R0M预期将提高VG生产 (菌株V12-Arol-l)，并且将该截短的AR0M进一步物理融合到异源香草醛途径中的第一关 键酶（Podospora pauciseta 3DSD)，预期将导致香草醛葡萄糖苷生产的进一步提高（菌株 V12-Arol-2)〇
[0183] 在结构域5的单个氨基酸被改变的AR0M的突变体中，T1392K (菌株V12-Arol-9) 和K1370L (菌株V12-Arol-10)可用于提高VG生产。例如，对于T1392K (菌株V12-Arol-9) 和K1370L (菌株V12-Arol-10)，可以观察到VG生产的约30-35%的提高。
[0184] 本实施例证实了通过过表达具有降低的莽草酸脱氢酶活性的突变体AR0M多肽， 可以提高3-DHS的细胞浓度，其足以在异源途径中得到的最终滴度中发挥作用。本实施例 还证实，将异源途径的第一个酶即3DHD融合到截短的AR0M酶，导致进入异源途径的流量增 加，获得底物通道效果。最后，这里描述的实验表明，通过改变AR0M结构域中独立的氨基 酸，所述结构域天然代谢为香草醛生产所需化合物的3DHS，可以提高可用于香草醛生物合 成的3DHS的量。
[0185] 实施例6:C0MT突变体
[0186] 在本实施例中描述的所有突变体C0MT多肽是其中一个氨基酸被另一个氨基酸置 换的SEQ ID N0 :27的多肽。突变体C0MT多肽如下命名：XnnnY，其中nnn指示被置换的氨 基酸在SEQ ID NO :27中的位置，X是在SEQ ID NO :27中的nnn位置中的氨基酸的单字母 代码，Y是置换X的氨基酸的单字母代码。例如，L198Y是指其中198位置处的亮氨酸被色 氨酸置换的SEQ ID NO :27的突变体C0MT多肽。
[0187] 使用含有所需密码子的引物，通过PCR来构建编码突变体C0MT多肽的核酸。PCR 作为单一 PCR或使用序列重叠延伸PCR(SOE)，通过标准程序来进行。该步骤可以例如由商 业化提供者例如Life Technologies来进行。使用的引物列于表2中。
[0188] 表 2
[0189]
[0190]
[0191]
[0192] 在上面提供的引物序列中：M可能是A或C ;R可能是A或G ;W可能是A或T ;S可 能是G或C ;Y可能是C或T ;K可能是G或T ;V可能是A、G或C;H可能是A、C或T ;D可能 是A、G或T ;B可能是G、C或T ;并且N可能是A、G、C或T。
[0193] 用于EcoRI/Xbal的限制性位点被包含在引物中，以便于将PCR产物克隆到着 丝粒酵母表达载体p416-TEF(Mumberg等，（1995)Genel56(l):119-22)中。将得到的质 粒转化到酵母菌株 EFSC2055(基因型 Mata his3Dlleu2DOmetiro〇ura3DOadh6: :LEU2bg 11::KanMX4PTPIl::3DSD[AurC]::(HsOMT::MET15[NatMX])::ACAR[HphMX]::UGT72E2[H IS3]ECM3::(CorPPTase_ScHAP4))中。该酵母菌株基于 VG4 菌株（Brochado 等，（2010) Microbial. Cell Factories 9:84)，另外包括用MET15标志物破坏的HsOMT，并且具有两个 其他整合的基因，即谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)的PPtase(NCBI数据库 登记号NP_601186)和酿酒酵母（S. cerevisiae)的HAP4(NCBI数据库登记号Z28109)。
[0194] HsOMT如下所述进行破坏：使用分别具有与HsOMT的前部和后部末端同源的70bp 尾部的引物，通过PCR扩增酿酒酵母的MET15 (甲硫氨酸营养缺陷型选择标志物）。然后用 PCR产物转化酵母菌株，产生不具有HsOMT活性并且能够在不添加甲硫氨酸的平板上生长 的转化体。得到的菌株被命名为EFSC2055。
[0195] 使用标准的酵母转化乙酸锂/PEG流程，将表达CorPPTase和ScHAP4的质粒转化 到￡?302055前身菌株中，并在3(：-尿嘧啶平板上选择转化体。通过在增补有8%甜菜糖蜜 的Delft培养基中在3ml培养物中生长72小时，来测试转化体。
[0196] 使用HPLC-UV分析培养物来定量香草醛葡萄糖苷/异香草醛葡萄糖苷和相关产 物。HPLC分析使用带有二元栗的AGILENT 1100系列系统和Phenomenex Synergi Polar-RP 2. 5u丨〇〇A 100x2. 00mm柱来进行，所述柱能够将前体与异香草醛和香草醛分离开。使用水 /乙腈+0. 1 %三氟乙酸运行平梯度。如表3中所示，执行8. 9分钟程序+1. 1分钟后运行。
[0197] 表 3
[0198]
[0199] 通过对HPLC峰的面积进行积分并将其与标准曲线进行比较，来定量香草醛葡萄 糖苷和异香草醛葡萄糖苷。该分析的结果示出在图3A中。表达SEQ ID N0 :27的野生型 Hs-〇MT(被称为Hs-C0MT wt)的酵母细胞以约1 :3的比率生产异香草醛和香草醛，而突变体 L198Y以约1:125的比率生产异香草醛和香草醛。由于异香草醛的生产处于检测极限处，准 确的比率难以确定。
[0200] 除了图3A中的突变分析之外，在突变体L198C、L198N、L198D、L198F和L198E中 还具有良好的特异性和低的异香草醛生产。
[0201] 实施例7:香草醇的减少
[0202] 作为说明，将简青霉（GENBANK登记号P56216)和R. jostii (GENBANK登记号 YP_703243. 1)的VA0基因分离并克隆到酵母表达载体中。随后将表达载体转化到表达葡 萄糖基转移酶的酵母菌株中。通过将酵母在增补有3mM香草醇的培养基中生长48小时，测 试转化的菌株的VA0活性。该分析的结果显示在图4中。来自于简青霉和R. jostii两者 的VA0酶在酵母中表现出活性。当在能够生产香草醛葡萄糖苷的菌株中分析VA0酶时，在 香草醛葡萄糖苷发酵期间香草醇的积累减少。
