植物磺肽素‑α在提高植物灰霉病抗性中的应用的制作方法

本发明涉及植物化学保护技术领域，尤其涉及植物磺肽素-α在提高植物灰霉病抗性中的应用。

背景技术：

番茄在我国的栽培面积和总产量均位居世界首位，需求量和种植面积都在逐年增加。各种细菌性、病毒性以及真菌性病害的发展也更为猖獗，造成了番茄生产极为严重的经济损失。真菌病害为已知病害种类中种类最多的病害，约占病害种类的80-90％，症状类型也最多，出现在植物的各个部位。灰霉病botrytiscinerea即为真菌性病害中极为重要的一种，由半知菌亚门的灰葡萄孢(botrytiscinerea)引起，在低温高湿等适宜条件下，萌发的分生孢子随气流、灌溉水和农具等传播，并从寄主伤口或枯死的组织上进行侵染，严重时导致作物减产甚至绝收，也已成为当前我国乃至世界上番茄生产的限制性障碍。除番茄外，灰霉病菌还会侵染茄子、黄瓜、辣椒、草莓、葡萄、大蒜、生菜、柑橘等约200余种作物。

迄今为止，尚未发现对灰霉病菌具有抗性的作物品种，因此，生产上灰霉病防治一直依赖于化学防治。目前，用于防治灰霉病的药剂主要有苯并咪唑类(包括多菌灵和甲基硫菌灵)、二甲酰亚胺类(包括腐霉利和异菌脲等)、n-苯氨基甲酸酯类(主要为乙霉威)、百菌清和苯氨基嘧啶类杀菌剂(主要为嘧霉胺)。

其中，二甲酰亚胺类和乙霉威是目前防治灰菌霉病的骨干药剂。这些杀菌剂大多作用于病菌的微管蛋白或抑制病菌孢外蛋白酶，直接破坏病菌细胞的有丝分裂或功能，可有效防止灰霉病菌某些菌群的流行，减少灰霉病的发生。但是，长期以来，大量农药的不合理使用造成了水体、土壤、大气污染和农产品有毒物质残留，严重危及农业生态系统的稳定和人类健康。另外，灰霉病菌因具有寄主范围广、繁殖快和遗传变异频繁等特点，有研究表明流行灰霉病菌对常用的防治药剂均产生了不同程度的抗药性，进一步加大了相关化学农药的投用量，加剧了农产品及环境安全问题。因此，寻找一种高效无害的病害防治手段是今后农作物灰霉病害防治研究和发展的方向。

植物诱导抗病性是利用植物本身的防卫体系，借助于诱导因子激发植物整体抗性水平，使原来的感病反应产生局部的或系统的抗性，提高抵抗病害的能力，又称获得性免疫，是植物病害防治的一种新思路。

一般来说，植物通过诱导物产生系统抗病性，随后通过内源信号传递至整个植株，产生一系列的生理生化反应，激活植物体内的抗病基因，产生一些具有抗病毒活性的物质。植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间较长、可掌控的抗病性表达时间和空间等优点，其中最重要的是目前发现的大部分诱导物对环境无污染，如能田间实际应用，将会在一定程度上减少化学农药的使用，对降低农残，加快无毒农药取代有毒农药的进程，以及改善生态环境和生态平衡都具有重要意义。

脂类、多糖、核酸类、蛋白类物质均能够诱导寄主植物产生系统抗病性。目前我国防治蔬菜病毒病的生物制剂有效成分主要包括香菇多糖、葡聚烯糖、低聚糖素、宁南霉素、氨基寡糖素、苦参碱等，这些成分可以激发植株自身的防御系统，同时对某些病毒的复制和扩散有一定的作用。但目前针对灰霉病进行防治的生物制剂的研究和应用还相对较少。

植物磺肽素(psk)是一种植物肽，最初在芦笋叶肉细胞悬浮培养中的培养基中得到鉴定分离。psk由约80个氨基酸长的前体肽经酪氨酸残基的翻译后磺化和蛋白水解加工而产生(yang等，“oryzasativapskgeneencodesaprecursorofphytosulfokine-α,asulfatedpeptidegrowthfactorfoundinplants”proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1999,96:13560-13565)。剪切修饰后成熟的psk以两种形式存在：磺化的五肽pskα([h-tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh])及其c-端截短的四肽pskβ([h-tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh])(matsubayashiy.等，“phytosulfokine,sulfatedpeptidesthatinducetheproliferationofsinglemesophyllcellsofasparagusoficinalisl.。”proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，1996，93:7623-7627)，被认为是一种新型的“肽类激素”。

