一种可诱导调控的标记蛋白表达框及其构建的重组载体与应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，实际在芽孢杆菌属(Bacillus)物种中敲出和敲入基因。具体的本发明涉及到以大肠杆菌毒性蛋白ccdB和mazF为筛选标记蛋白的芽孢杆菌基因敲出、敲入的方法。

背景技术：

芽孢杆菌(Bacillus)是一类好氧型、内生抗逆性孢子的革兰氏阳性细菌。芽孢杆菌属中有许多可以作为表达外源蛋白的宿主，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)等。利用上述芽孢杆菌可以工业化的生产碱性蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、生长激素、白细胞介素、青霉素酰化酶、核黄素、嘌呤核苷酸、链霉亲和素等广泛应用范围的产物。

外源蛋白在芽孢杆菌中的表达主要分为两种方式：一是外源蛋白基因存在于可在芽孢杆菌中自主复制的质粒上，二是将外源蛋白基因整合到芽孢杆菌的基因组上。以质粒形式存在于细胞中外源蛋白基因容易在细胞复制、分裂时丢失，或被细胞本身的限制修饰系统降解。在没有外在筛选压力情况下，质粒很难稳定存在于细胞中。所以该方法主要适用于在实验室中研究外源蛋白在芽孢杆菌中表达的可能性以及研究外源蛋白的理化性质，并不适用于大规模的发酵生产。当外源基因整合到芽孢杆菌基因组上，就能在没有外界压力(如抗生素、生长因子)条件下稳定的存在。产量稳定，发酵条件简单，适应大规模发酵生产的需要。

染色体整合即采用整合载体(或称整合质粒)携带外源基因进入表达宿主后，整合载体连同外源基因表达单元进入染色体并随染色体的复制而复制和表达。整合载体的染色体整合模式有：单交换同源重组(Single-crossover Recombination)、双交换同源重组(Double-crossover Recombination)和位点专一性重组(Site-specific Recombination)等方式。单交换同源重组只有一条同源臂，通过单交换的方式将整个质粒或者片段整合到预定的位置。但是单交换同源重组存在脱靶率高的缺陷，或者会将抗性基因引入到芽孢杆菌的基因组中。位点专一性重组需要有特异性的位点，载体上需要有特定的整合酶。目前采用最广泛的为双交换同源重组，在简单的双交换同源重组系统中，仅需要上下游同源臂和目的基因片段即可转化芽孢杆菌实现双交换重组，但是在这种体系中无法克服重组效率低的缺陷，以及芽孢杆菌转化效率低，无法得到转化子的事实。随后，科研人员发展出各种类型的双交换同源重组系统，提高同源重组的效率，极大地促进了芽孢杆菌作为工业表达宿主的发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种可诱导调控的标记蛋白表达框及其构建的重组载体与应用，通过可诱导启动子调控筛选标记蛋白的表达，作为筛选的条件，提高二次重组的筛选效率。该方法具有方便、快捷，简单易行的优点。极大地提高了双交换同源重组方法敲入外源基因或敲出芽孢杆菌基因组基因的筛选效率。

本发明的技术方案如下：

一种可诱导调控的标记蛋白表达框，包括筛选标记蛋白和可诱导调控元件；其中筛选标记蛋白为大肠杆菌毒性蛋白包括ccdB、mazF、密码子优化后的ccdB或密码子优化后的mazF中的任意一种；可诱导调控元件包括IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子、木糖诱导的木糖xylA启动子、密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子或密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子中的任意一种。

所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，密码子优化后的ccdB为使用引物ATGCAATTCAAAGTTTACACATAC和TTAGATGCCCCAGAACATA扩增ccdB基因得到；密码子优化后的mazF为使用引物ATGGTTTCTCGTTACGTTCCTGA和TTAGCCGATAAGAACGTTGAT扩增mazF基因得到。

所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子为使用引物CAACTTCTTTAACATAACCGT和TGATCCTTCCTCCTTTAATTG扩增内含乳糖操作子的grac启动子得到；密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子为使用引物GATCTTCTTTTCTAACAACG和TGATTTCCCCCTTAGATGA扩增木糖诱导的木糖xylA启动子得到。

所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，大肠杆菌毒性蛋白ccdB的序列如SEQ ID NO.5所示，mazF的序列如SEQ ID NO.7所示；密码子优化后的ccdB序列如SEQ ID NO.6所示，密码子优化后的mazF序列如SEQ ID NO.8所示。