[0203] 实施例8 :来自于粗糙脉孢霉（Neurospora crassa)的ACAR基因
[0204] 作为来自于 Nocardia iowensis 的 ACAR 蛋白（EC 1. 2. 1. 30) (Hansen 等，（2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-74)的可替选方案，调查了在酵母中使用粗糙脉孢霉 的 ACAR 酶（Gross&Zenk(1969)Eur. J. Biochem. 8:413-9 ;US 6, 372, 461)，因为脉孢霉（面 包霉）是一种GRAS生物。将与Nocardia iowensis ACAR具有同源性的粗糙脉孢霉基因 (GENBANK XP_955820)分离并克隆在酵母表达载体中。将表达载体转化到表达PPtase的 酵母菌株中，选择存在ACAR基因的菌株，并将所选的酵母在增补有3mM香草酸的培养基中 培养72小时以证实ACAR活性。该分析的结果显示在图5中。发现粗糙脉孢霉的ACAR酶 与N. iowensis ACAR相比在酵母中表现出更高活性。因此，在本文公开的方法的某些实施 方式中，将粗糙脉孢霉的ACAR酶用于香草醛或香草醛葡萄糖苷的生产。
[0205] 除了 N. iownsis或粗糙脉孢霉的ACAR蛋白之外，设想了可以使用其他ACAR蛋 白，包括但不限于从巴西诺卡氏菌（Nocardia brasiliensis) (GENBANK登记号EHY26728)、 皮疽诺卡氏菌（Nocardia farcinica) (GENBANK 登记号 BAD56861)、柄抱壳（Podospora anserina) (GENBANK 登记号 CAP62295)或奠生奠壳菌（Sordaria macropora) (GENBANK 登 记号CCC14931)分离到的与N. iownsis或粗糙脉孢霉的ACAR蛋白具有显著序列同一,性的 ACAR蛋白。
【主权项】
1. 一种用于生产香草醛和/或香草醛P -D-葡萄糖苷的方法，所述方法包括： (a) 提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体儿茶 酚-O-甲基转移酶（COMT)多肽的异源核酸； (b) 将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时 间；以及 (c) 从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此生 产香草醛和/或香草醛0 -D-葡萄糖苷。2. 权利要求1的方法，其中所述宿主还带有编码突变体Arom多功能酶（AROM)多肽的 异源核酸。3. 权利要求2的方法，其中所述突变体AROM多肽相对于野生型AROM多肽表现出降低 的莽草酸脱氢酶活性。4. 权利要求2或3的方法，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个： (a) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处，缬氨酸之外的 氨基酸； (b) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处，苏氨酸之外的 氨基酸； (c) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处，赖氨酸之外的 氨基酸； (d) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处，异亮氨酸之外 的氨基酸； (e) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处，苏氨酸之外的 氨基酸； (f) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处，丙氨酸之外的 氨基酸； (g) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处，精氨酸之外的 氨基酸； (h) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处，脯氨酸之外的 氨基酸； (i) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处，丙氨酸之外的 氨基酸；以及 (j) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处，色氨酸之外的 氨基酸。5. 权利要求2或3的方法，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个： (a) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处的甘氨酸残基； (b) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处的甘氨酸残基； (c) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处的亮氨酸残基； (d) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处的组氨酸残基； (e) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处的赖氨酸残基； (f) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处的脯氨酸残基； (g) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处的色氨酸残基； (h) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处的赖氨酸残基； (i) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处的脯氨酸残基； 以及 (j) 在与SEQ ID NO :4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处的缬氨酸残基。