然后将所述构建 物转化到菌株中以提供缺失的功能。
[0147] 示例性的原核和真核物种在下面更详细地描述。然而应该认识到，其他物种可 能是适合的。例如，适合的物种可以来自于伞菌属（Agaricus，）、曲霉属（Aspergillus)、 芽孢杆菌属（Bacillus)、假丝酵母属（Candida)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、埃 希氏菌属（Escherichia)、镰刀菌/赤霉菌属（Fusarium/Gibberel la)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、孔菌属（Laetiporus)、香燕属（Lentinus)、发夫酵母属（Phaffia)、平 革菌属（Phanerochaete)、毕赤酵母属（Pichia)、小立碗藓属（Physcomitrella)、红酵母 属（Rhodoturula)、酵母菌属（Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、 痴圆抱霉属（Sphaceloma)、Xanthophyllomyces、耶氏酵母属（Yarrowia)和乳杆菌属 (Lactobacillus)。来自这些属的示例性物种包括虎皮香燕（Lentinus tigrinus)、硫 横孔菌（Laetiporus sulphureus)、黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)、小立碗藓（Physcomitrella patens)、粘红酵 母(Rhodoturula glutinis) 32、Rhodoturula mucilaginosa、红发夫酉孝母(Phaff ia rhodozyma) UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、 藤仓镜 刀菌(Fusarium fujikuroi)/藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi)、产|j元假丝酵母（Candida utilis)和 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)。在某些实施方式中，微生物可以是子囊菌类例 如藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、粟 酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉（Aspergillus niger)或酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。在某些实施方式中，微生物可以是原核生物例如大肠埃 希氏菌（Escherichia coli)、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides)或荚膜红细菌 (Rhodobacter capsulatus)。应该认识到，某些微生物可用于以高通量方式筛选和测试目 标基因，而具有所需生产率或生长特性的其他微生物可用于香草醛0-D-葡萄糖苷的大规 模生产。
[0148] 有用的重组宿主的具体的非限制性实例描述在W0 01/40491以及Hansen等， (2009)Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-2774 和 Brochado 等，（2010)Microbial Cell Factories 9:84中，其中本发明的重组宿主含有编码突变体C0MT多肽和/或突变体AR0M 多肽的异源核酸代替W0 01/40491中描述的0MT基因。
[0149] 与本发明一起使用的一种优选的重组宿主是酿酒酵母，其可能如本文中所述被 重组工程化改造。酿酒酵母是合成生物学中广泛使用的底盘生物体，并可以用作重组微 生物平台。对于酿酒酵母有突变体文库、质粒、详细的代谢计算机模型和其他信息可用， 允许合理地设计各种模块以提高产物得率。制造重组微生物的方法是已知的。酿酒酵母 VG4 株（Brochado 等，（2010)Microb.Cell Fact.9:84)是特别有用的。VG4 具有基因型 pdclAgdhlA 丨⑶H2。