所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子序列如SEQ ID NO.1所示，木糖诱导的木糖xylA启动子序列如SEQ ID NO.3所示；密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子序列如SEQ ID NO.2所示，密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的可诱导调控的标记蛋白表达框用于整合在任何在芽孢杆菌中自由复制的重组载体上，该载体包括pCBS、pMAD、pBesT502、pDG1663、pAX01、pSAS144、pDL、pDG148-stu、pSG1154、pMUTIN4M、pMUTIN-FLAG、pMUTIN-GFP+、pDG641、pBGSC6、pCP115或pDG364中的任意一种。

一种以大肠杆菌毒性蛋白为筛选标记的重组载体，以以上所述任意一种筛选标记蛋白和任意一种可诱导调控元件通过重叠延伸PCR的方式连接到一起得到。

所述的以大肠杆菌毒性蛋白为筛选标记的重组载体，重叠延伸PCR过程为通过可诱导调控元件的正向引物和筛选标记蛋白的反向引物，以可诱导调控元件基因、筛选标记蛋白基因为模板重叠延伸，得到目的片段。

所述的重组载体在芽孢杆菌基因敲出与外源基因导入芽孢杆菌中的应用。

以上所述的应用，芽孢杆菌基因敲出具体为选择以上所述的重组载体，以芽孢杆菌的基因组为模板，扩增待敲出基因上下游同源臂；然后将重组载体通过限制性内切酶酶切后分别与待敲出基因的上、下游同源臂连接，再转化芽孢杆菌，在对应抗性平板上培养后得到转化子，通过提高培养温度，添加诱导剂诱导标记蛋白表达的方法得到待敲出基因被敲出的重组菌株。

以上所述的应用，外源基因导入芽孢杆菌具体为选择以上所述的重组载体，芽孢杆菌的基因组为模板，扩增待替换基因上下游同源臂；然后将重组载体通过限制性内切酶酶切后分别与待替换基因的上、下游同源臂连接；将外源基因引入表达载体，然后转化芽孢杆菌，在对应抗性平板上培养后得到转化子，通过提高培养温度，添加诱导剂诱导标记蛋白表达的方法得到待替换基因被外源基因替换的重组菌株。

本发明以前期构建的芽孢杆菌整合载体pCBS(见图1)为骨架，通过可诱导的启动子(如IPTG诱导的grac启动子(内含乳糖操作子)，木糖诱导的木糖xylA启动子，杆菌肽有待的LiaG启动子等)，诱导筛选标记蛋白(如ccdB、mazF)的表达，单交换的菌株含有标记蛋白基因，诱导后毒性蛋白表达，细胞死亡或不能正常生长。双交换的菌株不含标记蛋白基因，诱导后没有毒性蛋白产生，细胞生长良好。通过诱导毒性蛋白的表达可以杀死或抑制单交换菌株，从而提高双交换菌株的数量。

本发明还可以通过pCBS质粒上的β-半乳糖苷酶基因，在含有X-gal的平板上产生蓝色单菌落的特性。不用通过复杂的PCR验证，直接得到双交换的菌株。在具体的实施案例中，首先在含有X-gal的抗性平板上挑选蓝色的单菌落，只有产生单交换重组的菌株会表达β-半乳糖苷酶基因，产生蓝斑，方便的得到单交换的菌株。该菌株在无抗生素的培养基中培养，自然产生双交换，通过添加诱导剂诱导毒性蛋白的表达，单交换菌株死亡，双交换菌株继续生长。在无抗生素的X-gal平板上挑选白色菌落，有极大地可能是双交换的菌株。

有益效果

本发明利用大肠杆菌毒性蛋白ccdB或mazF作为筛选标记蛋白，极大地提高了二次同源重组的成功率。降低了普通二次重组需要大量点抗性平板和无抗性平板，通过抗生素筛选的劳动量。简化了芽孢杆菌同源重组法敲入或敲出基因的筛选流程，降低了操作难度。缩短整个实验的时间。

本发明利用可诱导的启动子(如IPTG诱导的grac启动子(内含乳糖操作子)，木糖诱导的木糖xylA启动子，杆菌肽有待的LiaG启动子等)调控标记蛋白的表达。通过在培养基中添加葡萄糖，严格控制可以到启动子的表达，在未诱导时不会产生毒性蛋白，不会对细胞产生任何毒性，对芽孢杆菌转化、生长没有不良影响。其他的同源重组质粒也可方便的添加该诱导表达框实现可调控的筛选，具有极大地包容性和可扩展性。

