一种酵母生产(s)-氟苯羟丙酸甲酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到产朊假丝酵母细胞生物催化制备手性 医药中间体（S) -3- (4-氟苯基）-3-羟基丙酸甲酯的技术。
【背景技术】
[0002] 手性（S) -3- (4-氟苯基）-3-羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品 和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等 优点，作为绿色高效制备手性化合物的优先途径，被越来越多地应用于生产一些高附加值 的手性化合物。生物催化制备手性（S)-3_(4-氟苯基）_3_羟基丙酸甲酯具有很好的应用 前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中，水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来，氧化还原 酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前，采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4: 2:1。
[0004] 生物还原法相对于动力学拆分法而言，最大的优势在于理论收率可达100%，原子 经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与，一定程度上限制了其应用。由于 辅酶依赖性的缘故，生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂，实现体内辅酶循环再生的 同时免去了酶的分离纯化步骤。
[0005] (S)-3_(4-氟苯基）_3_羟基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重 要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严 重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备（S)-3_(4-氟苯基）_3_羟 基丙酸甲酯。
【发明内容】
[0006] 本发明采用产朊假丝酵母细胞催化制备（S) -3- (4-氟苯基）-3-羟基丙酸甲酯，反应式 如下：
底物4-氟苯甲酰乙酸甲酯（1)经产朊假丝酵母催化反应，得到产物（S)-3-(4-氟苯 基）-3-羟基丙酸甲酯（2)。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采 用产朊假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%) 均很高。
[0007] 许多产朊假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经 实验，本发明选用产朊假丝酵母菌株为ATCC 34964，其催化反应效果最佳。
[0008] 由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD (P)H依赖型，而细胞本身所含有的辅酶量 可能较少，因此，进行氧化还原反应时，为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中 还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同， 效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳 的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：木糖20-24g/L、麦芽糖36-40g/L、异 丙醇3. 5-4. 5%V/V (体积浓度）。
[0009] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。
[0010] 培养介质： 1、种子培养基成份为：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH为 6. 0;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0011] 2、培养液成份：葡萄糖 20-22 g/L，麦芽浸膏 23-25 g/L，（NH4)2S04 4. 8-5 . 3 g/L， KH2P049-11g/L，MgS04. 7H20 0? 3-0. 4 g/L，CaCl20? 35-0. 4 g/L,硫酸铵 0? 2-0. 25g/L，硫 酸镁 0? 3-0. 4g/L，pH5. 6。
[0012] 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0013] 酵母细胞制备。产朊假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入 培养液，装料系数为〇. 6-0. 7,121°C高压灭菌30分钟，冷却至30-31°C，将产朊假丝酵母种 子液接种至发酵罐，接种比例为6-6. 5%，通气比为1. 7-1. 8VAV分钟)，30-31°C培养44-46 小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0014] 生物催化转化 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为6.0,加入底物4-氟苯甲酰乙酸甲 酯，使底物浓度为80-90 g/L。其他成份：麦芽浸膏22-26 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚为 19-20g/L，木糖 20-24g/L、麦芽糖 36-40g/L、异丙醇 3. 5-4. 5%V/V (体积浓度），121°C 高压灭 菌30分钟；冷却至30-31°C时，加入湿酵母细胞使浓度为61-66g/L，通气比为0. 15-0. 16V/ (V分钟)，即每分钟通气量为0. 15-0. 16倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间 为65-70小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物 (S) -3- (4-氟苯基）-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率98-99 %，产品收率96-97 %，对映体过量 率 98. 5-99%。
[0015] 本发明所开展工作包括菌株选择、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反 应介质选择和浓度优化，包括底物浓度、麦芽浸膏含量、辅助底物组合、表面活性剂种类及 浓度等。
[0016] 实施例1 种子培养基成份为：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH为6.0; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0017] 培养液成份为：葡萄糖20 g/L，麦芽浸膏23 g/L，木糖6 g/L，（NH4)2S04 4. 8 g/L， KH2P04 9 g/L，MgS04. 7H20 0? 3 g/L，CaCl2 0? 35 g/L，硫酸铵0? 2g/L，硫酸镁0? 3g/L，pH为6. 0. 2〇
[0018] 湿酵母细胞制备过程如下：产朊假丝酵母ATCC 34964经斜面、摇瓶培养，得到种 子液。10L发酵罐加入培养液，121°C高压灭菌30分钟，冷却至30-31°C，将产朊假丝酵母 种子液接种至发酵罐，接种比例为6%，通气比为1. 7V/ (V分钟），30-31°C培养46小时，用 过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
[0019] 生物催化转化：0. 5L底部通气搅拌反应器中加入磷酸盐缓冲液，pH为6. 0,加入 底物4-氟苯甲酰乙酸甲酯，使浓度为80 g/L，麦芽浸膏22 g，直链的10碳醇聚氧乙烯醚 为20g/L，木糖24g/L、麦芽糖36g/L、异丙醇3. 5%V/V (体积浓度），121°C高压灭菌30分钟； 冷却至30-31°C时，加入湿酵母细胞使浓度为61g/L，通气比为0. 15V/ (V分钟)，进行生物 催化反应，反应时间为70小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸 乙酯，得到产物（S) -3- (4-氟苯基）-3-羟基丙酸甲酯，反应转化率99 %，产品收率97 %，对 映体过量率98. 5%。
[0020] 实施例2 种子培养基成份为：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g