[0150] 曲霉属（Aspergillus)物种例如米曲霉（A. oryzae)、黑曲霉（A. niger)和酱油 曲霉（A. sojae)是在食品生产中广泛使用的微生物，并且也可用作重组微生物平台。因 此，重组宿主可以是曲霉属物种（Aspergillus spp)。对于构巢曲霉（A.nidulans)、烟曲 霉（A.fumigatus)、米曲霉（A. oryzae)、棒曲霉（A.clavatus)、黄曲霉（A.flavus)、黑曲霉 (A. niger)和土曲霉（A.terreus)的基因组来说，核苷酸序列是可以获得的，允许对内源途 径进行合理设计和修改以增加流量并提高产物得率。对曲霉来说已开发了代谢模型并进行 了转录组学研究和蛋白质组学研究。黑曲霉培养被用于工业化生产大量食品成分例如柠檬 酸和葡萄糖酸，因此诸如黑曲霉的物种总的来说适用于生产食品成分例如香草醛和香草醛 葡萄糖苷。
[0151] 合成生物学中的另一种广泛使用的平台生物大肠杆菌，也可用作重组微生物平 台。因此，重组宿主可以是大肠杆菌。与酵母菌类似，对于大肠杆菌也存在突变体文库、质 粒、详细的代谢计算机模型和其他信息，允许合理地设计各种模块以提高产物得率。与上面 对酵母菌属所描述的方法类似的方法，可用于制造重组大肠杆菌微生物。
[0152] 红细菌属（Rhodobacter)物种可以用作重组微生物平台。因此，宿主可以是红细 菌属物种（Rhodobacter spp)。与大肠杆菌类似，存在着可用的突变体文库以及适合的质粒 载体，允许合理地设计各种模块以提高产物得率。与上面对大肠杆菌所描述的方法类似的 方法，可用于制造重组红细菌属微生物。
[0153] 小立碗藓属（Physcomitrella)苔藓，当在悬浮培养中生长时，具有与酵母或其他 真菌培养物类似的特性。这个属正变成在其他类型的细胞中难以生产的植物次生代谢物生 产的重要的细胞类型。因此，重组宿主可以是小立碗藓属物种（Physcomitrella spp)。
[0154] 在某些实施方式中，本文描述的核酸和多肽被导入到植物或植物细胞中以提高总 体香草醛或香草醛葡萄糖苷生产。因此，重组宿主可以是包括本文描述的至少一种异源核 酸的植物或植物细胞。植物或植物细胞可以通过使异源核酸整合在其基因组中来转化，即 可以稳定地转化。稳定转化的细胞通常随着每次细胞分裂保留导入的核酸。植物或植物细 胞也可以被瞬时转化，使得异源核酸未整合在其基因组中。瞬时转化的细胞通常随着每次 细胞分裂失去所有或一部分导入的核酸，使得在足够次数的细胞分裂后，在子代细胞中不 能检测到导入的核酸。瞬时转化和稳定转化的转基因植物和植物细胞两者在本文描述的方 法中都可能是有用的。
[0155] 在本文描述的方法中使用的转基因植物细胞可以构成完整植物的一部分或全部。 这样的植物可以以适合于所考虑的物种的方式，在生长箱、温室中或田间生长。可以根据特 定目的的需要，例如为了将异源核酸例如重组核酸构建物导入到其他株系中、将异源核酸 转移到其他物种、或进一步选择其他所需性状，对转基因植物进行繁育。或者，对于适合于 营养繁殖技术的物种来说，可以将转基因植物营养繁殖。当在本文中使用时，转基因植物也 指初始转基因植物的后代，只要所述后代继承所述转入基因即可。由转基因植物产生的种 子可以被生长，然后进行自交（或远交和自交），以获得对核酸构建物纯合的种子。
[0156] 转基因植物可以生长在悬浮培养或组织或器官培养中。出于本发明的目的，可以 使用固体和/或液体组织培养技术。当使用固体培养基时，转基因植物细胞可以被直接放 置在培养基上，或者可以放置在滤纸上，然后将滤纸放置成与培养基相接触。当使用液体培 养基时，可以将转基因植物细胞放置在与液体培养基相接触的漂浮装置例如多孔膜上。
[0157] 当使用瞬时转染的植物细胞时，可以将编码具有报告物活性的报告多肽的报告序 列包含在转化程序中，并且可以在转化后的适合时间进行报告物活性或表达的测定。用于 进行测定的适合时间通常为转化后约1-21天，例如约1-14天、约1-7天或约1-3天。对于 不同物种中的快速分析来说，或者为了证实在特定受体细胞中表达尚未得到证实的异源多 肽的表达，使用瞬时测定法是特别方便的。