利用该重组系统，整个筛选过程中仅需要在培养基平板和恒温培养箱中即可实现所以的操作。仅需要在最后通过PCR的方法验证二次同源重组的菌株即可。该方法极大地简化了目前芽孢杆菌同源重组的流程，降低了材料成本和时间成本。

本发明所述的筛选标记蛋白为大肠杆菌毒性蛋白，在二次同源重组后筛选标记蛋白被删除，不存在于重组子中，不会产生毒性蛋白，对人畜无毒副作用，可以作为一种食品级筛选标记。

附图说明

图1为本发明无筛选标记蛋白的重组载体pCBS示意图；

图2为本发明构建的筛选标记蛋白重组载体pKBS示意图；

图3为本发明同源重组原理及筛选标记蛋白的作用。

图4为是本发明实施例2-4中涉及的thrC、amyE、pulA二次重组PCR验证结果图。

具体实施方式：

1、筛选标记蛋白的选择及优化

本发明选取了毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA)中的毒素蛋白作为筛选的标记蛋白。典型的TA家族包括：ccdAB、relBE、parDE、higBA、mazEF、phd/doc、vapBC/vag等系统。在本发明中优先选择研究最广泛的ccdAB和mazEF系统。以大肠杆菌DH5α的基因组为模板，通过引物1：ATGGTAAGCCGATACGTACCCG(SEQ ID NO.9)和引物2：CTACCCAATCAGTACGTTAATTTTGG(SEQ ID NO.10)扩增mazF基因(SEQ ID NO.7)；以大肠杆菌JM110的基因组为模板，通过通过引物3：ATGCAGTTTAAGGTTTACACCTAT(SEQ ID NO.11)和引物4：TTATATTCCCCAGAACATCAGGT(SEQ ID NO.12)扩增ccdB基因(SEQ ID NO.5)。

更优选的，通过密码子优化，使ccdB(SEQ ID NO.6)和mazF(SEQ ID NO.8)更加适用于芽孢杆菌，以合成的基因为模板，通过引物5：ATGGTTTCTCGTTACGTTCCTGA(SEQ ID NO.13)和引物6：TTAGCCGATAAGAACGTTGAT(SEQ ID NO.14)扩增mazF基因，通过引物7：ATGCAATTCAAAGTTTACACATAC(SEQ ID NO.15)和引物:8：TTAGATGCCCCAGAACATA(SEQ ID NO.16)扩增ccdB基因。所有的基因扩增后连接到Pmd19T载体，测序验证无突变后进行下一步实验。

筛选标记蛋白基因(包含优化后的毒性蛋白基因)扩增条件：高保真pfu酶1μL、10×PCR buffer 2.5μL、dNTP(10mmol/L)2μL、引物(10μmol/l)各2μL、模板DNA 1μL、双蒸水14.5μL。用枪头轻轻吹打混匀。预变性95℃3分钟；变性95℃20秒，退火55℃20秒，延伸72℃30秒，35个循环；最终延伸72℃5分钟。PCR产物通过3％的琼脂糖电泳染色后割胶回收。连接T载体，验证序列有无突变。

2、诱导启动子的选择及优化

本发明选取可诱导的启动子作为筛选标记蛋白的调控基因，可选择的启动子有如IPTG诱导的grac启动子(内含乳糖操作子)，木糖诱导的木糖xylA启动子，杆菌肽有待的LiaG启动子等。本发明中优先选择grac启动子(内含乳糖操作子)(SEQ ID NO.1)和木糖诱导的木糖xylA启动子(SEQ ID NO.3)。以PHT43载体为模板，通过引物9：GACCAGCTATTGTAACATAATC(SEQ ID NO.17)和引物:10：TGATCCTTCCTCCTTTAATTG(SEQ ID NO.18)扩增grac启动子基因；以枯草芽孢杆菌BS001基因组为模板，通过引物11：GATTTACTTTTTTGACAAAGGT(SEQ ID NO.19)和引物:12：GTGATTTCCCCCTTAAAAAT(SEQ ID NO.20)扩增xylA启动子基因。

