用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法
【专利说明】用于香草醛或香草醛卩-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物 和方法
[0001] 本申请是国际申请日2012年8月7日、国际申请号PCT/US2012/049842于2014 年3月31日进入中国国家阶段、申请号201280048260. 5、发明名称"用于香草醛或香草醛 0 -D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法"的申请的分案申请。
[0002] 发明简介
[0003] 本申请要求分别提交于2011年8月8日和2011年8月10日的美国临时申请号 61/521，090和61/522, 096的优先权利益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
【背景技术】
[0004] 香草醛是世界上最重要的香料化合物之一，全球市场为1.8亿美元。天然的 香草醛源自于香草兰（扁叶香果兰（Vanilla planifolia))的熟化种荚，但是世界上 大多数的香草醛从石化产品或木浆木质素合成。从香草豆荚生产天然香草醛是费力 且缓慢的过程，其需要对花进行手工授粉和将收获到的绿色香草豆荚熟化1-6个月 (Ramachandra&Ravishankar(2000)J.Sci.Food Agric.80:289_304)。生产 1 千克（kg)香 草醛需要大约500kg香草豆荚，对应于授粉大约40, 000朵花。目前，每年销售的香草醛中 仅有约0.25% (16, 000吨中的40吨）源自于香草豆荚，而其余的大多数从木质素或化石烃 类、尤其是愈创木酚化学合成。合成生产的香草醛售价约为每千克$15,与此相比天然香草 醛的价格为每千克 $1200-4000 (Walton 等，（2003) Phytochemistry63:505-515)。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供了用于生产香草醛和/或香草醛0 -D-葡萄糖苷的方法。本发明的方 法包括下列步骤：(a)提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变 体Arom多功能酶（AR0M)多肽和/或突变体儿茶酚-0-甲基转移酶（C0MT)多肽的异源核 酸；(b)将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时 间；以及（c)从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此 生产香草醛和/或香草醛0 -D-葡萄糖苷。
[0007] 在一种实施方式中，提供了突变体AR0M多肽，其中所述突变体相对于缺少所述突 变的相应AR0M多肽具有降低的莽草酸脱氢酶活性。根据这种实施方式，所述突变体AR0M 多肽可以在结构域5中具有一个或多个突变、缺失结构域5的至少一部分或缺少结构域5。
[0008] 在另一种实施方式中，所述突变体AR0M多肽是融合多肽，其包括（i)本文描述的 AR0M多肽，例如，包含缺失结构域5的至少一部分的AR0M多肽、或缺少结构域5的AR0M多 肽；以及（ii)具有3-脱氢莽草酸脱水酶（3DSD)活性的多肽。
[0009] 在其他实施方式中，提供了突变体C0MT多肽，其中所述突变体具有一种或多种改 进的性质。具体来说，本发明提供了倾向于在原儿茶酸和/或原儿茶醛和/或原儿茶醇的 间位而不是对位处催化甲基化的突变体C0MT多肽。
[0010] 本文描述的任何多肽还可以在所述多肽的N-端或C-端包括纯化标签、叶绿体转 运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。
[0011] 在某些实施方式中，所述宿主可以是微生物，例如酵母如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希 氏杆菌（Escherichia coli)。或者，所述宿主可以是植物或植物细胞（例如小立碗藓属 (Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞）。
