本发明属于生物技术领域，尤其是涉及CYP101酶重组载体及构建方法、CYP101酶高效表达纯化方法。
背景技术：
细胞色素P450(cytochrome P450，简称CYP450)为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，广泛存在于自然界多种生物体内，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。其参与过程大致可以分成三方面：体内激素物质的合成，外源物质代谢及脂肪酸分解。它们最初由Garfinkel和Klingenberg在1958年从哺乳动物的肝脏微粒体中被发现，由于此类蛋白在还原状态下能与CO结合，结合后可以在波长为450nm处检测到明显吸收峰，因此被命名为细胞色素P450酶。分子生物学技术被应用到对细胞色素P450的研究中，使用细菌载体来表达CYP450成为广泛使用的技术方法。CYP450基因的克隆、序列分析、多底物催化反应类型成为研究热点。
CYP101(cytochrome P450 101)，又名P450cam，来自于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)，它是研究细胞色素P450的模式蛋白之一。细胞色素氧化酶CYP101，其基因序列全长1245bp，序列如SEQ ID NO.1所示，编码415个氨基酸。它催化单萜D-樟脑5-外-羟基化作用，随后樟脑降解为乙酸和异丁酸以提供代谢所需。细菌的细胞色素P450中，CYP101酶是对结构和功能研究最广泛的模型之一，P450的研究是目前国际研究的热点，不同领域的科学家正在从不同的角度来揭示其本质。而CYP101作为研究细胞色素P450结构和功能的模式蛋白之一，因此，表达出具有高效稳定和高纯度的CYP101酶是后续研究的关键。
传统的纯化方法，为了获得高纯度的酶，往往用到三种以上的纯化方法，纯化时间长，导致酶的活力大大降低，多步纯化，也导致了回收效率不高。纯化方法少，又会导致纯化的目的蛋白纯度相对较低，达不到技术人员的理想要求。之前的文献报道，关于CYP101的载体构建中，为了便于克隆和纯化，采用了较长的纯化标签，如GST、MBP、Halo等融合表达标签，包含几十到几百个氨基酸残基；或者采用短纯化标签，例如6*His(6个氨基酸残基)，flag(8个氨基酸残基)，avidin(15个氨基酸残基)，并在短标签和目的蛋白之间加了较长的连接肽段，由于这些短标签的引入，导致最终得到的目的蛋白比天然的蛋白至少多出10个以上的氨基酸，与天然结构存在差异，可能影响目的蛋白的性质或功能。
在CYP101酶的纯化过程中，为了纯化方便引入标签，虽然纯化后可利用蛋白酶切除标签以保证和天然蛋白的相似性，但是酶切操作繁琐，成本高，往往难以用于大量纯化后样品。同时酶切步骤，增加了纯化时间，造成酶的活性难以保证。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供CYP101酶重组载体及构建方法、CYP101酶高效表达纯化方法。
本发明提供了CYP101酶的载体构建方法，并提供了后续表达、纯化方法，其表达量大、操作方便、需时较短、产物纯度高。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：提供CYP101酶重组载体，为重组质粒pET28a-CYP101，其中CYP101酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面：提供CYP101酶重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1)、模板：提取恶臭假单胞杆菌全基因组，用作PCR扩增反应的模板；
2)、PCR扩增：以恶臭假单胞杆菌的全基因组为模板，通过PCR扩增反应，制得扩增产物；
设计上下游引物序列分别为：
上游引物F：CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC；
下游引物R：GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAGPCR；
待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段；
3)、酶切：将扩增产物和原核表达载体pET28a同时进行NcoI和XhoI酶切，分别回收基因PCR产物和pET-28a载体酶切片段；
4)、目的基因片段与载体连接：T4DNA连接酶进行连接，16℃连接反应过夜，获得重组质粒pET28a-CYP101；
5)、将重组质粒pET28a-CYP101转化到TOP10感受态细菌，将其涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB平板，置于37℃恒温培养箱12-16小时，便于后续挑选出阳性菌落；
6)、挑菌：挑取上步中平板中的单克隆菌落于含卡那霉素50μg/ml的LB液体培养基中，在37℃，250rpm的摇床培养12小时；
