专利名称：一种剪切dna的dna酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种催化活性DNA分子，它们能够切割其他DNA序列。
背景技术：
已知的自然界存在的几种具有催化活性的RNA。一类已经发现并对其做了四种不同的催化活性修饰，它们被命名为核酶锤头状(Symons，1992)、发卡(Symons，1992)、肝炎病韋(Wu, Lin et al. 1989)和脉抱菌核酶(Saville and Collins 1990)。在自然界，这些核酶可以催化单链翻转、自身剪切等反应。在实验室，这些核酶经过修饰处理(通过在不同的酶和底物中分离具有自身剪切的分子)发挥催化作用，例如一个酶可以翻转底物(Fauzi, Kawakami et al. 1997), (Guo and Collinsl995), (Hegg and Fedor 1995)和 (Stage-Zimmermann and Uhlenbeck 1998).另一些核酶通过碱基互补配对识别底物。“锤头”状和“发卡”状的核酶比较特别，经过修饰可以在特定的剪切位点剪切任意的RNA序列，这些核酶已经成功的运用与体内进行灭活目标RNA序列(Reviewed(Lustigand Jeang2001), (Sun, Cairns et al. 2000)，(Muotri, Pereira et al. 1999)).最近能够剪切RNA的DNA酶(DNAenzyme or DNAzymes)已经得到，虽然没有报道过自然界存在DNA酶，但是运用体外筛选(“SELEX”)(Tuerk and Gold 1990)的方法从含有随机序列的文库里分离得到了具有催化功能的DNA酶(Reviewed in (Breaker 1999)),包括能剪切RNA序列的DNA酶。这些DNAzymes在以RNA做为底物的反应中具有多种用途。(Breaker and Joyce 1994), (Breaker and Joyce 1995), (Faulhammerand Famulok1996), (FauIhammer and Famulok 1997), (Li, Zheng, etal. 2000), (Roth and Breaker1998), (Santoro and Joyce 1997) (Geyer and Senl997, 1998)。上述不同的 DNA 酶，都可以剪切在通过3’端磷酸ニ酯键连接单个核糖核苷酸欠在DNA序列中，已经报道的这些反应需要ニ价金属离子，包括铅离子(Breaker and Joyce 1994),猛离子(Breaker andJoycel995), I丐离子(Faulhammer and Famulok 1996)和锋离子(Li, Zheng, etal. 2000)。还有一种DNA酶是需要组氨酸(Roth and Breaker 1998)。上述DNA酶只能特异性的剪切中间含有一个核糖核苷酸的DNA序列不能剪切全DNA序列的底物.Breaker筛选的能发生自身剪切的DNA酶(Breaker, 1996)和Silverman筛选出的依赖锌离子和猛离子的10MD5 (Silverman and Sachdeva 2009)是仅有的两例剪切DNA的DNA酶。
发明内容
本发明描述了ー种具有位点特异性内切核酸酶活性的DNA酶，这种活性针对预先选定的底物核酸序列中被定义为切割位点的脱氧核苷酸序列具有特异性。该DNA酶具有第一和第二两个底物结合区域，位于核心区域的两侧，其中所述的第一底物结合区域有一段序列与预先选定的底物核酸序列的第一部分互补，而所述第二底物结合区域有一段序列与预先选定的底物核酸序列的第二部分互补，核心区域有一段选自下列通式所述序列的其中之一的序列(1.)CACTGT(SEQ ID NO 10)，TGT 茎，TC 环，TATTCCTGGATAA(SEQ ID N09)，其中 TGT茎部分通过碱基互补配对，TGT茎可以延长ー个碱基对，并且TGT茎上的碱基对可以替换只要符合碱基互补配对原则。SEQ ID NO 9中有五个突变位点之内的突变或缺失，SEQ ID NO10有三个突变位点之内的突变或缺失；TGT茎，TC环部分有60个碱基以内的插入或缺失属于本发明的保护范围。在一个优选实施例中，式I为SEQ ID NO 6 (A-2)。(II)CATCGTAGTGTCAGCCAT(SEQ ID NO 11)，CAT 茎，AT 环，其中 CAT 茎部分通过碱基互补配对或“摆动”配对，CAT茎可以延长也可以缩短为只有三个碱基对长度，AT环可以延长也可以缩短为三个碱基.SEQ ID NO 11中有五个之内位点突变或缺失；CAT茎，AT环有60个碱基以内的插入或缺失属于本发明的保护范围。在一个优选实施例中，式II为SEQID NO 7 (A-3)。