[0158] 用于将核酸导入单子叶或双子叶植物中的技术，在本领域中是已知的，并且包括 但不限于土壤杆菌（Agrobacterium)介导的转化、病毒载体介导的转化、电穿孔和粒子枪 转化，参见美国专利号5, 538, 880、5, 204, 253、6, 329, 571和6, 013, 863。如果细胞或培养的 组织被用作转化的受体组织，如果需要，植物可以从转化的培养物，通过本领域技术人员已 知的技术来再生。
[0159] 可以从转基因植物的群体筛选和/或选择具有由转入基因的表达赋予的性状或 表型的群体成员。例如，可以从单一转化事件的后代群体筛选具有本文描述的多肽或核酸 的所需表达水平的植物。可以使用物理和生物化学方法来鉴定表达水平。这些方法包括 用于多核苷酸检测的Southern分析或PCR扩增，用于检测RNA转录本的northern印迹、 SIRNase保护、引物延伸或RT-PCR扩增，用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测 定法，以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定法。其 他技术例如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可用于检测多肽和/或核酸的存在或表达。用 于执行所有指称技术的方法是已知的。
[0160] 作为可选方案，可以从具有独立转化事件的植物群体筛选具有所需性状例如香草 醛葡萄糖苷生产的植物。选择和/或筛选可以在一代或更多代中和/或在超过一个地理位 置中进行。在某些情况下，转基因植物可以在诱导所需表型或者不然就是对转基因植物中 产生所需表型是必需的条件下进行生长和选择。此外，可以在预期植物将表现出表型的特 定发育阶段期间进行选择和/或筛选。可以进行选择和/或筛选以选择与缺少转入基因的 对照植物相比具有香草醛或香草醛0 -D-葡萄糖苷水平的统计学显著差异的转基因植物。
[0161] 功能性同源物
[0162] 本文描述的多肽的功能性同源物也适合用于在重组宿主中生产香草醛或香草醛 葡萄糖苷。因此，重组宿主可以包括编码上述多肽的功能性同源物的一种或多种异源核酸 和/或编码本文中描述的突变的C0MT或AR0M多肽的异源核酸。功能性同源物是与参比多 肽具有序列相似性，并执行参比多肽的生物化学或生理功能中的一种或多种的多肽。功能 性同源物和参比多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可能是由趋同或趋异进化事 件造成的。就此而言，功能性同源物有时在文献中被称为同源物或直向同源物或横向同源 物。天然存在的功能性同源物的变体例如由野生型编码序列的突变体编码的多肽，自身可 能是功能性同源物。功能性同源物还可以通过多肽的编码序列的定点突变产生，或通过将 来自于不同的天然存在的多肽的编码序列的结构域进行组合（"结构域交换"）来产生。用 于改变编码本文描述的功能性AR0M和/或C0MT多肽的基因的技术是已知的，尤其是包括 定向进化技术、定点突变技术和随机突变技术，并且可用于提高多肽的比活性、改变底物特 异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或以所需方式改变多肽：多肽相互作用。这样的修改 的多肽被认为是功能性同源物。术语"功能性同源物"有时应用于编码功能同源的多肽的 核酸。
[0163] 功能性同源物可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定。例如，在核苷酸或多 肽序列数据库上进行查询，可以鉴定AR0M或C0MT多肽、3DSD、ACAR、PPTase或UGT多肽的 同源物。系列分析可以包括使用AR0M或C0MT、3DSD、ACAR、PPTase或UGT氨基酸序列作为 参比序列的非冗余数据库的BLAST、相互（reciprocal)BLAST或PSI-BLAST分析。在某些 情况下，从核苷酸序列推演氨基酸序列。数据库中具有高于40%序列同一性的多肽是候选 物，用于进一步评估作为香草醛或香草醛葡萄糖苷生物合成多肽的适合性。氨基酸序列相 似性允许保守氨基酸置换，例如用一个疏水残基置换另一个疏水残基或用一个极性残基置 换另一个极性残基。如果需要，可以对这样的候选物进行人工检查，以便缩小进一步评估的 候选物的数目。人工检查可以通过选择显得具有AR0M或C0MT多肽或香草醛生物合成多肽 中存在的结构域例如保守性功能结构域的候选物来进行。