更优选的，通过使用枯草芽孢杆菌的偏好密码子，优化启动子的碱基序列，使grac启动子(内含乳糖操作子)(SEQ ID NO.2)和木糖诱导的木糖xylA启动子(SEQ ID NO.4)更加适用于芽孢杆菌，以合成的基因为模板，通过引物13：CAACTTCTTTAACATAACCGT(SEQ ID NO.21)和引物14：TGATCCTTCCTCCTTTAATTG(SEQ ID NO.22)扩增grac启动子(内含乳糖操作子)基因，通过引物15：GATCTTCTTTTCTAACAACG(SEQ ID NO.23)和引物:16：TGATTTCCCCCTTAGATGA(SEQ ID NO.24)扩增木糖xylA启动子基因。所有的基因扩增后连接到Pmd19T载体，测序验证无突变后进行下一步实验。

启动子基因(包含优化后的启动子基因)扩增条件：高保真pfu酶1μL、10×PCR buffer 2.5μL、dNTP(10mmol/L)2μL、引物(10μmol/l)各2μL、模板DNA 1μL、双蒸水14.5μL。用枪头轻轻吹打混匀。预变性95℃3分钟；变性95℃20秒，退火55℃30秒，延伸72℃30秒，35个循环；最终延伸72℃5分钟。PCR产物通过3％的琼脂糖电泳染色后割胶回收。连接T载体，验证序列有无突变。

3、含筛选标记蛋白的重组载体构建

优化密码子或未优化密码子的启动子基因(grac启动子(内含乳糖操作子)和木糖诱导的木糖xylA启动子)与优化密码子或未优化密码子的筛选标记蛋白基因(ccdB和mazF)通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法连接到一起，重叠延伸PCR的条件如下：

首先因启动子基因、筛选标记蛋白基因的正向与反向引物分别扩增启动子基因和标记蛋白基因，方法同上。再通过启动子的正向引物和标记蛋白的反向引物，以启动子基因、标记蛋白基因为模板重叠延伸，得到目的片段。PCR条件：高保真pfu酶1μL、10×PCR buffer2.5μL、dNTP(10mmol/L)2μL、引物(10μmol/l)各2μL、模板DNA各1μL、双蒸水13.5μL。用枪头轻轻吹打混匀。预变性95℃3分钟；变性95℃30秒，退火55℃30秒，延伸72℃40秒，30个循环；最终延伸72℃10分钟。PCR产物通过1％的琼脂糖电泳染色后割胶回收。骨架载体pCBS(见图1)通过限制性内切酶NaeI酶切后，割胶回收。二者通过Infusion方法连接，转化大肠杆菌DH5α。得到具有不同启动子和毒素蛋白为筛选标记的重组载体pKBS(见图2)系列。部分引物见下表：

注：引物中小写字母为Infusion连接中的同源部分。

实施例1

在该实施案例中选择含有优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和毒素蛋白ccdB重组质粒。以BS001的基因组为模板，通过

引物49：acacattaactagacagatctTTTGCCGAAGCTGATCCG(SEQ ID NO.57)

和引物50：atggcatgcatcgatagatctGAAGTGTTACCTGTTGACGCGC(SEQ ID NO.58)

扩增thrC上游的同源臂(SEQ ID NO.69)

通过引物51：acacattaactagacagatctCGAAGCCGACATGCTGTTCT(SEQ ID NO.59)

和引物52：atggcatgcatcgatagatctTTTTCTAAATAAAAACTCCTTTATCTCCA(SEQ ID NO.60)扩增thrC下游的同源臂(SEQ ID NO.70)(PCR条件：高保真pfu酶1μL、10×PCR buffer 2.5μL、dNTP(10mmol/L)2μL、引物(10μmol/l)各2μL、模板(枯草芽孢杆菌BS001DNA)1μL、双蒸水14.5μL。用枪头轻轻吹打混匀。预变性95℃3分钟；变性95℃40秒，退火55℃60秒，延伸72℃60秒，30个循环；最终延伸72℃10分钟。PCR产物通过1％的琼脂糖电泳染色后割胶回收)。pKBS通过限制性内切酶BglⅡ酶切后与thrC上游同源臂连接。通过限制性内切酶BamHI酶切与thrC下游同源臂连接。载体随后转化枯草芽孢杆菌BS001，在红霉素(5μg/ml)抗性平板上得到单菌落，挑取单菌落接含红霉素(5μg/ml)的LB培养基，42℃处理12小时，涂含有X-gal的红霉素(5μg/ml)抗性平板。挑取蓝色单菌落，接种LB培养基37℃培养12小时，转接到含IPTG(1mmol/l)的LB中，42℃处理12小时。涂含X-gal的平板，挑取白色单菌落PCR验证重组结果。结果显示成功得到二次重组菌株，thrC基因被成功敲出(见图4c，1号)。