(III) TGGAT (SEQ ID NO 12)，GAT 茎，CA 环，CGGGTCC(SEQID NO 13)。其中 GAT 茎可以延伸或缩短，CA环也可以延伸或缩短，而且GAT茎和CA环部分可以去棹。SEQ ID NO12中有三个突变位点之内的突变或缺失，GAT茎，CA环有60个碱基以内的插入属于本发明的保护范围。在一个优选实施例中，式III为SEQ ID NO 8(F-8)。在ー个实施实例中，本发明的预先选定的底物核酸序列即剪切的底物可以是例如可以是如序列表SEQ ID NO 4所示的底物核酸序列。在一个实施实例中，本发明的DNA酶可以剪切底物的不同核苷酸位置，同一种DNA酶可以剪切不同序列的底物。本发明的DNA酶具有内切核酸酶活性，由此该内切活性需要ニ价阳离子的存在。在各种优选的替代实施方案中，该ニ价阳离子选自Mg2+，Cu2+或Mn2+。其中Cu2+或Mn2+可以使催化活性增强。在本发明的各种优选实施例中，DNA酶包括一段选自下列序列的核苷酸序列SEQID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8，SEQ ID NO 23，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 25，SEQ IDN026, SEQ ID N027, SEQ IDNO 28，SEQ ID N029, SEQ ID NO 30。如此处公开的一祥，为了生成多种其他有用的剪切DNA的DNA酶，可以采用多种取代、缺失、插入、复制和其它突变的方法来制备属于公开范围的分子，只要所述分子表现出了此处描述的位点特异性的剪切活性，那么它们就属于本说明书的范围之内。在一个优选方案中，第一底物结合区域优选包括一段选自下列序的核苷酸序列TGG, TGGA, TGGAT, TGGATC, TGGATCG, GTATGG, GTATGGA, GTATGGAT, GTATGGATCGGC(SEQ IDNO 22)，第二底物结合区域包括一段选自下列序列的核苷酸序列TTCC，GTTCC，TGTTCC，GTGTTCC, AGTGTTCC, GTTCCG, TGTTCCG,GTGTTCCG,AGTGTTCCG。在本发明各种实施方案，底物结合区域的长度是可以变化的。因此，例如，所述的第一和第二底物的结合区域可以包括2到多个核苷酸。然而，应该理解的是，底物结合区域长度约3-12个核苷酸，优选约5-9个这些底物的优选区域时经具体优选的。所述的第一和第二底物的结合区域包括一段与选自SEQ ID NO 13-SEQ ID NO 21的序列互补的核苷酸序列。在各种优选的实施方案中，本发明的DNA酶是全序列单链或部分单链。优选地，这些DNA酶可以假定为各种与它们的催化活性相吻合的形状。因此，在一个变化中，本发明的DNA酶包括一个或多个发夹结构。在另ー个实施方案中，本发明的DNA酶表现出的剪切速率0. 0487^^0. 20681^,在加入H2O2后剪切速率明显加快约为0. 17min^^0.如图12所示。本发明描述的DNA酶是通过体外筛选的方式得到的。体外筛选是ー个从大量不同的序列中通过多轮筛选和扩增得到具有特殊功能DNA或RNA分子的方法。(Joyce, 1994; Chapman et al. , 1994),体外筛选的方法已经用于得到大量的核酶,这些核酶有的具有新的催化活性有的可以识别寡核苷酸，(例如，适体)。体外筛选的一种实施例，从筛选一段序列开始，如一段目标序列——即希望能被构建的具有催化活性DNA分子切割的序列。通过把预先选定的目标序列的两端通过碱基互补配对原则与具有催化活性的DNA分子邦定在一起，从而形成一定数目的能在特定位点切 割底物的核酸序列的DNA分子。上述构建的催化活性DNA分子的中间随机序列为40个脱氧核苷酸。长约广80个脱氧核苷酸的随机序列也是在本发明所期望的范围之内。在各种实施方案中，本发明的DNA酶分子中可能结合有包括添加，缺失或取代在内的ー种突变。在替代的技术中，可以用产生随机或特异突变的方法来产生这些突变。