[0012] 本文描述的任何宿主还可以包含编码芳香族羧酸还原酶（ACAR)、3_脱氢莽草 酸脱水酶（3DSD)、尿苷5' -二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT)、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 (PPTase)、野生型AR0M和/或野生型0-甲基转移酶（0MT)的基因。
[0013] 还提供了编码突变体C0MT多肽或突变体AR0M多肽的分离的核酸。
[0014] 附图简述
[0015] 图1是香草醛⑷的从头生物合成的示意图，以及在表达3DSD、ACAR、0MT和UGT 以及磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTase)的生物体中发现的不同的香草醛降解产物和代谢 副产物，即脱氢莽草酸（1)、原儿茶酸（2)、原儿茶醛（3)、香草酸（5)、原儿茶醇（6)，香草醇 (7)和香草醛P-D-葡萄糖苷（8)的概述。空心箭头示出了酵母中的主要代谢反应；黑色 箭头示出了通过代谢工程引入的酶反应；对角条纹箭头示出了酵母固有的不想要的代谢反 应。
[0016] 图2是使用野生型AR0M多肽（左侧）和缺少结构域5的突变体AR0M多肽（右 侦D细胞生物合成芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的示意图。
[0017] 图3A示出了在表达各种突变体C0MT多肽的酵母菌株中香草醛（VG)和异香草醛 (IsoVg)的生产。
[0018] 图3B和图3C示出了与人类0MT (Hs-〇MT)和人类L198Y 0MT突变体（HS-0MT L198Y)相比，从各种来源分离的C0MT多肽的香草醛（VG)和异香草醛（IsoVg)生产。致 病疫霉（Phytophthera infestans)(PI)，长春花（Catharanthus roseus)(CR)，解脂耶 氏酵母（Yarrowia lipolytica)(YL)，玻璃海鞘（Ciona intestinalis)GENBANK 登记号 XP_002121420 和 XP_002131313(CI-1 和 CI-2)， Capsasproa owczarzaki(CO)，嗜热毛 壳菌（Chaetomium therophilum)(CT)，卢西坦棒抱酵母（Clavispora lusitaniae(CL)， 副球抱子菌属物种（Paracoccidioides sp) 'lutzii'PbOl (PL)，扁叶香果兰（Vanilla planifolia)(VP)，阿拉比卡咖啡树（Coffea Arabica)(CA)，大鼠（Rattus norvegicus) (RN)，小鼠（Mus musculus)(MM)，泉古菌（Crenarchaeote)(CREN)，Mycobacterium vanbaleeni (MV)，或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe) (SP)。
[0019] 图4不出了在增补有3mM香草醇的表达简青霉（Penicillium simplicissium) (PS)或Rhodococcus jostii(RJ)香草醇氧化酶（VA0)的酵母菌株中香草醛葡萄糖苷、香草 醛、香草醇葡萄糖苷和香草醇的水平。
[0020] 图5示出了在增补有3mM香草酸的培养基中生长的表达N. iowensis ACAR或粗糙 脉孢霉（N. crassa)ACAR和大肠杆菌磷酸泛酰疏基乙胺转移酶（PPTase)或粟酒裂殖酵母 (S. pombe)PPTase的酵母菌株中香草酸、香草醛和香草醛葡萄糖苷的水平。
[0021] 发明详述
[0022] 本发明是基于下述发现，即突变体AR0M多肽可用于在重组宿主中提高3-脱氢莽 草酸（3-DHS)积累。3-DHS是香草醛生物合成的前体，并且如果更多的细胞内3-DHS可用， 则在香草醛生物合成途径的第一个关键步骤中可以制造更多的原儿茶酸。参见图1。在酵 母中，AROM是由AR01基因编码的五功能酶复合物。所述基因长为4764bp，并编码长度为 1588个氨基酸的相应多肽。AR0M执行5个连续的酶促转化，即将DAHP (3-脱氧-D-阿拉伯 糖基-庚酮糖酸-7-磷酸）转变成3-DHQ (3-脱氢奎尼酸），其被转变成3-DHS (3-脱氢莽草 酸），其被转变成莽草酸，其被转变成莽草酸-3-P (莽草酸3-磷酸），其被转变成EPSP (5-烯 醇丙酮莽草酸3-磷酸），它们全都在芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的细胞生物 合成途径中（参见图2)。