6. 权利要求2或3的方法，其中所述突变体AROM多肽缺失结构域5的至少一部分。7. 权利要求2、3或6的方法，其中所述突变体AROM多肽缺少结构域5。8. 权利要求2、3、6或7的方法，其中所述突变体AROM多肽是融合多肽，其包含： (i) 缺失结构域5的至少一部分；并且 (ii) 具有3-脱氢莽草酸脱水酶（3DSD)活性。9. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽能够催化原儿茶酸的-OH 基团的甲基化，其中所述甲基化导致产生与异香草酸相比至少4倍多的香草酸。10. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽具有在SEQ ID NO :27的 整个长度上确定的与SEQ ID NO :27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列；并且其具有 的氨基酸序列与SEQ ID NO :27的差别为至少一个氨基酸残基。11. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO :27中显示 的氨基酸序列中包含1至10个氨基酸置换。12. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO :27的198位 置处包含具有比亮氨酸更低的亲水指数的氨基酸。13. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO :27的198位 置处包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gin、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 和 Tyr〇14. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO :27的199位 置处包含在pH 7. 4下具有中性或正的侧链电荷的氨基酸。15. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQ ID NO :27的199 位置处包含 Ala、Arg、Asn、Cys、Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、 Tyr 和 Val 〇16. 前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体COMT多肽还在所述多肽的N-端或 C-端包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。17. 权利要求2-16任一项的方法，其中所述突变体AROM多肽还在所述多肽的N-端或 C-端包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。18. 前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是微生物。19. 前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希氏杆菌 (Escherichia coli)〇20. 前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是包含pdcl缺失、gdhl缺失并且过表 达谷氨酸脱氢酶2 (GHD2)的酿酒酵母（S.cerevisiae)。21. 权利要求1-17任一项的方法，其中所述宿主是植物或植物细胞。22. 权利要求1-17和21任一项的方法，其中所述宿主是小立碗藓属 (Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞。23. 前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主还包含编码3-脱氢莽草酸脱水酶 (3DSD)的基因、编码芳香族羧酸还原酶（ACAR)的基因、编码尿苷5'-二磷酸葡萄糖基转移 酶（UGT)的基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTase)的基因和/或编码香草醇氧化酶 (VAO)的基因。24. 前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主带有编码突变体COMT多肽的异源核 酸，并且还包含编码野生型AROM多肽的基因。25. 权利要求1-23任一项的方法，其中所述宿主带有编码突变体AROM多肽的异源核 酸，并且还包含编码野生型0-甲基转移酶（OMT)的基因。26. -种提取物，其包含通过前述任一方法生产的香草醛和/或香草醛葡萄糖苷。27. -种消费品，其包含权利要求26的提取物。28. 