7)、初步鉴定：取转化平板上的阳性菌落，转接10ml的含卡那霉素50μg/ml的LB液体培养基中，37℃180rpm恒温摇床培养12-16小时，菌液PCR鉴定后，使用小量提取质粒试剂盒进行质粒提取，并将重组质粒pET28a-CYP101NcoI和XhoI双酶切鉴定，两次鉴定产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
8)、核苷酸序列测定：将酶切鉴定正确的阳性菌株送去测序，确定构建载体的正确性。
本发明第三方面：提供包含CYP101酶重组载体的转化体，选用大肠杆菌BL21-plysS作为宿主菌。
本发明第四方面：提供CYP101酶高效表达纯化方法，包括以下步骤：
第一步：重组质粒pET28a-CYP101的构建；
第二步：CYP101的诱导表达：将重组质粒pET28a-CYP101转化入大肠杆菌BL21-plysS感受态细菌中，并进行种子培养与扩大培养，当培养至OD600达到0.5-0.7，用终浓度为0.5-1mM的IPTG诱导40-48小时；离心收集菌体并洗涤；
第三步：CYP101蛋白的纯化：
A、细胞上清液的制备：采用菌体重悬、溶菌酶处理、超声破碎、离心、滤膜过滤后获得滤液加入500mM咪唑至咪唑终浓度达到20mM，得到细胞上清液，用于亲和纯化；
B、Ni-NTA柱亲和纯化：利用Ni-NTA柱，经过细胞上清液亲和上样、清洗杂蛋白、缓冲液置换后进行目的蛋白收集；
C、DEAE离子交换纯化：采用DEAE离子交换层析柱，收集液上样，再用缓冲液洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有缓冲液D和缓冲液H的洗脱液洗脱，即得目的蛋白CYP101酶。
第一步重组质粒pET28a-CYP101的构建方法同上述CYP101酶重组载体的构建方法。
第二步所述的CYP101的诱导表达具体包括以下步骤：
21)转化：将重组质粒PET28a-CYP101转化入大肠杆菌BL21-plysS感受态细菌中，并划线于卡纳抗生素LB固体培养基平板，置于37℃恒温培养箱12-16小时；
22)、种子培养：挑取单克隆的菌落于LB液体培养基中，37℃震荡培养，250rpm下摇菌过夜；
23)、扩大培养：将步骤22)得到的菌液以1:500的接种比例转接到含卡纳抗生素的TB培养基，加入微量元素，37℃，200rpm震荡培养；
24)、诱导表达：至OD600＝0.5-0.7，取1ml菌液做阴性对照，其余菌液加入终浓度为0.5mM的IPTG，置于24℃、200rpm的摇床中继续培养40小时；
25)、收菌：用大容量低温离心机离心收菌，3500rpm，4℃，离心20分钟，弃去上层培养基，收集菌体，菌体用冷的缓冲液A重悬沉淀，以清洗菌体表面，3500rpm，4℃，离心20分钟，弃上清收集菌体；
所述的缓冲液A为含有50mM磷酸钾与50mM氯化钾的缓冲液，其pH为7.4。
步骤A所述的细胞上清液的制备具体包括以下步骤：
a1、菌体重悬：将CYP101的诱导表达收集的菌体用冷的缓冲液A重悬沉淀；
a2、溶菌酶处理：加入终浓度为2μg/ml的溶菌酶，按照1:200加入PMSF蛋白酶抑制剂，冰上静置30分钟；
a3、超声破碎：超声破碎，超声3秒，停7秒，循环模式，至菌体澄清；
a4、高速离心：16000rpm，15分钟，4℃将破碎后的液体离心15分钟，收集上清，重复离心一次，收集上清；
a5、滤膜过滤：上述上清液须用0.45μm针孔式滤膜过滤，去掉不溶物；
a6、获得滤液加入500mM咪唑至咪唑终浓度达到20mM，得到细胞上清液，用于亲和纯化；
所述的缓冲液A为含有50mM磷酸钾与50mM氯化钾的缓冲液，其pH为7.4。
步骤B所述的Ni-NTA柱亲和纯化具体包括以下步骤：
b1、亲和上样：平衡Ni-NTA柱，使用冷的缓冲液B进行平衡，将细胞上清液以2ml/分钟流速流入Ni-NTA柱，同时将穿出液再以相同流速重复上样；
b2、清洗杂蛋白：以500ml冷的缓冲液B清洗杂蛋白，流速为5ml/分钟，然后继续用20ml冷的缓冲液C清洗；
b3、缓冲液置换：用冷的缓冲液D，以5ml/分钟流速，充分置换整个体系中的含盐缓冲液；
b4、目的蛋白收集：采用梯度洗脱，其中第一进样口使用冷的缓冲液E，第二进样口使用冷的缓冲液F，并设置第一进样口浓度变化为从100％到0％、第二进样口浓度变化为从0％到100％进行梯度洗脱，流速控制为2ml/分钟，收集目的蛋白CYP101；
所述的缓冲液B为含有50mM磷酸钾、50mM氯化钾、20mM咪唑的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液C为含有50mM磷酸钾、50mM氯化钾、30mM咪唑的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液D为含有50mM Tris的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液E为含有20mM咪唑、50mM Tris的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液F为含有150mM咪唑，50mM Tris的缓冲液，其pH为7.4。