在各种优选的实施方案中，本发明的脱氧核酶包括不超过200个核苷酸。在本发明的一个实施方案中，用于产生具有催化活性DNA分子的序列选自SEQ IDNO 3，所选用的底物序列选自SEQ ID NO 4。术语定义脱氧核酶脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的ー种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。此处能够和脱氧核酶互換使用的其他词汇是“催化活性DNA分子”，“DNAzyme "，无论这些分子是通过合成制备的或是来自有机体或其它来源，它们都应该被理解为包括其酶促活性部分。内切脱氧核糖核酸酶指一种能切割主要由DNA组成的底物的酶。互补核苷酸序列指DNA或RNA的单链分子或节段中的一段核苷酸序列与另一条寡核苷酸单链的序列充分地互补从而通过氢键特异性地杂合在一起。“ SELEX，，！systematic evolution of ligands byexponentialenrichment, selex.利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与革巴物质高度亲和的核酸适体(Aptamer)。自Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4 DNA聚合酶和有机染料分子的特异嘎核苷酸配基后，经过十年的发展，SELEX技术已经成为ー种重要的研究手段和工具。
图1是用于筛选能够切割目标DNA的催化活性DNA分子的方案；如图1所示，将人工合成的中间含有40个核苷酸序列的文库，通过PNK在5'端进行磷酸化，然后与底物连接形成分子内形式。在筛选Buffer里25度12小时筛选，在PAGE胶上分离出具有活性序列的DNA分子，回收进行PCR扩增，通过PAGE胶分离出含有活性DNA分子序列，进行下轮筛选。图2是筛选过程中在多种金属离子作用下每轮的剪切百分率；DNA起始库(Rl)以及第2轮到第10轮(R2 R10)具有催化活性的DNA分子对底物的剪切百分率。图3是原始筛选具有催化活性DNA分子的结构图；该图给出的是起始文库的示范分子，该分子表现出了 SEQ ID NO 3代表的分子总体构象。如图所示，各种互补核酸位于随机序列(MO)两旁。图4是经筛选得到的其中一个催化活性DNA分子的ニ级结构图；该图显示的是ー个通过此处公开的方法产生的具有催化活性的DNA分子与底物结合形成的简单复合分子。图5是经过筛选出的ー个序列为SEQ ID NO 8所示的具有催化活性的DNA分子(F-8)对金属离子依赖性·
其中空白是不加具有催化活性DNA分子的，样品指进行筛选所用的反应液，其中含有Na+，K+，Mg2+，Cu2+，Mn2+等金属离子，在后面的反应中分别在原来的Buffer中减去这些离子，从PAGE胶上可以看出减去Cu2+，或Mn2+以后只有10%左右的剪切，减去Na+，K+，Mg2+仍然有65%的剪切，所以该催化活性DNA分子剪切DNA序列的底物是依赖Cu2+，Mn2+离子。图6，图7，图8是基本按照下面实施例1中描述的方法进行10轮体外筛选克隆测序得到的三条DNA酶与底物形成的ニ级结构图。其中，图6为A-2DNA酶与底物形成的ニ级结构；图7为A-3DNA酶与底物形成的ニ级结构；图8为F-8DNA酶与底物形成的ニ级结构图。如图6，图 7，图 8 所示,所示为序列 SEQ ID NO 21 (5’ -CCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACACT-3’)所示的底物序列与DNAzyme分离(即给出的是分子间切割)，三图均有两个位点表现出DNA酶对目标序列最有效的切割。剪切位置为剪刀所示的位置。其中图6所示序列SEQ ID NO 6的DNA酶(A-2)和图7所示序列SEQ ID N07的DNA酶(A-3)在碱基上进行剪切，图8所示序列如SEQ ID NO 8所示DNA酶(F-8)在磷酸键上进行断裂。切割条件在筛选反应液中，PH 7. 4，25°C，12小时后收集数据得出的。其中A-2的剪切速率为0. 206811'A-3的剪切速率为0. 21791T1，F-8的剪切速率为0. 1373h'竖线(|)表示的是互补配对。