实施例2

在该实施案例中选择含有优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和毒素蛋白ccdB重组质粒。以BS001的基因组为模板，通过引物49和引物50扩增thrC上游的同源臂，引物51和引物52扩增thrC下游的同源臂(扩增过程同实施例1)。pKBS通过限制性内切酶BglⅡ酶切后与thrC上游同源臂连接。通过限制性内切酶BamHI酶切与thrC下游同源臂连接。以pet30A为模板，通过

引物53：tgcaaaagccgcagcagatctATGAGCCATATTCAACGGGAAA(SEQ ID NO.61)和

引物54：atggcatgcatcgatagatctTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA(SEQ ID NO.62)扩增卡那霉素抗性基因kan(PCR条件：高保真pfu酶1μL、10×PCR buffer 2.5μL、dNTP(10mmol/L)2μL、引物(10μmol/l)各2μL、模板DNA1μL、双蒸水14.5μL。用枪头轻轻吹打混匀。预变性95℃3分钟；变性95℃30秒，退火55℃40秒，延伸72℃40秒，30个循环；最终延伸72℃10分钟。PCR产物通过1％的琼脂糖电泳染色后割胶回收)，通过限制性内切酶BglⅡ酶切后与kan连接，载体随后转化枯草芽孢杆菌BS001，在红霉素(5μg/ml)抗性平板上得到单菌落，挑取单菌落接含红霉素(5μg/ml)的LB培养基，42℃处理12小时，涂含有X-gal的红霉素(5μg/ml)抗性平板。挑取蓝色单菌落，接种LB培养基37℃培养12小时，转接到含IPTG(1mmol/l)的LB中，42℃处理12小时。涂含X-gal的平板，挑取白色单菌落PCR验证重组结果。结果显示成功得到二次重组菌株，thrc基因成功被kan基因替换(见图4c，2、3号)。

实施例3

在该实施案例中选择含有优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和毒素蛋白mazF重组质粒。以BS001的基因组为模板，通过引物49和引物50扩增thrC上游的同源臂，引物51和引物52扩增thrC下游的同源臂(扩增过程同实施例1)。Pkbs通过限制性内切酶BglⅡ酶切后与thrC上游同源臂连接。通过限制性内切酶BamHI酶切与thrC下游同源臂连接。载体随后转化枯草芽孢杆菌BS001，在红霉素(5μg/ml)抗性平板上得到单菌落，挑取单菌落接含红霉素(5μg/ml)的LB培养基，42℃处理12小时，涂含有X-gal的红霉素(5μg/ml)抗性平板。挑取蓝色单菌落，接种LB培养基37℃培养12小时，转接到含木糖(20g/l)的LB中，42℃处理12小时。涂含X-gal的平板，挑取白色单菌落PCR验证重组结果。结果显示成功得到二次重组菌株，thrC基因被成功敲出(见图4c，4、5号)。

实施例4

在该实施案例中选择含有优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和毒素蛋白mazF重组质粒。以BS001的基因组为模板，通过引物49和引物50扩增thrC上游的同源臂，引物51和引物52扩增thrC下游的同源臂(扩增过程同实施例1)。pKBS通过限制性内切酶BglⅡ酶切后与thrC上游同源臂连接。通过限制性内切酶BamHI酶切与thrC下游同源臂连接。以pET30a为模板，通过引物53和引物54扩增卡那霉素抗性基因kan(扩增过程实施例2)，通过限制性内切酶BglⅡ酶切后与kan连接，载体随后转化枯草芽孢杆菌BS001，在红霉素(5μg/ml)抗性平板上得到单菌落，挑取单菌落接含红霉素(5μg/ml)的LB培养基，42℃处理12小时，涂含有X-gal的红霉素(5μg/ml)抗性平板。挑取蓝色单菌落，接种LB培养基37℃培养12小时，转接到含木糖(20g/l)的LB中，42℃处理12小时。涂含X-gal的平板，挑取白色单菌落PCR验证重组结果。结果显示成功得到二次重组菌株，thrc基因成功被kan基因替换(见图4c，8号)。