其结构式如下：

目前，对pskα已有的研究表明，其在细胞增殖和分化、分生组织形成、自交不亲和性、器官脱落、气孔运动、抗性反应等过程中均具有植物生长调节物质的属性(matsubayashi等，“peptidehormonesinplants。”annualreviewofplantbiology，2006，57:649-674)。

在pskα参与植物抗病性的研究中，pskα对不同的病原菌的作用有所不同。拟南芥植物pskα的受体pskr1/pskr2双突变体较野生型植株对黑斑病菌alternariabrassicicola更加敏感。与此形成对比，拟南芥pskr1/pskr2突变体却对细菌性叶斑病菌pseudomonassyringae更具抗性(igarashi等，“thepeptidegrowthfactor,phytosulfokine,attenuatespattern-triggeredimmunity。”theplantjournal，2012，71:194-204)。

技术实现要素：

本发明发现植物磺肽素-α(pskα)具有通过与其受体结合后产生细胞质ca信号，进一步通过钙调蛋白(calmodulin)作用提高植物对灰霉病的抗性，降低植物灰霉病的发生。

基于以上发现，本发明提供了植物磺肽素-α在提高植物灰霉病抗性中的应用。

本发明还提供了pskα在制备提高植物灰霉病抗性的制剂中的应用。

所述的植物具体可以为番茄。

pskα是由约80个氨基酸长的前体肽经酪氨酸残基的翻译后磺化和蛋白水解加工而产生的五肽；可诱导提高植物ca信号合成，以及cam1、cam2、cam3、cam6等的表达从而提高植物对灰霉病的抗性。

本发明还提供了一种提高植物灰霉病抗性的制剂，所述制剂的有效成分为植物磺肽素-α；以1l计，包括：植物磺肽素-α6.5～10.5g；表面活性剂0.02～0.03l；水0.97～0.98l。

所述表面活性剂可使制剂在植物表面的湿润、分散、展着和渗透性能显著增强，有效减少制剂喷洒后随风漂移，提高制剂的抗雨水冲刷能力和药效、减少制剂的用量、延长制剂的有效期。

所述表面活性剂可采用有机硅、吐温60或silwet-l77中的一种；优选为有机硅，有机硅表面活性剂价格更为低廉，且在提高制剂的延展性、降低制剂表面张力上效果更为显著，使制剂更易被植株吸收。

更优选，所述的制剂，以1l计，包括：植物磺肽素-α8.47g；表面活性剂0.025l；水0.975l。在上述各组分配比下制得的制剂中，植物磺肽素-α在植物表面的分散性、展着性以及渗透性效果最佳。

所述的制剂通过如下方法进行制备：

(1)将植物磺肽素-α先溶解于少量水中，再加水，得到混合溶液；

(2)向混合溶液中加入表面活性剂，获得所述制剂。

本发明还提供了一种提高植物灰霉病抗性的方法，包括：将所述的制剂用水稀释后喷施于植物叶片表面或滴灌在植物根部附近。

本发明制剂可在连续强光、高温、干旱等易发番茄灰霉病的环境下或已出现轻微灰霉病症状的时期进行使用。

制剂的使用浓度、次数，尤其是制剂中pskα的浓度可根据植物的苗龄、具体生长情况以及植物生长环境情况、病害程度来确定。

作为优选，所述的制剂稀释后，喷施于植物叶片表面的植物磺肽素-α的浓度为67.76～101.64mg/l。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明对于已知化合物磺肽素-α发掘了新的提高植物灰霉病抗性的用途，开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明制剂中的磺肽素-α为植物友好型物质，可在环境和生物体内降解，使用后也无残留，对人畜和环境无毒害。

(3)本发明以磺肽素-α为主要有效成分制备的制剂，通过诱导植物体内的ca信号路径，可显著增强植物对灰霉病的抗性，减少因灰霉病给植株带来的经济损失。

(4)采用本发明制剂防治植物灰霉病简单易行，成本较低，可显著延迟和抑制灰霉病菌在叶片上的生长及病害的扩散，大大提高了植株对灰霉病的抗性。

附图说明

图1为实施例1中番茄灰霉病接种后第3天，喷施制剂与喷清水对照间的番茄叶片中灰霉病原菌的actin的相对含量进行比较；

空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图2为实施例2中喷施过制剂与喷清水对照的植株进行番茄灰霉病接种后，番茄叶片病害发生情况的比较；

a为番茄灰霉病菌接种3天后病毒病发病率；b为番茄灰霉病菌接种3天后叶片中灰霉病原菌的actin相对含量的比较；

空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写字母a、b代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