图9，图10，图11分别是具有催化活性的序列如SEQ ID NO 6所示的DNA分子(A-2)、序列如SEQ ID NO 7所示的DNA分子(A-3)和序列如SEQ ID NO 8所示的DNA分子(F-8)与底物的组成简图；通过非特异的互补核苷酸(水平线)之间的互补性的Watson-Crick碱基对，DNA酶(下面的链)和DNA底物(上面的链)结合起来，其中底物中间标出的碱基有的位置是可变，N=A, T、G 或 C ;W=T、C 或 A ；Y=T 或 C。图12为F-8⑴在加入50 ii M H2O2测定的剪切速率；该图中上面为PAGE胶上的剪切情况，反应时间分别为0，5，10，15，20，30，40分钟，Kobs 是通过 PraphPad software Prism 4. 0 计算出来的。
具体实施例方式以下结合实施例详细地说明本发明。实施例是为了便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。实施例1体外筛选能够剪切DNA的DNA酶。首先合成一个含约IO12个单链DNA分子的初始文库，其中在5’端有一段固定序列能与底物DNA的第一结合区域邦定在一起，3’端有一段固定序列能与底物第二结合区域邦定在一起，中间为由40个碱基的随即序列组成的强催化结构区域，在合成时即每个随即位置出现A，T，C，G的概率相同。DNA文库LB (如图1SEQ ID NO 3)。取InM通过T4PNK酶在DNA分子的5’端进行磷酸化，通过T4连接酶将文库DNA分子LB与底物LS (SEQ ID NO 4)通过夹板T (SEQ IDNO 5)连接起来，在筛选反应液(50mM HEPES, 400mM NaCl, IOOmM KCl, IOmM MgCl2, 7. 5mMMnCl2, 50 u M CuCl2) 25°C条件下温育12小时，通过跑10%的PAGE胶将具有催化活性能剪切目标底物的DNA分子的区域切割回收，在引物Pl (SEQ ID NO I)和引物RPl (SEQ ID NO 2)下进行PCR扩增，其中与引物Pl相比引物RPl是经过PEG修饰在5’端多多出20个碱基，PEG具有阻止链继续扩增的功能，这样由RPl扩增出的链比我们要的具有催化活性的DNA链要长，根据扩增出的两条链长度不同，在PAGE胶 上分离出短的链(如图1)回收并进行PNK用于下ー轮的筛选。其中100 U I的PCR反应液中包含IOOpmol的Pl，和IOOpmol的RPl的序列如下LB A GCT TGT ACT AGT GTT CC NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN N TGG ATC GGC ATG ACTAACPlAGC TTG TAC TAG TGT TCCRPlAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-PEG-GTT AGT CATGCC GAT CCA(2)反应体系及PCR条件
Pl100 pmol
RPlOOpmoi
Taq 酶5 U
dNTPs0.4 mM
LB0—200 pmol
10倍Taq缓冲液 IOlLd 超纯水将体系补足到100 [il。PCR 条件是95°C预热 Imin ;95°C变性 30s，49°C复性 45s，72°C延伸 45s，28 个循环。做了 10轮筛选，从第7轮出现剪切条带，在第10轮做了克隆。用TA克隆试剂盒。测序找出具有活性的DNA序列，通过合成出的活性DNA验证找出三条活性比较强的序列，A_2，A_3, F_8 o实施例2催化活性DNAs的动力学分析用5’-32P标记的底物与IOOpm的催化活性DNA在筛选反应液组成的混合液10 U I在25°C下分别在0. 5,1,1. 5，2，4，6，8，10，12，14小时的时候加入10111 EDTA(pH 8. 5)停止反应，通过10%的PAGE胶分离切割产物,将切割的百分率通过PraphPad software Prism4.0.软件得到每条DNAzyme的切割速率。如图12为加入H2O2后F_8 (X)的剪切速率图。实施例3本发明进一歩提供了核酸剪切包括ー种约5. 5-8. 5的pH值，一种优选方案中，pH值范围约为6. 5-8. 5，在pH 8. 5时剪切速度最快，在实验中我们在pH 7. 4时分析的。本领域技术人员可以理解，只要用于核酸剪切的pH能使DNA酶保持活性构型，本发明的方法可以在ー个宽的PH范围实施。核酸剪切的条件还包括ー个温度的变化。在一个实施方案中温度范围为约150C -60°C，在实验中我们优选25°C做为剪切温度。与核酸剪切的条件一致的温度范围只 受期望的剪切速度和该具体温度下该种DNA酶的稳定性限制。