其他实施案例：在这些案例中，启动子和标记蛋白的组合还有：未优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和未优化密码子筛选标记蛋白ccdB、未优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和优化密码子筛选标记蛋白ccdB、优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和未优化密码子毒素蛋白ccdB、未优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和未优化密码子筛选标记蛋白mazF、未优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和优化密码子筛选标记蛋白mazF、优化密码子的grac启动子(内含乳糖操作子)和未优化密码子筛选标记蛋白mazF。还包括：未优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和未优化密码子筛选标记蛋白ccdB、优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和未优化密码子筛选标记蛋白ccdB、未优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和优化密码子筛选标记蛋白ccdB、未优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和未优化密码子筛选标记蛋白mazF、优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和未优化密码子筛选标记蛋白mazF、未优化密码子的木糖诱导的木糖xylA启动子和优化密码子筛选标记蛋白mazF。

在这些案例中，基因的敲出或敲入包括thrC基因的敲出和卡那霉素抗性基因kan替换thrC基因，淀粉酶amyE基因的敲出和卡那霉素抗性基因kan替换amyE基因(见图4b)，普鲁兰酶pulA基因的敲出和卡那霉素抗性基因kan替换pulA基因(见图4a)。通过

引物55：CAGCAGCTAAACCCGCTGTAAGCA(SEQ ID NO.63)

引物56：TTACTTTTTACCGTGGTCTGGGCTT(SEQ ID NO.64)

PCR验证PulA基因的敲出情况。

通过

引物57：ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCT(SEQ ID NO.65)

引物58：TCAATGGGGAAGAGAACCGCTTAAG(SEQ ID NO.66)

PCR验证AmyE基因的敲出情况。

通过

引物59：ATGAACGAAGCCGACATGCTGTTCT(SEQ ID NO.67)

引物60：CTATACACTTTTTACTTGATATAAA(SEQ ID NO.68)