[0023] AR0M的5种催化功能在于AR01编码的多肽的5个不同结构域。AR0M多肽的功能 结构域的次序，与在DAHP至EPSP的5步转化中需要它们所具有的次序不同（参见图2)。 因此，结构域1对应于催化活性1，结构域2对应于催化活性5,结构域3对应于催化活性4， 结构域4对应于催化活性2,并且最后的结构域5对应于催化活性3 (参见图1)。
[0024] 含有AR0M多肽的结构域5变体（例如在结构域5中具有一个或多个突变的AR0M 多肽或一部分结构域5被缺失的AR0M多肽）的重组宿主，与表达野生型AR0M多肽的相应 宿主相比可以具有提高的3-DHS水平。这样的宿主也可以具有增加的原儿茶酸生产。
[0025] 可选替地或此外，突变体C0MT多肽可用于提高香草醛0 -D-葡萄糖苷的生物合 成。例如，本文描述的突变体C0MT多肽可以具有下列性质中的一个或多个：提高的周转； 倾向于在间位（3'）而不是对位（4'）处甲基化，以便相对于异香草醛更有利于香草醛的生 产；或对香草醛途径底物原儿茶酸和原儿茶醛的更好的特异性。
[0026] 因此，本发明提供了突变体AR0M和突变体C0MT多肽和编码这样的多肽的核酸及 其在香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的生物合成中的使用。所述方法包括下述步骤：提供能 够在碳源存在下生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体C0MT多肽和/ 或突变体AR0M多肽的异源核酸；将所述重组宿主在碳源存在下进行培养；以及从所述重组 宿主或从所述培养上清液纯化香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
[0027] 本文描述的重组宿主可用于生产香草醛或香草醛葡萄糖苷的方法。例如，如果重 组宿主是微生物，方法可以包括将重组微生物在培养基中，在表达香草醛和/或香草醛葡 萄糖苷生物合成基因的条件下生长。重组微生物可以在分批、补料分批或连续过程或其组 合中生长。通常，重组微生物在处于确定温度下的发酵罐中，在适合的营养源例如碳源存在 下生长所需时间长度，以生产所需量的香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。
[0028] 在本方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或香草醛 和/或香草醛葡萄糖苷生产的任何分子。适合的碳源的实例包括但不限于蔗糖（例如在糖 蜜中存在的）、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖聚合 物。例如，在使用酵母作为宿主的实施方式中，诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖的 碳源是适合的。碳源可以在整个培养时间段中提供给宿主生物体，或者生物体可以在另一 种能量源例如蛋白质存在下生长一段时间，然后仅在分批补料阶段中提供碳源。
[0029] 在一种实施方式中，这种方法的微生物带有编码突变体AR0M多肽和任选地野生 型C0MT多肽的核酸。在另一种实施方式中，这种方法的微生物带有编码突变体C0MT多肽 和任选地野生型AR0M多肽的核酸。在又一种实施方式中，这种方法的微生物带有编码突变 体AR0M多肽和任选地突变体C0MT多肽的核酸。取决于方法中使用的具体微生物，也可以 存在并表达编码3DSD、ACAR、UGT或PPTase的其他重组基因。因此，在一种实施方式中，重 组宿主可以是带有编码3DSD、ACAR、UGT或PPTase的一种或多种异源核酸或上述任一者的 与其具有至少80%、例如至少90%、例如至少95%序列同一性的功能同源物的微生物。产 物、底物和中间体例如脱氢莽草酸、原儿茶酸、原儿茶醛、香草醛和香草醛0 -D-葡萄糖苷 的水平，可以通过从培养基提取样品并按照已发表的方法进行分析来确定。