权利要求
1.一种具有位点特异性内切核酸酶活性的DNA酶，其特征在于，该DNA酶具有第一和第二两个底物结合区域，位于核心区域的两侧，其中所述的第一底物结合区域有一段序列与预先选定的底物核酸序列的第一部分互补，而所述第二底物结合区域有一段序列与预先选定的底物核酸序列的第二部分互补，核心区域有一段选自下列通式所述序列的其中之一的序列(1.) CACTGT (SEQ ID NO 10)，TGT 茎，TC 环，TATTCCTGGATAA (SEQ ID NO 9)，其中 TGT 茎部分通过碱基互补配对，TGT茎可以延长一个碱基对，并且TGT茎上的碱基对可以替换只要符合碱基互补配对原则； (II)CATCGTAGTGTCAGCCAT (SEQ ID NO 11)，CAT 茎，AT 环，其中 CAT 茎部分通过碱基互补配对或“摆动”配对，CAT茎可以延长也可以缩短为只有三个碱基对长度，AT环可以延长也可以缩短为三个碱基；(III)TGGAT (SEQ ID NO 12)，GAT 茎，CA 环，CGGGTCC (SEQID NO 13)，其中 GAT 茎可以延伸或缩短，CA环也可以延伸或缩短，而且GAT茎和CA环部分可以去掉。
2.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，中的分子，其中所述的通式I为如SEQID NO 6所述的序列。
3.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式I中SEQID NO 9中可以有五个突变位点之内的突变或缺失，SEQ ID NOlO可以有三个突变位点之内的突变或缺失；或者，TGT茎、TC环部分可以有60个碱基以内的插入或缺失。
4.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式II为如SEQID NO 7所述的序列。
5.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式II中SEQID NO 11中可以有五个之内位点突变或缺失；或者，CAT茎、AT环可以有60个碱基以内的插入或缺失。
6.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式III为如SEQID NO 8所述的序列。
7.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的通式III中SEQID NO 12中可以有三个突变位点之内的突变或缺失；或者，GAT茎、CA环可以有60个碱基以内的插入。
8.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述的第一或第二底物结合区域的长度为3 12个核苷酸；优选包括一段与选自如SEQID NO 13 SEQ ID NO 21的序列互补的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，其中所述DNA酶的内切核酸酶活性因二价阳离子的存在而增强；其中二价阳离子优选为Mg2+，Cu2+或Mn2+，其中Cu2+或Mn2+可以使所述DNA酶的催化活性增强。
10.根据权利要求1所述的DNA酶，其特征在于，所述的DNA酶的剪切速率(K.)为O.0487h-^0. 2068^1 ;所述的DNA酶的催化活性可以因氧化剂H2O2的加入催化活性增强。
全文摘要
本发明涉及一种具有位点特异性内切核酸酶活性的催化活性DNA分子，该DNA分子能够切割其他DNA序列。该DNA分子具有第一和第二两个底物结合区域，位于核心区域的两侧，其中所述的第一底物结合区域有一段序列与上述预先选定的底物核酸序列的第一部分互补，而所述第二底物结合区域有一段序列与上述预先选定的底物核酸序列的第二部分互补，核心区域有一段根据权利要求1所述通式的序列。
文档编号C12N9/22GK103013953SQ201210399318
公开日2013年4月3日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者唐卓, 张华帆 申请人:中国科学院成都生物研究所