合成的植酸酶变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及合成的植酸酶，其具有增加的热稳定性、在pH2对酸增加的稳定性、对胃蛋白酶增加的稳定性，并且具有加宽的活性pH范围，涉及编码合成的植酸酶的分离的核苷酸序列，涉及植酸酶在动物饲料中的用途，用于降低粪便中的磷酸盐含量，并且涉及包含合成的植酸酶的动物饲料添加剂和动物饲料。
【专利说明】合成的植酸酶变体
[0001]本发明涉及植酸酶，涉及编码植酸酶的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列，并涉及制备的方法以及植酸酶的用途和包含这些植酸酶的动物饲料。
[0002]磷是活生物生长的必需元素。在动物生产中，通常必须用无机磷补充饲料，以实现良好的生长速率。在谷物和豆类中，磷主要以植酸盐的形式储存。然而，单胃动物如猪、家禽和鱼不能直接吸收植酸盐或植酸而导致植酸盐的排泄，这意味着在家畜集中生产的区域中磷是超载的。此外，与金属如钙、铜或锌结合的植酸是作为对单胃动物的代谢起负作用的物质。为了补偿这些动物的磷酸盐的缺乏，以及确保充分地生长和足够的健康，将无机磷酸盐加入到动物饲料中。无机磷酸盐的这种添加是昂贵的，并且导致了对环境的其他不利影响。通过在动物饲料中使用植酸酶，水解了植酸盐并且导致了粪便(slurry)中较低含量的磷酸肌醇和无机磷酸盐。将植酸酶添加到动物饲料中改进了有机磷的可用性，并降低了排泄的与植酸盐结合的磷酸盐对环境的不利影响。文献描述了真菌和细菌来源的多种天然植酸酶。
[0003]植酸酶也称为肌醇六磷酸盐磷酸水解酶，其是能从植酸盐切割至少一个磷酸残基的一类磷酸酶。
[0004]EP420358 一般性地描述了微生物植酸酶的克隆和表达、W02006/38062描述了将来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的微生物植酸酶作为添加剂加入到动物饲料中，并且W02007/112739描述了基于来自布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)的天然植酸酶的植酸酶及其制备方法和在动物饲料中的用途。
[0005]Haefner 等人(Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., LohscheidtM.和 Zelder 0.(2005) Biotechnological production and application of phytases。Appl Microbiol Biotechnol68:588-597)描述了植酸酶在人类或动物营养领域中的多种已知用途。植酸酶的其他用途例如，在生物乙醇的产生中水解生物质或淀粉的用途描述于W02008/097620 中。
[0006]W02008/116878 和 W02010/034835 描述了来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶，其蛋白质序列及其变体。Zinin等人(FEMS Microbiology Letters (2004)236:283-290)公开了来自变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)的植酸酶，其序列以检索号Q6U677存储于UNIPR0T数据库中。专利申请W02006/043178、W02008/097619和TO2008/092901描述了来自多种布丘氏菌属(Buttiauxella sp)的植酸酶。目前，具有最高特异性活性的天然植酸酶包括来自中间耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)(W02007/128160)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis) (W002/048332)的天然植酸酶。
[0007]然而，这些目前可用的植酸酶全部都未表现出用于制备动物饲料添加剂所需的那些性质。目前可用的植酸酶在不会相当大地丧失其活性的情况下，缺少用于制备动物饲料颗粒的足够热稳定性。在动物饲料颗粒的制备中，在高温和高湿度下将植酸酶与其他常规动物饲料组分一起压缩，以作为一个实体喂饲给家畜。在制备期间，只有在80°C以上的温度才能实现沙门氏菌属(salmonella sp.)的有效破坏和淀粉的糊化(Amerah等人WorldsPoulty Science Journal (2011) 67:29-45)。在热和潮湿条件下的这种压缩导致植酸酶活性相当大地丧失。防止活性丧失的一种可能是费劲的植酸酶颗粒的涂层，以保护它们免于加热的影响。用于涂层的脂肪或聚合物导致了植酸酶涂层的添加造成了相当大的其他花费。市售植酸酶的剂量通常基于PH5.5的活性测定(DIN IS030024:2009)而确定，并且并没有对其进行修改，以匹配各个消化道中的pH。在非5.5的pH值时活性的变化导致了相当多的错误剂量。