[0030] 在将重组微生物在培养基中生长所需时间长度后，可以使用本领域已知的各 种技术从培养基回收香草醛和/或香草醛0-D-葡萄糖苷，例如通过萃取、真空蒸馏和 从水性溶液多步重结晶以及超滤进行分离和纯化（B6ddeker?等，（1997)J.Membrane Sci. 137:155-158;BorgesdaSilva等，（2009)Chem.Eng.Des. 87:1276-1292)。使用 巯基化合物例如二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、谷胱甘肽或L-半胱氨酸（美国专利号 5, 128, 253)或碱性K0H溶液（W0 94/13614)的两相萃取方法，已被用于香草醛的回收及 其与其他芳香物质的分离。使用聚醚-聚酰胺共聚物膜从生物转化的培养基吸附和渗透 蒸发香草醛，也已被描述（:B6ddeker等，（1997)同上；Zucchi等，（1998)J.Microbiol. Biotechnol. 8:719-722)。具有交联聚苯乙烯骨架的大孔吸附树脂，也已被用于从水性溶液 回收溶解的香草酸（Zhang等，（2008)Eur.FoodRes.Technol. 226:377-383)。也已评估了超 滤和膜接触器（MC)技术用于回收香草醛（Zabkova等，（2007)J.Membr.Sci. 301:221-237 ; Scuibba等，（2009)Desalination241:357-364)。或者，可以使用常规技术例如渗滤或超 临界二氧化碳萃取和反渗透进行浓缩。如果重组宿主是植物或植物细胞，可以使用本领域 已知的各种技术从植物组织提取香草醛或香草醛葡萄糖苷。
[0031] 在某些实施方式中，香草醛或香草醛P-D-葡萄糖苷可以使用用含前体分子的原 材料喂养的完整细胞来生产。原材料可以在细胞生长期间或细胞生长之后进料。完整细胞 可以是悬浮的或固定化的。完整细胞可以在发酵液中或在反应缓冲液中。在某些实施方式 中，可能需要渗透剂将底物有效转移到细胞中。
[0032] 在某些实施方式中，香草醛或香草醛0 -D-葡萄糖苷被分离和纯化至均质（例如 纯度至少90%、92%、94%、96%或98% )。在其他实施方式中，香草醛或香草醛f3-D-葡 萄糖苷被分离为重组宿主的提取物。在这种情况下，香草醛或香草醛0-D-葡萄糖苷可以 被分离但不必纯化至均质。理想情况下，生产的香草醛或香草醛P-D-葡萄糖苷的量可以 为约lmg/1至约20, 000mg/L或更高。例如，可以生产约1至约100mg/L、约30至约100mg/ L、约 50 至约 200mg/L、约 100 至约 500mg/L、约 100 至约 1，000mg/L、约 250 至约 5,OOOrng/ L、约1，000至约15, 000mg/L或约2, 000至约10, 000mg/L的香草醛或香草醛0 -D-葡萄糖 苷。一般来说，更长的培养时间产生更大量的产物。因此，可以将重组微生物培养1天至7 天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
[0033] 应该认识到，本文中讨论的各个基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物 而不是单种微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养中生长以生产香草 醛和/或香草醛葡萄糖苷。
[0034] 分离和任选地纯化的香草醛或香草醛0 -D-葡萄糖苷的提取物可用于香料消费 品例如食品、饮食增补剂、营养品、药物组合物、牙齿卫生组合物和化妆品中。
[0035] 当在本文中使用时，短语"食品"包括但不限于水果、蔬菜、果汁、肉制品例如火腿、 培根和香肠，蛋制品、水果浓缩物、明胶和明胶状产品例如果酱、果冻、蜜饯等，乳制品例如 冰激凌、酸奶油和果子露，糖霜、糖浆包括糖蜜，玉米、小麦、黑麦、大豆、燕麦、大米和大麦制 品，坚果仁和坚果制品，蛋糕、曲奇、糖食例如糖果、橡皮糖、水果味糖豆和巧克力，口香糖、 薄荷糖、奶油、糖霜、冰激凌、派和面包，饮料例如咖啡、茶、碳酸软饮料例如可口可乐和百事 可乐、非碳酸软饮料、果汁和其他水果饮料、运动饮料例如GATORADE、咖啡、茶、冰茶、可乐， 含酒精饮料例如啤酒、葡萄酒和白酒以及KOOL-AID。