[0164] 可以通过在多肽的一级氨基酸序列内定位是重复序列、形成一些二级结构（例 如螺旋和0片层）、建立起带正电荷或负电荷的结构域或代表蛋白质基序或结构域的区 域，来鉴定保守区。参见例如描述了各种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam数据库。 Pfam 数据库所包括的信息描述在 Sonnhammer 等，（1998)Nucl. Acids Res. 26:320-322 ; Sonnhammer 等，（1997) Proteins 28 : 405-420 和 Bateman 等，（1999) Nucl. Acids Res. 27:260-262中。保守区还可以通过将来自于密切相关物种的相同或相关多肽的序列进 行比对来确定。密切相关的物种优选地来自于相同家族。在某些实施方式中，来自于两种 不同物种的序列的比对是足够的。
[0165] 通常，表现出至少约40%氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区。相关多肽 的保守区表现出至少45 %的氨基酸序列同一性（例如至少50 %、至少60 %、至少70%、至 少80 %或至少90 %的氨基酸序列同一性）。在某些实施方式中，保守区表现出至少92%、 94%、96 %、98 %或99 %的氨基酸序列同一性。序列同一性可以如上所提出地进行确定。
[0166] 在下面的实施例中对本发明进行进一步描述，所述实施例不限制权利要求书中描 述的本发明的范围。
[0167] 实施例1 :用于从葡萄糖生产香草醛葡萄糖苷的酵母报告菌株
[0168] 按照Brochado等，（2010)Microb. Cell Fact. 9:84中所述，产生从葡萄糖生产 香草醛葡萄糖苷的遗传稳定的酵母菌株，即具有roci (丙酮酸脱羧酶）和GDH1 (谷氨酸 脱氢酶）基因缺失并过表达GDH2的菌株VG4。此外，所述菌株带有表达构建物，其含有 整合到酵母基因组的ECM3基因座间区域中的PPTase。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)PPTase编码序列的表达受到酵母TPI1启动子的控制（Hansen等，（2009)Appl. Environ. Microbiol. 75(9) : 2765-74. Epub 2009,3 月 13 日）。得到的菌株被命名为V12。
[0169] 实施例2 :缺少结构域5的AR0M的构建
[0170] 使用校对性PCR聚合酶，通过PCR扩增，从制备自酿酒酵母菌株S288C的基因组 DNA分离酵母AR01基因的最靠近5'的3912bp，其包括除了结构域5 (具有莽草酸脱氢酶活 性）之外的所有功能结构域。将得到的DNA片段亚克隆到pTOPO载体中，测序以证实DNA序 列。核酸序列和相应的氨基酸序列分别显示在SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2中。将该片段 用Spel和Sail进行限制性消化，并克隆在高拷贝数酵母表达载体p426-GPD (基于2 y的 载体）中的相应限制性位点内，从所述载体可以通过强的组成型酵母GPD1启动子表达插入 的基因。得到的质粒被命名为PVAN133。
[0171] 实施例3 :在结构域5中具有单个氨基酸置换的酵母AROM
[0172] 在本实施例中描述的所有突变体AR0M多肽是其中一个氨基酸已被另一个氨基酸 置换的SEQ ID N0:4的多肽。突变体AR0M多肽如下命名：XnnnY，其中nnn指示被置换的氨 基酸在SEQ ID N0 :4中的位置，X是在SEQ ID N0 :4中的nnn位置中的氨基酸的单字母代 码，Y是置换X的氨基酸的单字母代码。例如，A1533P是指其中1533位置处的丙氨酸被脯 氨酸置换的SEQ ID N0 :4的突变体AR0M多肽。
