用于得到对盐胁迫具有增强抗性的植物的质粒载体和方法与流程

本发明涉及植物育种领域，更特别地，涉及用于得到对盐胁迫具有增强抗性的植物的质粒载体和方法。

背景技术：

植物经常处于逆境胁迫的环境中，植物应对胁迫常见的响应就是促进活性氧的积累(Halliwell et al.，1998)。RCD1蛋白是植物逆境和生长发育过程中一个重要的调节因子(Jaspers et al.，2009；Teotia S et al.，2009)。SRO是植物特有的小蛋白家族，在拟南芥中，该家族共有六个成员，包括RCD1和5个SROs(SIMILAR-TO-RCD-ONE)，即AtSRO1-AtSRO5(Jaspers et al.，2009)。RCD1蛋白包含一个保守的球状WWE结构域和一个PARP(poly ADP-ribose polymerase)结构域，WWE结构域可以调节特定蛋白质之间的相互作用(Aravind et al.，2001)。

土壤盐渍度是一个影响植物生长和农业生产力的重要环境因素，盐渍土中的Na⁺在植物体细胞质中过度积累对植物生长发育是不利的(Liu et al.，2001)。SOS(saltoverly sensitive)途径负责维持植物体内的Na⁺平衡(Zhu et al.，2002)，Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1定位于质膜上，它可以将细胞内的Na⁺排出(Qiu et al.，2002)。拟南芥中，过量表达SOS1可以提高抗盐胁迫能力。前人研究表明，拟南芥SOS1和RCD1在盐胁迫和氧化胁迫时发生相互作用，共同参与植物的抗盐和抗氧化途径(Katiyar-Agarwal et al.，2006)。

植物体内对氧化胁迫的响应有利于植物的正常生长发育。前人研究表明酵母的Yap1(Yeast activator proteins1)参与酵母细胞对H₂O₂引起的氧化胁迫反应，它作为H₂O₂转录因子在氧化胁迫信号中扮演重要角色(Carmel‐Harel et al.，2001；Fernandes et al.，1997)。植物中有许多参与氧化胁迫的相关因子已被深入研究，比如致病相关蛋白(RP)、抗坏血酸氧化酶(APX)、苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等(Teotia et al.，2009)。Belles-Boix等研究表明，拟南芥RCD1可以增强酵母抗氧化能力并互补Yap1突变酵母表型，表明AtRCD1在拟南芥的氧化胁迫中扮演重要的角色(Belles-Boix et al.，2000)。拟南芥突变体rcd1-1表现出对臭氧和超氧化物超敏感，引起超氧根离子的积累，并在短时间内传播病态(Overmyer et al.，2005)。此外，突变体还表现出对脱落酸、乙烯、茉莉酸甲酯敏感度降低，并且这几种植物激素调节基因的表达量也发生了改变(Overmyer et al.，2000)。因此，AtRCD1在调节拟南芥的生长发育及对环境胁迫的反应中发挥重要作用。

拟南芥中，AtRCD1的同源基因AtSROs在PARP(Poly ADP-ribose polymerase)催化中心和C-末端的RST[RCD-SRO-TAF4(TATA-box-binding protein-associated factor 4)]结构域上与AtRCD1具有高度保守性(Jaspers et al.，2009)。研究表明，AtSRO1与AtRCD1之间在功能上存在部分功能冗余,AtSRO1同样参与到非生物胁迫反应当中(Ahlfors et al.，2009；Jaspers et al.，2009；Overmyer et al.，2000)，AtSRO5表达明显受盐胁迫诱导(Borsani et al.，2005)，AtSRO2、AtSRO3和AtSRO5也显示出对多种非生物胁迫下转录子水平的变化,比如强光、盐处理及O₃(Jaspers et al.，2010)。然而AtSRO4的研究相对较少，没有相关类似的功能。