[0036] 食品还包括调味品例如药草、香料和佐料、增味剂。食品还包括制备的包装产品， 例如饮食甜味剂、液体甜味剂、在用水重构后提供非碳酸饮料的颗粒调味混合物、即溶布丁 混合物、速溶咖啡和茶、咖啡伴侣、麦乳精混合物、宠物食品、牲畜饲料、烟草和用于烘烤应 用的材料，例如用于制备面包、曲奇、蛋糕、薄煎饼、甜甜圈等的粉末烘烤混合物。食品还包 括含有很少或不含蔗糖的饮食或低卡路里食物和饮料。本发明设想的食品的其他实例描述 在下面以及整个本说明书中。
[0037] 在另一种实施方式中，食品是水果、蔬菜、果汁、肉制品例如火腿、培根和香肠，蛋 制品、水果浓缩物、明胶和明胶状产品例如果酱、果冻、蜜饯等，乳制品例如冰激凌、酸奶油 和果子露，糖霜、糖浆包括糖蜜，玉米、小麦、黑麦、大豆、燕麦、大米和大麦制品，坚果仁和坚 果制品，蛋糕、曲奇、糖食例如糖果、橡皮糖、水果味糖豆和巧克力，奶油、糖霜、冰激凌、派和 面包。
[0038] 在另一种实施方式中，消费品是药物组合物。优选的组合物是含有香草醛和/或 香草醛0-D-葡萄糖苷和一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。这些药物组合物可用 于配制含有发挥生物效应的一种或多种活性剂的药品。就此而言，药物组合物优选地还 包括发挥生物效应的一种或多种活性剂。这样的活性剂包括具有活性的药剂和生物剂。 这样的活性剂在本领域中是公知的。参见例如《医生桌面参考》（The Physician's Desk Reference)。这样的组合物可以按照本领域中已知的程序来制备，例如在《Remington制 药学》（Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co. , Easton, PA, USA 中所描述的。在一种实施方式中，这样的活性剂包括支气管扩张药、减食欲药、抗组胺药、 营养增补剂、缓泻药、镇痛剂、麻醉剂、解酸剂、H2-受体拮抗剂、抗胆碱能类药物、止泻药、缓 和剂、止咳药、止恶心药、抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、祛痰药、消炎药、退热 剂及其混合物。在一种实施方式中，活性剂是退热剂或镇痛剂，例如布洛芬、对乙酰氨基酚 或阿司匹林；缓泻药例如酚酞二辛基磺基琥珀酸钠；食欲抑制剂例如安非他命、苯丙醇胺、 苯丙醇胺盐酸盐或咖啡因；解酸剂例如碳酸钙；平喘药例如茶碱；抗利尿剂例如盐酸地芬 诺酯；有抗胃肠气胀活性的药剂例如西甲硅油；偏头痛药例如酒石酸麦角胺；精神病药理 学药剂例如氟呱啶醇；解痉剂或镇静药例如苯巴比妥；抗运动功能亢进药例如甲基多巴或 哌醋甲酯；镇定剂例如苯并二氮卓类、hydroxinmeprobramates或吩噻嗪类；抗组胺药例如 阿司咪唑、马来酸氯苯那敏、马来酸吡拉明、琥珀酸多西拉敏、马来酸溴苯那敏、柠檬酸苯托 沙敏、盐酸氯环嗪、马来酸非尼拉敏和酒石酸苯茚胺；解充血药例如盐酸苯丙醇胺、盐酸苯 肾上腺素、盐酸伪麻黄碱、硫酸伪麻黄碱、重酒石酸苯丙醇胺和麻黄碱；0 _受体阻断剂例 如普萘洛尔；用于戒酒的药剂例如双硫仑；止咳药例如苯佐卡因、氢溴酸右美沙芬、诺斯卡 品、柠檬酸咳必清和盐酸氯苯达诺；氟增补剂例如氟化钠；局部抗生素例如四环素或氯洁 霉素；皮质留类增补剂例如泼尼松或泼尼松龙；抗甲状腺肿形成药剂例如秋水仙素或别嘌 呤醇；抗癫痫药例如苯妥英钠；抗脱水药剂例如电解质增补剂；防腐剂例如氯化鲸蜡基吡 啶；NSAID例如对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生或其盐；胃肠活性剂例如洛哌丁胺和法莫替 丁；各种生物碱类例如磷酸可待因、硫酸可待因或吗啡；微量元素增补剂例如氯化钠、氯化 锌、碳酸钙、氧化镁和其他碱金属盐和碱土金属盐；维生素；离子交换树脂例如消胆胺；胆 甾醇抑制药和降脂物质；抗心律不齐药例如N-乙酰普鲁卡因酰胺；以及祛痰药例如愈创木 酚甘油醚。
[0039] 具有特别令人不快的味道的活性物质包括抗细菌剂例如环丙沙星、氧氟沙星和培 氟沙星；抗癫痫药例如唑尼沙胺；大环内酯类抗生素例如红霉素；0 _内酰胺类抗生素例如 青霉素类和头孢菌素类；治疗精神病的活性物质例如氯丙嗪；活性物质例如安乃近；以及 具有抗溃疡活性的药剂例如西咪替丁。
[0040] 本发明的药物组合物以适合于实现它们所打算的目的的任何形式给药于对象。然 而，优选地，组合物是可以通过颊或口部给药的组合物。或者，药物组合物可以是口或鼻喷 剂。对象是任何动物例如人类，尽管本发明不打算仅限于此。其他适合的动物包括犬科动 物、猫科动物、狗、猫、牲畜、马、牛、绵羊等。当在本文中使用时，兽用组合物是指适用于非人 类动物