基胍的浓度为300?500yg/mL，以控制化学制剂的诱变强度，然后在26?30°C下诱变120?130min，筛选得到活跃链霉菌LB-16。
[0013]采用了紫外和亚硝基胍联合诱变的方法，获得了生长力强、菌丝产量高的高产菌株，可有效满足生产需要，同时高产菌株的获得从根本上提高了产品的生成率，有利于分离纯化效率的提尚。
[0014]优选的是，所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中，所述步骤一中，将活跃链霉菌单孢子液用紫外灯照射后，稀释培养的温度为28°C，相对湿度为40?50%，24h后平皿倒置培养，然后继续培养6?7天。
[0015]优选的是，所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中，所述步骤二中，诱变反应终止后，立即用冷的生理盐水稀释混合液100倍，然后再稀释相应梯度涂平板，培养6?7天后，筛选得到活跃链霉菌LB-16。
[0016]优选的是，所述的产生活跃链霉菌LB-16的方法中，所述斜面培养基包括以重量百分比计的下述成分:可溶性淀粉1.0?2.0 %、豆饼粉0.5?1.0 % ,KNO3 0.1?0.2 % ,NaCl0.05?0.01%、MgS04.7H20 0.05?0.01 %和琼脂2.0%_3.0%。
[0017]—种利用所述的活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法，包括如下步骤:
[0018]A、在种子培养基上接入所述活跃链霉菌LB-16，于温度为22?28°C，转速为120?150rpm下，振荡培养72?90h，作为一级种子；
[0019]B、在种子培养基上接入上述一级种子，于温度为22?28°C，转速为120?150rpm下，振荡培养60?SOh后，作为二级种子；
[0020]C、将上述二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，于温度为22?28°C，转速为150rpm，通气量以体积比为1:0.3?0.6，压力为0.6?1.0KPa下，发酵培养120?150h;
[0021]D、将步骤C得到的那西肽发酵液加入发酵液体积6?8倍的有机溶剂中，于温度为60?80 0C下提取2?4h，得到那西肽粗提液；
[0022]E、将上述那西肽粗提液用质量浓度为10%的氢氧化钠溶液调节pH为6?8，搅拌2h，将析出的固体离心分离、水洗、干燥后得到那西肽粗品。
[0023]菌株发酵过程中，考察了菌种的发酵代谢特性和菌种生产能力，通过对种子罐和发酵罐培养工艺的优化，确定了能挖潜菌种生产能力的培养工艺，采取变温培养，通气流量采取分阶段控制，发酵单位不低于21231mg/L。
[0024]优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16生产那西肽的方法中，还包括:
[0025]F、将上述那西肽粗品装填在树脂层析柱中，先用浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠缓冲液平衡所述树脂层析柱，然后用浓度为0.1?0.2mol/L的氢氧化钠溶液梯度洗脱，洗脱液干燥后溶于其3倍体积的乙醇中，加热到80°C完全溶解，然后加入乙醇体积7?10倍的清水，室温下搅拌3h，抽滤出固体，固体用I倍体积的水淋洗，50°C下真空干燥后，得到那西肽精品O
[0026]采用有机溶剂法、树脂分离、乙醇和水混合沉淀提取分离得到那西肽粗品，并进一步采用离子交换层析法分离纯化得到那西肽精品，整个提取工艺中那西肽的提取率不低于85.1%,生物效价不低于750U/mg。
[0027]优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中，所述步骤C中，在发酵培养时用质量浓度为10 %的氨水进行补料，控制发酵罐中的pH为6.0，并通过调整转速控制发酵罐中的溶氧值为60?70%，由于培养过程为耗氧过程，控制发酵罐中的溶氧值有助于菌种的生长。
[0028]优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中，所述步骤D中的有机溶剂为乙醇、异丙醇、氯仿或二氯甲烷中的任一种。
[0029]优选的是，所述的利用活跃链霉菌LB-16制备那西肽的方法中，所述种子培养基包括以重量百分比计的下述成分:豆饼粉2.0?3.0%、葡萄糖3.0?4.0%、玉米浆2.0?3.0%、MgSO4.7H20 0.05?0.1%、(NH4)2S04*7H20 0.3?0.5%和轻质碳酸钙0.5%，所述发酵培养基包括以重量百分比计的下述成分:淀粉6.0?7.0%、蛋白胨0.3?0.5%、黄豆粉7.0?8.0%、NaCl 0.3?0.4%、(NH4)2S04.7H20 0.2?0.3%和轻质碳酸钙0.1?0.2%。
[0030]本发明至少包括以下有益效果:
[0031](I)采用了紫外和亚硝基胍联合诱变的方法，获得了生长力强、菌丝产量高的高产菌株，可有效满足生产需要，同时高产菌株的获得从根本上提高了产品的生成率，有利于分离纯化效率的提高。
[0032](2)菌株发酵过程中，考察了菌种的发酵代谢特性和菌种生产能力，通过对种子罐和