在拟南芥中RCD1已经进行了克隆和功能鉴定，但是在苹果中的尚未见报道。因此，需要一种得到对盐胁迫具有增强抗性的植物的方法。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明提供了一种用于得到对盐胁迫具有增强抗性的植物的质粒载体，其包含MdRCD1基因表达框和筛选标记，所述MdRCD1基因表达框由包含在植物中组成型表达的强启动子和由所述强启动子控制表达的MdRCD1基因，所述MdRCD1基因表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述MdRCD1基因的序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述植物是拟南芥、苹果、桃、梨、杨树、小麦、玉米或水稻。

优选地，所述质粒载体由所述MdRCD1基因顺着CaMV35S启动子的转录方向插入到PRI101质粒的SalⅠ和EcoRⅠ之间得到。

本发明还提供了一种用于得到对盐胁迫具有增强抗性的植物的方法，其包括以下步骤：将所述质粒载体导入植物的愈伤组织细胞中，筛选携带有所述质粒载体的愈伤组织细胞，并将其培育成植株，即得到所述对盐胁迫具有增强抗性的植物。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；

2)用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404转化所述植物愈伤组织细胞共培养，得到被所述质粒载体转化的植物；

3)通过所述筛选标记筛选被所述转化的植物愈伤组织细胞；

4)通过组织培养将筛选得到的所述被转化的植物愈伤组织细胞培育成植株，即得到所述对盐胁迫具有增强抗性的植物。

优选地，所述植物是拟南芥、苹果、桃、梨、杨树、小麦、玉米或水稻。

优选地，所述植物是苹果。

优选地，所述质粒载体通过将所述MdRCD1基因顺着CaMV35S启动子的转录方向插入到PRI101质粒的SalⅠ和EcoRⅠ之间来得到。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)通过电转法将所述质粒载体转入LB4404农杆菌中，通过卡那霉素和PCR筛选携带有所述质粒载体的LB4404；

2)然后将携带有所述质粒载体的LB4404接种于10mL包含50mg/L卡那霉素的的YEP液体培养基中，于28℃、200rpm下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，离心收集菌体，用MS液体培养基重悬稀释20倍，得到转化用的菌液，将苹果愈伤组织在所述转化用的菌液中浸泡10min，期间多次摇晃，除去所述转化用的菌液，将经浸泡的苹果愈伤组织转移至含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的pH5.8的MS培养基中，于26℃黑暗下培养2d；

3)将步骤2)得到苹果愈伤组织用无菌双蒸水清洗2-3次后，均匀地铺到含有500mg/L头孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的pH5.8的MS培养基的筛选培养基上进行筛选，得到转染了所述质粒载体的苹果愈伤组织细胞；

4)使用含有500mg/L头孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的pH5.8的MS培养基将所述转染了所述质粒载体的苹果愈伤组织细胞培育成植株，即得到所述对盐胁迫具有增强抗性的植物。

附图说明

图1为苹果MdRCD1基因编码区全长的RT-PCR扩增产物的电泳照片；

图2为转基因苹果愈伤组织中MdRCD1的相对表达量，以王林苹果愈伤组织中的MdRCD1相对表达量为1。

具体实施方式

以下结合实例和附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

基于苹果愈伤组织是单细胞组织，具有繁殖能力强、离体培养再生能力强、遗传转化效率高等优点，是苹果研究领域普遍的研究材料。

1.对苹果中MdRCD1基因的研究

发明人检测了MdRCD1基因在嘎啦苹果中无胁迫条件下和高盐浓度下的表达情况，发现MdRCD1基因在高盐浓度下的上调表达，暗示MdRCD1基因可能苹果的盐胁迫抗性有关。