步骤C所述的DEAE离子交换纯化具体包括以下步骤：
c1、用冷的缓冲液D平衡DEAE离子交换层析柱，取用Ni-NTA柱亲和纯化后合并的目的蛋白收集液样品直接上样，穿出液重复上样；
c2、用冷的缓冲液G清洗杂质蛋白至流出液中的紫外吸收值不变；
c3、目的蛋白收集：以冷的缓冲液D和缓冲液H分别为第一进样口与第二进样口的进样液，并设置第一进样口浓度变化为从10％变化至40％，第二进样口浓度变化为从90％变化至60％，进行梯度洗脱，流速控制为2ml/分钟，收集目的蛋白CYP101；
c4、浓缩：使用超滤管浓缩上述收集的样品，以4000rpm，4℃，离心3次，其中置换缓冲液为缓冲液B，然后用BCA法定量样品浓度，浓度达到15mg/ml以上可作后续冻干操作；
c5、冻干：将上述样品完全冻干，制成干粉，密封置于-80℃长期保存；
所述的缓冲液B为含有50mM磷酸钾、50mM氯化钾、20mM咪唑的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液D为含有50mM Tris的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液G为含有50mM Tri、100mM NaCl的缓冲液，其pH为7.4；
所述的缓冲液H为含有50mM Tris、1M NaCl的缓冲液，其pH为7.4。
本发明改进了细胞色素酶CYP101原核表达载体的构建，相对天然蛋白增加的氨基酸残基较少，只在C端增加了9个氨基酸残基，即Glu Leu Glu His His His His His His，既保证了纯化的便利，又对蛋白质结构影响较小；同时优化了宿主表达菌BL21 plysS中CYP101的诱导培养条件，以保证蛋白的高表达水平；最后简化了纯化流程，结合Ni-NTA亲和柱和DEAE离子交换柱两步纯化，在保证高产率的条件下极大提高了蛋白纯度。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明CYP101酶高效表达纯化方法工艺简单，操作方便，目标蛋白表达量高，纯化得率高，产品纯度高，最终每升培养基可获得23mg纯度95％以上的目的蛋白。
2、本发明改进了CYP101酶的表达载体，使得所表达蛋白在原有天然CYP101酶序列的基础上只增加了含6个组氨酸标签在内的9个氨基酸残基，即Glu Leu Glu His His His His His His，用于亲和纯化，非常接近天然蛋白。
3、本发明使用PET28a质粒用于构建表达载体，保证了CYP101蛋白的高表达水平。
4、本发明使用大肠杆菌BL21-plysS作为宿主，其表达量高，仅仅使用较简单的三角摇瓶小量培养的方式，即达到超过29mg/L的表达水平。若使用常规的发酵罐，则总表达量可提高一个数量级以上。
5、本发明中对细菌诱导表达培养条件进行了优化，采用TB培养基，诱导剂IPTG 0.5mM，在30℃诱导培养40h。
6、本发明CYP101酶高效表达纯化方法简化了纯化流程，裂解液过滤处理后直接用Ni-NTA柱进行亲和纯化，亲和洗脱之前对缓冲液进行置换，使收集液中盐离子浓度很低，无需任何操作，可直接上样DEAE弱阴离子交换柱。经过上述亲和与离子交换两步纯化即可获得高纯度(>95％)目的蛋白，减少了纯化时间，降低了蛋白失活的可能；同时减少了纯化过程中目的蛋白的损失。
7、本发明CYP101酶高效表达纯化方法中，首先使用亲和纯化，用于上样的细胞裂解液须含20mM咪唑，一方面带有融合标签的CYP101酶在此咪唑浓度下仍能充分吸附在Ni-NTA的柱子上，同时此咪唑浓度下，保证细胞裂解中的杂蛋白极少的在Ni-NTA柱上的吸附。不仅极大减少后续对杂蛋白的清洗体积，缩短纯化时间，同时也很大的提高了此步纯化后的CYP101的纯度；洗脱时采用咪唑梯度洗脱，能很好避免收集的CYP101酶中混入杂蛋白，提高获得产物纯度，简化了纯化流程，减少了纯化时间。
8、本发明CYP101酶高效表达纯化方法中，后续使用离子交换纯化，其中使用DEAE弱阴离子柱，对CYP101蛋白有很好的吸附效果，有利于提高产品的纯度和得率。
附图说明
图1为重组PET28a-CYP101载体的图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：PET28a-CYP101的载体构建
1、模板：提取恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)全基因组，用作PCR扩增反应的模板。本实施例的来源为700412TM，该产品为成熟产品，可以直接购买。
2、PCR扩增：以恶臭假单胞杆菌的全基因组为模板，通过PCR扩增反应，制得扩增产物；
其中，设计上下游引物序列分别为：
上游引物F：CCGCCATGGCGATGGTTCCCAGCGACCTGTATC
下游引物R：GCGGCGGCCGCCTCGCTGTCAAACTTAATAGPCR