[0173] 使用校对性PCR聚合酶，通过PCR扩增，从制备自酿酒酵母菌株S288C的基因组 DNA分离全部4764bp的酵母AR01基因。将得到的DNA片段亚克隆在pTOPO载体中，测序以 证实DNA序列。核酸序列和相应的氨基酸序列分别显示在SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4中。 将该片段用Spel和Sail进行限制性消化，并克隆在低拷贝数酵母表达载体p416-TEF(基 于CEN-ARS的载体）中的相应限制性位点内，从所述载体可以从强的TEF启动子表达基因。 得到的质粒被命名为PVAN183。
[0174] 使用 QUICKCHANGE II 定点突变试剂盒（Agilent Technologies)，使用质粒 PVAN183来制造AR01的10个不同的结构域5突变体。参考SEQ ID N0 :4,突变体含有下列 氨基酸置换：A1533P，P1500K，R1458W，V1349G，T1366G，I1387H，W1571V，T1392K，K1370L 和 A1441P〇
[0175] 在证实这些突变体AR0M基因的序列后，将含有A1533P、P1500K、R1458W、 V1349G、T1366G、I1387H、W1571V、T1392K、K1370L 和 A1441P 置换的表达质粒分别命名为 pVAN368-pVAN377。AR0M突变体的核酸序列和相应的氨基酸序列列于表1中。
[0176] 表 1
[0177]
[0178] 实施例4 :酵母AR0M和3DHS脱水酶融合蛋白
[0179] 使用校对性PCR聚合酶，通过PCR扩增，从制备自酿酒酵母菌株S288C的基因组 DNA分离酵母AR01基因的最靠近5'的3951bp。将得到的DNA片段亚克隆到pTOPO载体 中，测序以证实DNA序列。为了将该片段融合到来自于香草醛途径的3-脱氢莽草酸脱水酶 (3DSD)基因，将来自于 Podospora pauciseta 的 3DSD 基因（Hansen 等，（2009)同上）插入 到酵母表达载体P426-GH)的Xmal-EcoRI位点中，然后将克隆的AR01片段切下并插入到得 到的构建物的Spel-Xmal位点中。最终的融合基因从强的组成型GPD1启动子表达。得到 的质粒被命名为PVAN132。该融合蛋白的核酸序列和相应的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO :26 中。
[0180] 实施例5 :突变体或融合AR0M酶在已经生物合成香草醛葡萄糖苷的酵母中的表达
[0181] 使用乙酸锂转化流程，通过转化将实施例2、3和4中描述的每个质粒导入到酵母 菌株V12中，产生下列酵母菌株：V12-Arol-l (含有质粒pVAN133)，V12-Arol-2(含有质粒 PVAN132)，V12-1-3(含有质粒 pVAN183)，V12-Arol-4(含有质粒 pVAN368)，V12-Arol-5(含 有质粒 PVAN369)，V12-Arol-6 (含有质粒 pVAN370)，V12-Arol-7 (含有质粒 pVAN371)， V12-Arol-8(含有质粒 pVAN372)，V12-Arol-9(含有质粒 pVAN373)，V12-Arol-10 (含有 质粒 PVAN374)，V12-Arol-ll (含有质粒 pVAN375)，V12-Arol-12(含有质粒 pVAN376)和 V12-Arol-13 (含有质粒 pVAN377)。
[0182] 将酵母菌株 V12-Arol-l、V12-Arol-2、V12-1-3、V12-Arol-4、V12-Arol-5、 V12-Arol-6^ V12-Arol-7^ V12-Arol-8^ V12-Arol-9^ V12-Arol-10^ V12-Arol-lU V12-Arol-12 和 V12-Arol-13 作为 200ml 培养物，在 500ml Erlenmeyer 摇瓶中，使用不含 芳香族氨基酸的SC(合成完全）生长培养基，在30°C和中等转数（150rpm)下生长72小 时。在48小时时取样并测定香草醛葡萄糖苷的含量。含有空载体p416-TEF或p426-GPD 的酵母菌株V12被包含作为对照。对照菌株（含有空质粒p416-和p426-GPD)中的香草醛 葡萄糖苷（VG)生产通常在250mg/L左右。表达截去结构域5的A