[0008]因此，本发明的目的是提供具有足够热稳定性的植酸酶，以使在没有其他保护措施如涂层的情况下和在尽可能少的活性丧失的情况下所述植酸酶可以用于制备无沙门氏菌的饲料颗粒。本发明的其他目的是提供可以在宽PH范围(同时酶活性尽可能小的降低)使用的植酸酶，以使甚至在由于改变饲料组分，导致PH范围波动的时候，所述植酸酶可以应用于不同动物物种的消化道的多种PH范围，并且确保消化道中足够的酶活性。
[0009]通过合成的植酸酶实现所述目的，所述植酸酶具有的氨基酸序列与SEQ ID24的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
[0010]根据本发明合成的植酸酶优选地具有氨基酸序列，其与SEQ ID24的氨基酸序列具有至少94%，特别优选地95%以及优选地96%、97%、98%或99%的同一性。
[0011]根据本发明的植酸酶具有至少80°C的热稳定性，因此适合用于饲料颗粒的制备，且在颗粒化期间，不会由于热和潮湿的条件导致相当大的活性丧失。
[0012]此外，所述植酸酶具有3个pH单位以上的宽的pH范围，在该pH范围内，它们保留了在PH5.5测定的活性的至少50%，因此，当基于5.5的活性测定剂量时，可以在具有不同消化PH的多种动物中使用所述植酸酶并且将其与不同的饲料组分一起使用，而不会有导致活性丧失的过度低剂量，从而增加了通过动物排泄的磷酸盐。
[0013]此外，根据本发明的植酸酶令人惊奇地具有增加的蛋白水解稳定性，因此，它们可以在活性基本上不损失的情况下穿过胃，并在肠中的实际作用位点仍保留活性。此外，根据本发明的植酸酶在PH2具有至少85%的稳定性，因此确保在在强酸性范围中仍然保留活性。
[0014]两个蛋白质序列或核酸序列之间的同一性定义为通过在2011年4月可得到的版本中的程序needle计算的同一性。Needle是可免费得到的程序包EMBOSS的一部分，其可以从网址http://emboss, sourceforge.net/下载。使用的标准参数为:空位开放10.0 (“空位开放罚分”)，空位延伸0.5 (“空位延伸罚分”)，就蛋白质而言，使用数据文件EBL0SUM62(矩阵)，而就DNA而言，使用数据文件EDNAFULL (矩阵)。
[0015]在特别的实施方案中，本发明不包括具有以下氨基酸序列的植酸酶:SEQ ID18及其突变体 A-4 ；A-10 ；A-66 ;A_73 ;C_7 ;C_40 ;X_1 ;X_2 ;A_164 ;B_16 ;B_378 ；C~79 ;A_11 ；X-6 ；B-320 ；A-508 ;A_8 ；A~20 ;A_507 ;A_8 ；A~20 ;A_507 ;X_3 ;A_505 ;A_501 ;A_407 ;A_502 ；X-4 ；A-408 ；A-415 ;A_501 ;A_409 ;A_503 ;A_406 ;A_510 ;A_515 ;D_5 ;D_34 ;F_161 ;A_504 ；D-192 ；A-511 ；A-514 ;A_516 ;F_41 ;D_207 ;D_268 ;F_150 ;I_117;A_509 ；H-107 ;H_159 ；H-456 ；A-512 ;H_464 ;A_513 ;A_518 ;A_521 ;A_534 和 A-519 (如在表 6 中所定义)。
[0016]在特定的实施方案中，本发明包含根据本发明所述的植酸酶，以及具有由SEQID18的氨基酸序列组成的植酸酶，并且不包括表6中所述的突变体。
[0017]表6:氨基酸序列SEQ ID18的突变体
[0018]
【权利要求】
1.植酸酶，其具有的氨基酸序列与SEQID24的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
2.根据权利要求1的植酸酶，基于根据SEQID24的位置，所述植酸酶具有在选自以下位置的至少一个的氨基酸修饰，所述位置选自位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、16、33、37、67、71、75、76、77、78、92、109、118、119、120、121、123、136、141、144、152、155、156、159、164、166、193、200、217、258、260、261、268、270、276、300、322、345、346、371、374、398 和 406。
3.根据权利要求2的植酸酶，其具有5个，优选地6个、7个、8个、9个或10个修饰。
4.根据权利要求1的植酸酶，相对于SEQID24的氨基酸序列，所述植酸酶具有选自以下的至少一个修饰，所述修饰选自S1- ；D2-,E ；T3Q, A4G,E ；P5A ；A6S, D ；G7K ；F8Y, M ；Q9K ；K12R ；L16V ；N33D, M ；H37Y ；R67L ；Q71E ；P75N ；K76N, I ；D77T ；N78T ；D92A, E, N, T, V ；Q109N, E；Q118S；N119A, T；I120L ；Q121T ；A123V ；S136K ；Q141K ；A144E ；T152G,A ；E155N ；T156G ；Q159N ；S164E ；A166E, H ；Q193L ；A200N ；S217G ；D258N ；M260I ；S261H ；K268N ；N270Q ；Q276N ；I300L ；T322Q ；D345G ；N346G ；L371A ；H374N ；D398E 和 Q406K。