PCR反应体系包括：10×扩增缓冲液(含Mg2+)5μl，2.5M dNTP混合物2μl，10μM引物1μl，模板DNA 2μl，Taq DNA聚合酶1μl，加入ddH2O至50μl。
反应体系各组分混匀后，放入PCR仪中，按下述反应参数设置循环条件。PCR反应参数：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃持续1小时。
待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。
3、酶切：将扩增产物(步骤2中得到的基因片段)和原核表达载体pET28a同时进行NcoI(NEB#R0193)和XhoI(NEB#R0146)酶切，分别回收基因PCR产物和pET-28a载体酶切片段。
4、目的基因片段与载体连接：T4DNA连接酶(NEB#M0202)进行连接，16℃连接反应过夜，获得重组质粒pET28a-CYP101。转化到TOP10感受态细菌，将其涂布于LB平板(含卡那霉素50μg/ml)，置于37℃恒温培养箱12-16小时，便于后续挑选出阳性菌落。其中，卡那霉素产品型号为Amresco 0408。
5、挑菌：挑取上步中平板中的单克隆菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)中，在37℃，250rpm的摇床培养12小时。
6、初步鉴定：取转化平板上的阳性菌落，转接10ml的LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)中，37℃180rpm恒温摇床培养12-16小时，菌液PCR鉴定后，使用小量提取质粒试剂盒(Promega#D3396-01)进行质粒提取，并将重组质粒pET28a-CYP101NcoI和XhoI双酶切鉴定，两次鉴定产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
7、核苷酸序列测定：将酶切鉴定正确的阳性菌株送去测序，确定构建载体的正确性。
本实施例中，重组PET28a-CYP101载体的图谱如图1所示。
实施例2：CYP101的大量诱导表达
1、转化：将2μl重组质粒PET28a-CYP101转化入大肠杆菌BL21-plysS感受态细菌中，并划线于卡纳抗生素LB固体培养基平板，置于37℃恒温培养箱12-16小时。
2、种子培养：挑取单克隆的菌落于20ml的LB液体培养基的三角瓶37℃震荡培养，250rpm下摇菌过夜。
3、扩大培养：将步骤2得到的菌液以1:500的接种比例转接到含卡纳抗生素的1L TB培养基，加入250μl trace elements(微量元素，为直接购买的已知产品)，37℃，200rpm震荡培养。
4、诱导表达：三角摇瓶在上述条件下培养接近3小时，至OD600＝0.5-0.7，取1ml菌液做阴性对照，其余菌液加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷，Amresco 367-93-1)，置于24℃、200rpm的摇床中继续培养40小时。
5、收菌：用大容量低温离心机离心收菌，3500rpm，4℃，离心20分钟，弃去上层培养基，收集菌体(冰上操作)，菌体用冷的缓冲液A(50mM磷酸钾，50mM氯化钾，pH7.4)重悬沉淀(冰上缓慢吹匀)，以清洗菌体表面，3500rpm，4℃，离心20分钟，弃上清收集菌体。离心后菌体作下一步纯化。若不能立即纯化应-80℃保存。
实施例3：CYP101蛋白的纯化
CYP101蛋白的纯化过程全程置于冰上操作。
A、细胞上清液的制备
a1、菌体重悬：实施例2收集到的菌体用冷的缓冲液A(50mM磷酸钾，50mM氯化钾，pH7.4)重悬沉淀(冰上缓慢吹匀)。
a2、溶菌酶处理：加入终浓度为2μg/ml的溶菌酶，按照1:200加入PMSF蛋白酶抑制剂，冰上静置30分钟。
a3、超声破碎：超声破碎，超声3秒，停7秒，循环模式，至菌体澄清。
a4、高速离心：16000rpm，15分钟，4℃将破碎后的液体离心15分钟，收集上清，重复离心一次，收集上清；
a5、滤膜过滤：上述上清液须用0.45μm针孔式滤膜过滤(冰上操作)，去掉不溶物，以免后续亲和纯化中堵塞纯化柱。
a6、获得滤液加入500mM咪唑至咪唑终浓度达到20mM，得到细胞上清液，用于亲和纯化。
B、Ni-NTA柱亲和纯化
使用蛋白纯化仪为层析系统
b1、亲和上样：平衡Ni-NTA柱，使用冷的缓冲液B(50mM磷酸钾，50mM氯化钾，20mM咪唑，pH7.4)进行平衡，将a6步骤获得的溶液以2ml/分钟流速流入Ni-NTA柱，同时将穿出液再以相同流速重复上样。此时，因为柱上吸附了大量的CYP101蛋白，可明显观察到其变为红棕色。上样全程在4℃的层析柜中操作。
b2、清洗杂蛋白：以500ml冷的缓冲液B(50mM磷酸钾，50mM氯化钾，20mM咪唑，pH7.4)清洗杂蛋白，流速为5ml/分钟。然后继续用20ml冷的缓冲液C(50mM磷酸钾，50mM氯化钾，30mM咪唑，pH7.4)清洗。