2.苹果中MdRCD1基因的克隆以及表达载体的构建

1)发明人通过使用引物1：5’-ATGGAAGCAAAGGTCGCAAAG-3’(SEQ ID NO:3)和引物2：5’-CTCATTGCTTTTATGAGGT-3’(SEQ ID NO:4)，通过RT-PCR从嘎啦苹果扩增得到MdRCD1基因片段(图1)，将其连接到pMD18-T质粒上，得到pMD18-T-MdRCD1质粒，经测序得到正确的克隆，该基因的基因序列如SEQ ID NO:2所示，基因表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2)使用引物3：5’-GTCGACATGGAAGCAAAGGTCGCAAAG-3’(SEQ ID NO:5，下划线标示SalⅠ酶切位点)和引物4：5’-GAATTCCTCATTGCTTTTATGAGGT-3’(SEQ ID NO:6，下划线标示EcoRⅠ酶切位点)，从上述质粒PCR扩增得到带有SalI和EcoRI酶切位点的MdRCD1基因片段；

3)将上述片段经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接到同样经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切的PRI101质粒质粒上，筛选正确的阳性克隆，得到MdRCD1基因表达质粒载体。

3.MdRCD1基因表达质粒载体转化LB4404

通过电转法将MdRCD1基因表达质粒载体转入LB4404农杆菌中，通过卡那霉素和PCR筛选携带有所述质粒载体的LB4404；

4.农杆菌转化王林苹果愈伤组织细胞

将携带有MdRCD1基因表达质粒载体的LB4404接种于10mL包含50mg/L卡那霉素的的YEP液体培养基中，于28℃、200rpm下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，离心收集菌体，用MS液体培养基重悬稀释20倍，得到转化用的菌液，将苹果愈伤组织在所述转化用的菌液中浸泡10min，期间多次摇晃，除去所述转化用的菌液，将经浸泡的苹果愈伤组织转移至含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的pH5.8的MS培养基中，于26℃黑暗下培养2d；

得到苹果愈伤组织用无菌双蒸水清洗2-3次后，均匀地铺到含有500mg/L头孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的pH5.8的MS培养基的筛选培养基上进行筛选，得到转染了所述质粒载体的苹果愈伤组织细胞；

使用含有500mg/L头孢霉素、30mg/L卡那霉素、1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7.5g/L琼脂的pH5.8的MS培养基将所述转染了所述质粒载体的苹果愈伤组织细胞培育成植株，即得到所述对盐胁迫具有增强抗性的植物。

5.转基因苹果愈伤组织抵抗盐胁迫的分析

(1)MdRCD1基因在转基因苹果愈伤中的相对表达量

利用筛选培养基(含100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素)筛选抗卡那霉素阳性的候选转基因株系，共获得4个35S:MdRCD1阳性株系(1-4)；为进一步鉴定转基因株系，在进行继代培养时，每株系各取0.1g左右的愈伤组织，提取相应的RNA，反转录并进行定量qRT-PCR检测(具体方法见实例3)，以确定这些株系中MdRCD1基因的表达水平。结果显示，MdRCD1基因在1-4中均过量表达(图2)。由于株系1中表达量较高，选择株系1继续扩繁，为MdRCD1基因的进一步功能鉴定准备材料。

为了进一步确定转基因愈伤的功能，发明人对转基因苹果愈伤进行抗盐能力分析。

(3)逆境处理：选择生长状态良好且均一的王林和苹果愈伤，进行不同浓度的盐胁迫逆境处理。

(4)结果观察：15天以后，对王林愈伤和转基因愈伤在盐胁迫条件下的生长状况。结果发现：WL和MdRCD1-OX在0mmol·L-1的培养基上生长状态基本一致，随着盐浓度的提高，它们的长势越来越差，但是可以观察到，过量表达MdRCD1的愈伤组织的长势明显好于WL愈伤。这些结果充分说明了MdRCD1基因是一个抗盐相关的基因，该基因的过量表达可以提高转基因苹果愈伤的抗盐能力。

根据上述技术，本发明从苹果中克隆了基因MdRCD1，通过遗传转化苹果愈伤鉴定了其可以明显提高抗盐性，为进一步研究MdRCD1的功能奠定了基础，使其作为苹果砧木抗逆性分子改良的候选基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。