一种酵母生产(s)-4-氯苯丙酸甲酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到解脂假丝酵母细胞生物催化制备手性 医药中间体（S)-3-羟基-3- (3-氯苯基）丙酸甲酯的技术。
【背景技术】
[0002] 手性（S)-3_羟基-3- (3-氯苯基）丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药 品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高 等优点，作为绿色高效制备手性化合物的优先途径，被越来越多地应用于生产一些高附加 值的手性化合物。生物催化制备手性（S)-3_羟基-3-(3-氯苯基)丙酸甲酯具有很好的应 用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中，水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来，氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前，采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4: 2:1。
[0004] 生物还原法相对于动力学拆分法而言，最大的优势在于理论收率可达100%，原子 经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与，一定程度上限制了其应用。由于 辅酶依赖性的缘故，生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂，实现体内辅酶循环再生的 同时免去了酶的分离纯化步骤。
[0005] (S) _3_羟基_3_ (3_氯苯基）丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的 重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等 严重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备（S)-3-羟基-3-(3-氯 苯基）丙酸甲酯。
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【发明内容】
[0007] 本发明采用解脂假丝酵母细胞催化制备（S)-3-羟基-3- (3-氯苯基）丙酸甲酯，反应 式如下：
3- (3-氯苯基)-3_氧代丙酸甲酯（1)经解脂假丝酵母催化反应，得到产物（S)-3-羟 基-3- (3-氯苯基）丙酸甲酯（2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最 终确定采用解脂假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量 率（ee%)均很高。
[0008] 许多解脂假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经 实验，本发明选用解脂假丝酵母菌株为ATCC 20462，其催化反应效果最佳。
[0009] 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD (P)H依赖型，而细胞本身所含有的辅酶量 可能较少，因此，进行氧化还原反应时，为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中 还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同， 效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳 的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：葡萄糖20-23g/L、蔗糖33-36g/L、异 丙醇5-6%V/V (体积浓度）。
[0010] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
[0011] 培养介质： 1、 种子培养基成份为：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2P04 2g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉； 2、 培养液成份：：葡萄糖20-25 g/L，酵母浸膏10-15 g/L，玉米油5-7 g/L，黄豆粉 16-20 g/L，KH2P04 4. 4-5 . 5 g/L，MgS04 7H20 0? 5-0. 6 g/L，pH6. 6。
[0012] 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0013] 解脂假丝酵母细胞制备。解脂假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发 酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至28-29°C，将解脂假丝酵母种子液接种至 发酵罐，接种比例为7-8 %，通气比为0. 5-0. 6VAV分钟），28-29°C培养45-48小时，用过滤 式离心机离心得到湿解脂假丝酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0014] 生物催化转化。底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6. 6,加入底物 3-(3-氯苯基）-3-氧代丙酸甲酯，使底物浓度为80-90 8/1。其他成份：蔗糖酯19-208/ L，葡萄糖20-23g/L、蔗糖33-36g/L、异丙醇5-6%V/V(体积浓度），121 °C高压灭菌30分 钟；冷却至30. 7-31. 6 °C时，加入湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为69-73g/L，通气比为 0. 085-0. 089V/ (V分钟)，进行生物催化反应，反应时间为66-69小时；反应结束后，滤出细 胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物（S)-3-羟基-3- (3-氯苯基)丙酸甲 酯，反应转化率98-99%，产品收率96-97%，对映体过量率98. 5-99%。
[0015] 本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反 应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、辅助底物组合、表面活性剂种类及浓度等。
[0016] 实施例1 种子培养基成份为：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2P04 2g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L，配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉； 培养液成份为：葡萄糖20-25 g/L，酵母浸膏10-15 g/L，玉米油5-7 g/L，黄豆粉 16-20 g/L，KH2P04 4. 4-5 . 5 g/L，MgS04 7H20 0.5-0.6 g/L，pH6.6。
[0017] 湿解脂假丝酵母细胞制备过程如下：解脂假丝酵母ATCC 20462经斜面、摇瓶培 养，得到种子液。1L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却 至28-29 °C，将解脂假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为接种比例为7-8 %，通气比 为0. 5-0. 6V/ (V分钟)，28-29°C培养45-48小时，用过滤式离心机离心得到湿解脂假丝酵 母细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0018] 生物催化转化：0. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6. 6,加入 底物3-(3_氯苯基)-3_氧代丙酸甲酯，使其浓度为80g/L，蔗糖酯19g/L，葡萄糖20g/L、蔗 糖36g/L、异丙醇6%V/V(体积浓度），121°C高压灭菌30分钟；冷却至30. 7-31. 6°C时，加入 湿解脂假丝酵母细胞使其浓度为69g/L，通气比为0. 085-0. 089V/ (V分钟)，进行生物催化 反应，反应时间为66小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯， 得到产物（S)-3-羟基-3- (3-氯苯基)丙酸甲酯，反应转化率99%，产品收率97%，对映 体过量率98. 5%。
[0019] 实施例2 种子培养基成份为：葡萄糖5g/L，酵母浸膏10g/L，尿素10，KH2P04 2g/L，MgS04 7H2