b3、缓冲液置换：用约30ml冷的缓冲液D(50mM Tris，pH7.4)，以5ml/分钟流速，充分置换整个体系中的含盐缓冲液。
b4、目的蛋白收集：采用梯度洗脱，A进样口使用冷的缓冲液E(20mM咪唑，50mM Tris，pH7.4)，B进样口使用冷的缓冲液F(150mM咪唑，50mM Tris,pH7.4)，并设置A进样口为100％→0％、B进样口为0％→100％进行梯度洗脱，流速控制为2ml/分钟，收集目的蛋白CYP101。可明显观察到收集管中的收集液为棕红色。将收集的目的蛋白进行12％SDS-PAGE检测。据此将较纯的目的蛋白收集液合并。
C、DEAE离子交换纯化
使用蛋白纯化仪为层析系统
c1、用20ml冷的缓冲液D(50mM Tris，pH7.4)平衡DEAE离子交换层析柱，取上述步骤b4亲和纯化后合并的目的蛋白收集液样品直接上样，穿出液重复上样。上样后观察到DEAE柱明显变成棕红色。
c2、用冷的缓冲液G(50mM Tris，100mM NaCl，pH7.4)清洗杂质蛋白至流出液中的紫外吸收值基本不变。
c3、目的蛋白收集：以冷的缓冲液D(50mM Tris，pH7.4)和缓冲液H(50mM Tris，1M NaCl，pH7.4)，分别为AB进样液，并设置A进样口为10％-40％、B进样口为90％-60％进行梯度洗脱，流速控制为2ml/分钟，收集目的蛋白CYP101。可明显观察到收集液呈棕红色。将收集的目的蛋白进行12％SDS-PAGE检测。据此将较纯的目的蛋白收集液合并。
c4、浓缩：使用10KDa赛默飞公司的超滤管浓缩上述收集的样品。以4000rpm，4℃，离心3次。其中置换缓冲液为缓冲液B。然后用BCA法定量样品浓度，浓度达到15mg/ml以上可作后续冻干操作，此时因为CYP101蛋白较浓，颜色接近深红棕色。
c5、冻干：将上述样品完全冻干，制成干粉，密封置于-80℃长期保存。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110> 上海交通大学
<120> CYP101酶重组载体及构建方法、CYP101酶高效表达纯化方法
<160> 2
<210> 1
<211>1245
<212> DNA
<400> 1
atgacgactg aaaccataca aagcaacgcc aatcttgccc ctctgccacc ccatgtgcca 60
gagcacctgg tattcgactt cgacatgtac aatccgtcga atctgtctgc cggcgtgcag 120
gaggcctggg cagttctgca agaatcaaac gtaccggatc tggtgtggac tcgctgcaac 180
ggcggacact ggatcgccac tcgcggccaa ctgatccgtg aggcctatga agattaccgc 240
cacttttcca gcgagtgccc gttcatccct cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300
cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360
ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420
gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480
atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540
ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600
ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660
atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720
aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780
agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840
cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900
atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960
ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020
ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc tttggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080
cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140
gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200
caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggta 1245
<210> 2
<211>424
<212> PRT
<400> 2
Met Thr Thr Glu Thr Ile Gln Ser Asn Ala Asn Leu Ala Pro Leu
5 10 15
Pro Pro His Val Pro Glu His Leu Val Phe Asp Phe Asp Met Tyr
20 25 30
Asn Pro Ser Asn Leu Ser Ala Gly Val Gln Glu Ala Trp Ala Val
35 40 45
Leu Gln Glu Ser Asn Val Pro Asp Leu Val Trp Thr Arg Cys Asn
50 55 60
Gly Gly His Trp Ile Ala Thr Arg Gly Gln Leu Ile Arg Glu Ala
65 70 75
Tyr Glu Asp Tyr Arg His Phe Ser Ser Glu Cys Pro Phe Ile Pro
80 85 90
Arg Glu Ala Gly Glu Ala Tyr Asp Phe Ile Pro Thr Ser Met Asp
95 100 105
Pro Pro Glu Gln Arg Gln Phe Arg Ala Leu Ala Asn Gln Val Val
110 115 120
Gly Met Pro Val Val Asp Lys Leu Glu Asn Arg Ile Gln Glu Leu
125 130 135
Ala Cys Ser Leu Ile Glu Ser Leu Arg Pro Gln Gly Gln Cys Asn
140 145 150
Phe Thr Glu Asp Tyr Ala Glu Pro Phe Pro Ile Arg Ile Phe Met
155 160 165
Leu Leu Ala Gly Leu Pro Glu Glu Asp Ile Pro His Leu Lys Tyr
170 175 180
Leu Thr Asp Gln Met Thr Arg Pro Asp Gly Ser Met Thr Phe Ala
185 190 195
Glu Ala Lys Glu Ala Leu Tyr Asp Tyr Leu Ile Pro Ile Ile Glu
200 205 210
Gln Arg Arg Gln Lys Pro Gly Thr Asp Ala Ile Ser Ile Val Ala
215 220 225
Asn Gly Gln Val Asn Gly Arg Pro Ile Thr Ser Asp Glu Ala Lys
230 235 240
Arg Met Cys Gly Leu Leu Leu Val Gly Gly Leu Asp Thr Val Val
245 250 255
Asn Phe Leu Ser Phe Ser Met Glu Phe Leu Ala Lys Ser Pro Glu
260 265 270
His Arg Gln Glu Leu Ile Glu Arg Pro Glu Arg Ile Pro Ala Ala
275 280 285
Cys Glu Glu Leu Leu Arg Arg Phe Ser Leu Val Ala Asp Gly Arg
290 295 300
Ile Leu Thr Ser Asp Tyr Glu Phe His Gly Val Gln Leu Lys Lys
305 310 315
Gly Asp Gln Ile Leu Leu Pro Gln Met Leu Ser Gly Leu Asp Glu
320 325 330
Arg Glu Asn Ala Cys Pro Met His Val Asp Phe Ser Arg Gln Lys
335 340 345
Val Ser His Thr Thr Phe Gly His Gly Ser His Leu Cys Leu Gly
350 355 360
Gln His Leu Ala Arg Arg Glu Ile Ile Val Thr Leu Lys Glu Trp
365 370 375
Leu Thr Arg Ile Pro Asp Phe Ser Ile Ala Pro Gly Ala Gln Ile
380 385 390
Gln His Lys Ser Gly Ile Val Ser Gly Val Gln Ala Leu Pro Leu
395 400 405
Val Trp Asp Pro Ala Thr Thr Lys Ala Val Glu Leu Glu His His
410 415 420
His His His His
424