权利要求27的消费品，其中所述消费品是食品、药物组合物、饮食增补剂、营养品、 牙齿卫生组合物、餐桌甜味剂或化妆品。29. -种分离的突变体儿茶酚-0-甲基转移酶（COMT)多肽，其中所述突变体COMT多肽 能够催化原儿茶酸的-OH基团的甲基化，其中所述甲基化导致产生与异香草酸相比至少4 倍多的香草酸。30. 权利要求29的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽具有在SEQ ID NO :27的整个长度上确定的与SEQ ID NO :27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列；并 且其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO :27的差别为至少一个氨基酸残基。31. 权利要求29或30的分离的突变体COMT多肽，其在SEQ ID NO :27中显示的氨基 酸序列中包含1至10个氨基酸置换。32. 权利要求29-31任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在 SEQ ID NO :27的198位置处包含具有比亮氨酸更低的亲水指数的氨基酸。33. 权利要求29-32任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在 SEQ ID NO :27 的 198 位置处包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gin、Gly、His、Lys、Met、 Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 和 Tyr〇34. 权利要求29-33任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在 SEQ ID NO :27的199位置处包含在pH 7. 4下具有中性或正的侧链电荷的氨基酸。35. 权利要求29-34任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽在 SEQ ID NO :27 的 199 位置处包含 Ala、Arg、Asn、Cys、Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、 Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val 〇36. 权利要求29-35任一项的分离的突变体COMT多肽，其中所述突变体COMT多肽还在 所述多肽的N-端或C-端包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或 分泌标签。37. -种分离的核酸，其编码权利要求29-36任一项的突变体COMT多肽。38. -种重组宿主，其包含编码权利要求29-36任一项的突变体COMT多肽的异源核酸。39. 权利要求38的重组宿主，其中所述重组宿主还包含编码3-脱氢莽草酸脱水酶 (3DSD)多肽的核酸、编码芳香族羧酸还原酶（ACAR)多肽的核酸、编码磷酸泛酰巯基乙胺转 移酶（PPTase)多肽的核酸、编码尿苷5'-二磷酸葡萄糖基转移酶（UGT)多肽的核酸和/或 编码香草醇氧化酶（VAO)的核酸。40. 权利要求38或39的重组宿主，其中所述宿主带有编码突变体COMT多肽的异源核 酸，并且还包含编码野生型AROM多肽的基因。41. 权利要求38或39的重组宿主，其中所述宿主带有编码突变体AROM多肽的异源核 酸，并且还包含编码野生型0-甲基转移酶（OMT)的基因。42. 权利要求38-41任一项的重组宿主，其中所述重组宿主是微生物。43. 权利要求38-42任一项的重组宿主，其中所述重组宿主是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希 氏杆菌（Escherichia coli) 〇44. 权利要求38-41任一项的重组宿主，其中所述宿主是植物或植物细胞。45. 权利要求38-41和44任一项的重组宿主，其中所述宿主是小立碗藓属 (Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞。
【专利摘要】本发明涉及用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法。具体地，本发明公开了已被工程化改造以单独地或与一种或多种香草醛生物合成酶类或UDP-糖基转移酶(UGT)组合地表达突变体AROM多肽和/或突变体儿茶酚-O-甲基转移酶多肽的重组微生物、植物和植物细胞。这样的微生物、植物或植物细胞可以生产香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷。
【IPC分类】C12P7/24, C12N1/19, C12N1/21, A23L1/30, C12N5/10, C12N9/10, C12N15/54, C12P19/44
【公开号】CN105063104
【申请号】CN201510390606
【发明人】于尔根·汉森, 埃斯本·哈尔克耶尔·汉森, 霍尼·泊卢尔, 约瑟夫·M·谢里登, 乔纳森·R·希尔, 威廉·D.O.·汉密尔顿
【申请人】国际香料香精公司, 伊沃华公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2012年8月7日
【公告号】CN103987840A, EP2742126A1, EP2742126A4, US20140245496, WO2013022881A1, WO2013022881A8