专利名称：一种粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法
技术领域：
本发明涉及生物催化技术领域，具体涉及ー种红酵母催化白桦脂醇合成白桦酮醇的方法。
背景技术：
白桦脂醇是ー种羽扇烷型五环三萜类化合物，同其它三萜类化合物一祥，白桦脂醇及其衍生物具有多种生物活性，如抗肿瘤活性，抗HIV活性，还有镇咳祛痰、清热利湿、消肿解毒、提高机体免疫力、降血脂等作用，故白桦脂醇作为药物先导化合物在新药 研究方面也有很大潜力。白桦脂醇也是ー种三萜类化合物，在白桦树皮中的含量很高，也可以从桦树孔菌子实体中提取，而且其提取纯化较容易，但是这样势必会造成天然野生资源储存量的下降，野生资源遭到破坏；而白桦酮醇在自然界中含量较少，因此可以利用白桦脂醇来转化白桦酮醇。目前，白桦脂醇是采用化学法合成，具体步骤为白桦脂醇
通> 28-0H-THP白桦脂醇揮挖> 3-0, 28-0H-THP白桦脂醇棒通 > 白桦酮醇。但是化学转化程序复杂，劳动强度大，生产成本高，而且污染环境。
发明内容
本发明的目的是提供ー较温和的生物催化方法，获得与白桦脂醇结构类似的衍生物，获得具有更高生物活性的化合物或者医药先导化合物。本发明的技术方案是ー种粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，将粘质红酵母催化培养，培养条件为培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，起始pH 6.0，温度为18 22 °C, 120^160转/分钟摇床中培养f 2天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，每:Γ4 L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200 mg，再继续发酵培养广2
天。
所述的粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，将粘质红酵母催化培养，培养条件优选为培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，起始pH6.0，温度为20°C，150转/分钟摇床中培养f 2天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，每3. 5L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200 mg,再继续发酵培养Γ2天。本发明的有益效果是本明利用一株粘质红酵母，将白桦脂醇转化为白桦酮醇。利用高效液相色谱法检测到2种催化产物，一种经高效液相色谱法分离纯化，高分辨率质谱和核磁共振鉴定，确定为白桦酮醇，另ー种经气质联用仪鉴定为11，14-十八碳ニ烯酸。通过优化菌株的发酵培养条件，在3. 5L发酵液中加入200mg白桦脂醇催化I天，即可得到转化的白桦酮醇。经过优化催化条件后，在5 L发酵罐中加入200 mg白桦脂醇，最后可以获得35 mg白桦酮醇和24 mg 11，14-十八碳ニ烯酸甲酷。本发明生物催化法反应条件温和，较易控制，污染较少，成本低，易于大规模生产。
具体实施方式
实施例I
ー种粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，将粘质红酵母催化培养，培养条件为培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，接种量为3 5%，起始pH 6.0，温度为18 22 °C, 120^160转/分钟摇床中培养I天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，每3 4 L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200 mg,再继续发酵培养2天。实施例2
ー种粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，其特征在干将粘质红酵母催化培养，培养条件为培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，起始pH6.0，温度为20で，150转/分钟摇床中培养I天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，每3. 5 L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200 mg，再继续发酵培养I天。
I.本发明菌株为粘质红酵母ATCC 20129，购自美国菌种保藏中心ATCC。2.所用培养基固体培养基牛肉膏3g/L，大豆蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L，2%琼脂；液体种子及发酵培养基牛肉膏3g/L，大豆蛋白胨10g/L, NaCl 5 g/L, pH 6. O。3.筛选能催化白桦脂醇的菌株