5.根据权利要求4的植酸酶，其具有5个，优选地6个、7个、8个、9个或10个修饰。
6.根据权利要求1的植酸酶，其具有选自以下的累积修饰的至少一个，所述累积修饰选自:
(PhV-00I)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200ND258N S261H N270Q H374N D398E
(PhV-002)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164E A200ND258N S261H N270Q H374N D398E
(PhV-003)D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164EA200N D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
(PhV-004)D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92N Q109N Q121T A123V A144ET152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
(PhV-020) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121TT152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
(PhV-031)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T S164E A200N D258N S261HN270Q H374N
(PhV-048) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76I N78T D92N Q121TT152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
(PhV-053) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121TA123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
(PhV-055)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258NS261H N270Q Q276N H374N
(PhV-058)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258NS261H N270Q H374N
(PhV-059)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258NS261H N270Q H374N D398E
(PhV-060) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q109NQ121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L N346G H374N
7.根据前面权利要求任一项的植酸酶,与根据权利要求5-6任一项的植酸酶之一相t匕，所述植酸酶在至少一个位置具有至少一个保守氨基酸交换。
8.根据前面权利要求任一项的植酸酶，其是分离的植酸酶。
9.根据前面权利要求任一项的植酸酶，与来自莫氏耶尔森氏菌和哈夫尼菌属的两种野生型植酸酶相比，所述植酸酶具有增加的对胃蛋白酶的稳定性、增加的热稳定性和/或增加的特异性活性。
10.根据前面权利要求任一项的植酸酶，其中相对于SEQID24，所述植酸酶在位置R18、H19、G20、R22、P24、H306 和 D307 是未经修饰的。
11.编码植酸酶的分离的核酸序列，其编码根据权利要求1-10任一项的植酸酶之一。
12.编码植酸酶的分离的核酸序列，其在高度严格条件下与根据权利要求11的序列之一的互补链杂交。
13.重组表达载体，其包含根据权利要求11或12的核酸序列。
14.重组宿主细胞，其包含根据权利要求11或12的核酸序列或者根据权利要求13的载体。
15.重组生产生物，其包含根据权利要求11或12的核酸序列或者根据权利要求13的载体。
16.动物饲料添加剂，其包含根据权利要求1-10任一项的植酸酶中的至少一种和其他饲料添加剂。
17.动物饲料，其包含根据权利要求1-10任一项的植酸酶中的至少一种。
18.根据权利要求1-10任一项的植酸酶或者根据权利要求16的动物饲料添加剂在动物饲料中的用途。
19.根据权利要求1-10任一项的植酸酶或者根据权利要求16的动物饲料添加剂或者根据权利要求17的动物饲料的用途，用于降低家畜粪便中的磷酸盐含量。
【文档编号】C12N9/16GK103687944SQ201280019478
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年4月18日 优先权日:2011年4月21日
【发明者】S·哈夫纳, A·威尔泽尔, R·图默 申请人:巴斯夫欧洲公司