图3为实施例3中本发明制剂的田间效应，喷施过制剂与喷清水对照的番茄病害发生率与发生严重情况的比较；

a为番茄灰霉病发生率；b为喷施与未喷施本发明制剂后健康与发病番茄叶片的净光合速率(pn)；空心柱代表对照植株，斜纹柱代表处理植株；小写字母a、b、c代表不同处理间在5％水平上的差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1

一、制剂的制备

取磺肽素-α(pskα)2.54g(药品购自法国neomps公司)；缓慢加入294.0ml的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入6.0ml的有机硅溶液，搅拌均匀后，获得制剂。

二、制剂的施用和检测

取上述制剂100毫升，加清水10升，混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为四叶一心的番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。

对经过上述制剂处理的植株及对照植株进行灰霉病喷施接种处理，使病菌悬浮液均匀分布在叶片上，灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、12h光照/12h黑暗、光强为200μmolm^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。

同时，随机取叶片样品，利用美国invitrogen公司生产的trizol、superscriptii试剂盒进行rna提取、纯化及rna的反转录，后利用美国appliedbiosystems公司生产的steponeplusreal-timepcrsystem仪器及该公司的sybrrt-pcrkit荧光染料试剂盒对灰霉病菌的actin基因进行检测。

结果如图1所示，上述制剂处理的植株叶片比对照的植株叶片具有明显较强的灰霉病抗性。接种后3天，经制剂处理过的植株上部幼嫩叶片内的灰霉病原菌actin基因的相对含量为对照植株的24.8％

实施例2

一、制剂的制备

取磺肽素-α(pskα)2.03g(药品购自法国neomps公司)；缓慢加入292.5ml的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入7.5ml的有机硅溶液，搅拌均匀后，获得制剂。

二、制剂的施用和检测

取上述制剂100毫升，加清水10升，混合均匀后，在傍晚均匀喷施于苗龄为四叶一心的番茄叶片表面，直至叶片湿润为止，持续喷施2天，以喷清水的番茄植株作为对照。

对经过上述制剂处理的植株及对照植株进行灰霉病喷施接种处理，使病菌悬浮液均匀分布在叶片上，灰霉病病原菌接种浓度为2×10⁵孢子/毫升。将上述处理的所有植株置于25℃、95％湿度、12h光照/12h黑暗、光强为200μmolm^-2s^-1的环境下放置3天后观察植株发病情况。

同时，随机取叶片样品，利用美国invitrogen公司生产的trizol、superscriptii试剂盒进行rna提取、纯化及rna的反转录，后利用美国appliedbiosystems公司生产的steponeplusreal-timepcrsystem仪器及该公司的sybrrt-pcrkit荧光染料试剂盒对灰霉病菌的actin基因进行检测。

结果如图2a和b所示，接种第3天后，在对照植株中，人工接种后灰霉病的发病率为66％，而该制剂处理后的番茄灰霉病的发病率则下降了64％，叶片灰霉病原菌的actin相对含量也比对照下降了73.5％。

实施例3

一、制剂的制备

取磺肽素-α(pskα)3.05g(药品购自法国neomps公司)；缓慢加入291.0ml的水，并将混合溶液混合均匀，最后向混合溶液中加入9.0ml的有机硅溶液，搅拌均匀后，获得制剂。

二、制剂的施用和检测

选取栽培技术及管理完全一致的两个相邻的塑料大棚，对处理棚使用上述制剂，取制剂200毫升，加清水20升，混合均匀后，在清晨和傍晚分两次均匀喷施于苗龄为七叶一心的番茄叶片表面至叶片湿润为止，持续喷施2天；而对照棚仅喷施相同体积的水。

7天后随机统计处理棚与对照棚中各60株番茄的发病率，并通过光合作用参数比较处理棚与对照棚植株的健康状况。光合作用速率采用美国li-cor公司生产的便携式光合仪li-6400测定净光合速率，叶片温度、光强和co2浓度分别设定为25℃、800μmolm^-2s^-1、360μmolmol^-1。

结果如图3所示，在番茄灰霉病处理本发明制剂7天后，明显增强了番茄植株对灰霉病的抗性，本发明制剂处理的植株比对照植株的病株率下降了56.7％。处理植株与对照植株中未发病健康植株的净光合速率(pn)相似，上述制剂处理后仍然发病的植株也比对照条件下发病植株的净光合速率(pn)平均高38.4％。