菌种活化从菌种斜面上挑取适量粘质红酵母，划线法接种到固体培养基中，培养3 d。然后挑取适量菌块，接种到液体种子培养基中，培养3 d制成种子菌液。发酵方法将2 mL种子菌液接种到50 mL发酵培养基中，于28°C条件下培养I d后，加入80 mg/L的白桦脂醇(溶于DMS0)，培养3 d。产物提取方法发酵终止后，用等体积こ酸こ酯萃取发酵液3次，合并萃取液，旋转蒸发除去こ酸こ酷，残留物溶于色谱甲醇中，经O. 22 μ m微孔滤膜过滤后，即可用高效液相色谱法检測。产物的检测方法waters 1525泵、2998 PDA检测器、柱温相、sunf ire C18色谱柱(4.6 mm X 75 mm),流动相甲醇水(含O. 1%甲酸)=85:15,流速I mL/min,检测波长206nm,柱温 25 °C。4.培养条件
培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，起始pH 6.0，温度为18 22。。，120 160转/分钟摇床中培养I 2天。5.发酵罐扩大培养
在最优培养条件下，利用5 L发酵罐进行扩大培养，装液量3. 5 L，添加200mg白桦脂醇进行发酵。发酵终止后，将发酵液浓缩至适量，用等体积こ酸こ酯萃取发酵液3次，合并滤液，通过旋转蒸发出去こ酸こ酷，残留物溶于色谱こ醇中，即可用于液相分离。6.催化产物的分离纯化与鉴定
分离纯化方法高效液相色谱制备，使用waters 600泵、2498检测器，sunf ire C18色谱柱(10 mm X 250 mm),流动相甲醇水=88:12,流速4 mL/min,检测波长206nm。收集到的产物溶液通过旋转蒸发除去溶剂，得到固体产物用于鉴定。利用高分辨率质谱、核磁共振技术确定产物I为白桦酮醇，分子量440. 3729，分子式C3tlH48O2，其核磁结果为δ 39. 609(C-I)，33.504 (C-2), 218.382 (C-3)，47.378 (C-4)，54.902 (dC_5)，19.662 (C_6)，33.968 (C-7), 40.860 (C_8), 49.741 (C_9), 36.877 (C-IO), 21.362 (C-Il), 25.197(C-12), 37.412 (C-13), 42.778 (C-14), 29.106 (C-15), 34.167 (C-16), 47.775(C-17), 48.679 (C-18), 47.775 (C-19), 150.420 (C-20)，27.019 (C-21), 29.715(C-22), 26.641 (C-23)，21.058 (C-24)，15.796 (C-25)，15.987 (C-26)，14.696 (C-27), 60.542 (C-28)，109.798 (C-29)，19.094 (C-30)。利用气质联用仪确定产物 2为11，14-十八碳ニ烯酸甲酷，分子式为C19H3402。
权利要求
1.ー种粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，其特征在于将粘质红酵母催化培养，培养条件为培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，起始pH 6.0，温度为18 22 °C, 120^160转/分钟摇床中培养f 2天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，毎:Γ4 L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200 mg，再继续发酵培养Γ2天。
2.根据权利要求I所述的粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，其特征在于将粘质红酵母催化培养，培养条件为培养基组成为3 g/L牛肉膏、10 g/L大豆蛋白胨、5 g/L氯化钠，起始pH 6.0，温度为20で，150转/分钟摇床中培养I天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，每3. 5 L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200 mg，再继续发酵培养I天。
全文摘要
本发明公开了一种粘质红酵母催化白桦脂醇生成白桦酮醇的方法，将粘质红酵母催化培养，培养条件为培养基组成为3g/L牛肉膏、10g/L大豆蛋白胨、5g/L氯化钠，起始pH6.0，温度为18～22℃，120～160转/分钟摇床中培养1～2天，然后在发酵液中加入白桦脂醇，每3～4L发酵液中白桦脂醇的加入质量为200mg，再继续发酵培养1～2天。本明利用一株粘质红酵母，将白桦脂醇转化为白桦酮醇。经过优化催化条件后，在5L发酵罐中加入200mg白桦脂醇，最后可以获得35mg白桦酮醇和24mg11,14-十八碳二烯酸甲酯。本发明生物催化法反应条件温和，较易控制，污染较少，成本低，易于大规模生产。
文档编号C12R1/645GK102703529SQ20121019752
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者冯永强, 毛多斌, 白艳红, 肖源, 许春平 申请人:郑州轻工业学院