PCR验证ThrC基因的敲出情况。

序列表

<110> 南京福斯弗瑞生物科技有限公司,南京农业大学

<120> 一种可诱导调控的标记蛋白表达框及其构建的重组载体与应用

<130> 1

<160> 70

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 181

<212> DNA

<213> grac启动子

<400> 1

cagctattgt aacataatcg gtacgggggt gaaaaagcta acggaaaagg gagcggaaaa 60

gaatgatgta agcgtgaaaa attttttatc ttatcacttg aaattggaag ggagattctt 120

tattataaga attgtggaat tgtgagcgga taacaattcc caattaaagg aggaaggatc 180

a 181

<210> 2

<211> 181

<212> DNA

<213> 密码子优化的 grac启动子

<400> 2

caacttcttt aacataaccg ttacggcggc gaaaaagcta acggcaaagg ctctggcaaa 60

gaataatgca aacgtgaaaa attcttcatc ctttctcttg aaatcggccg tgaaatcctt 120

tactacaaaa actgcggaat tgtgagcgga taacaattcc caattaaagg aggaaggatc 180

a 181

<210> 3

<211> 281

<212> DNA

<213> 木糖诱导xylA启动子

<400> 3

gatttacttt tttgacaaag gtttgatcag cgatatccac ttcatccact ccatttgttt 60

aatctttaaa ttaagtatca acatagtaca tagcgaatct tccctttatt atatctaatg 120

tgttcataaa aaactaaaaa aaatattgaa aatactgacg aggttatata agatgaaaat 180

aagttagttt gtttaaacaa caaactaata ggtgatgtac ttactatatg aaataaaatg 240

catctgtatt tgaatgaatt tatttttaag ggggaaatca c 281

<210> 4

<211> 278

<212> DNA

<213> 密码子优化的木糖诱导xylA启动子

<400> 4

gatcttcttt tctaacaacg tttcgatcaa cgttaccctc ttcatcctct tcatcttttc 60

aacctttaaa tcaaatacca acattctaca taacgtatct tccctcttct ttaccttatg 120

tgctcttaaa aaacaaaaaa aaacatcgaa aacacagatg aagttatcta agatgaaaac 180

aaacttgttt gccttaacaa caaacttatc ggcgatgttc ttacaatcta aaacaaaatg 240

catctttacc ttaacgaatt catctaaggg ggaaatca 278

<210> 5

<211> 306

<212> DNA

<213> 大肠杆菌毒性蛋白ccdB

<400> 5

atgcagttta aggtttacac ctataaaaga gagagccgtt atcgtctgtt tgtggatgta 60

cagagtgata ttattgacac gccggggcga cggatggtga tccccctggc cagtgcacgt 120

ctgctgtcag ataaagtctc ccgtgaactt tacccggtgg tgcatatcgg ggatgaaagc 180

tggcgcatga tgaccaccga tatggccagt gtgccggtct ccgttatcgg ggaagaagtg 240

gctgatctca gccaccgcga aaatgacatc aaaaacgcca ttaacctgat gttctgggga 300

atataa 306

<210> 6

<211> 306

<212> DNA

<213> 密码子优化后的ccdB

<400> 6

atgcaattca aagtttacac atacaaacgt gaatctcgtt accgtctttt cgttgatgtt 60

caatctgata tcatcgatac acctggccgt cgtatggtta tccctcttgc ttctgctcgt 120

cttctttctg ataaagtttc tcgtgaactt taccctgttg ttcatatcgg cgatgaatct 180

tggcgtatga tgacaacaga tatggcttct gttcctgttt ctgttatcgg cgaagaagtt 240

gctgatcttt ctcatcgtga aaacgatatc aaaaacgcta tcaaccttat gttctggggc 300

atctaa 306

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 毒素蛋白mazF

<400> 7

atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60

aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120

aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180

gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240

atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300

ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336

<210> 8

<211> 336

<212> DNA

<213> 密码子优化后的mazF

<400> 8

atggtttctc gttacgttcc tgatatgggc gatcttatct gggttgattt cgatcctaca 60

aaaggctctg aacaagctgg ccatcgtcct gctgttgttc tttctccttt catgtacaac 120

aacaaaacag gcatgtgcct ttgcgttcct tgcacaacac aatctaaagg ctaccctttc 180

gaagttgttc tttctggcca agaacgtgat ggcgttgctc ttgctgatca agttaaatct 240

atcgcttggc gtgctcgtgg cgctacaaaa aaaggcacag ttgctcctga agaacttcaa 300

cttatcaaag ctaaaatcaa cgttcttatc ggctaa 336

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggtaagcc gatacgtacc cg 22

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctacccaatc agtacgttaa ttttgg 26

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgcagttta aggtttacac ctat 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttatattccc cagaacatca ggt 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggtttctc gttacgttcc tga 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttagccgata agaacgttga t 21

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgcaattca aagtttacac atac 24

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttagatgccc cagaacata 19

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaccagctat tgtaacataa tc 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgatccttcc tcctttaatt g 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gatttacttt tttgacaaag gt 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtgatttccc ccttaaaaat 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caacttcttt aacataaccg t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgatccttcc tcctttaatt g 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gatcttcttt tctaacaacg 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgatttcccc cttagatga 19

<210> 25

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tcgacctgaa tggaagccgg cgaccagcta ttgtaacata atcggtac 48

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

actgcattga tccttcctcc tttaattggg 30

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggaggaagga tcaatgcagt ttaaggttta cacctataaa ag 42

<210> 28

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgttagcgag gtgccgccgg cttatattcc ccagaacatc aggttaa 47

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tcgacctgaa tggaagccgg cgaccagcta ttgtaacata atcggtac 48

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggcttaccat tgatccttcc tcctttaatt ggg 33

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggaaggatca atggtaagcc gatacgtacc cg 32

<210> 32

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgttagcgag gtgccgccgg cctacccaat cagtacgtta attttgg 47

<210> 33

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tcgacctgaa tggaagccgg ccaacttctt taacataacc gttacgg 47

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

attgcattga tccttcctcc tttaattggg 30

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggaggaagga tcaatgcaat tcaaagttta cacatacaaa 40

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cgttagcgag gtgccgccgg cttagatgcc ccagaacata aggtt 45

<210> 37

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tcgacctgaa tggaagccgg ccaacttctt taacataacc gttacgg 47

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gagaaaccat tgatccttcc tcctttaatt ggg 33

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggaaggatca atggtttctc gttacgttcc tga 33

<210> 40

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cgttagcgag gtgccgccgg cttagccgat aagaacgttg atttt 45

<210> 41

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tcgacctgaa tggaagccgg cgatttactt ttttgacaaa ggtttgatc 49

<210> 42

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aactgcatgt gatttccccc ttaaaaataa attc 34

<210> 43

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gggggaaatc acatgcagtt taaggtttac acctataaaa g 41

<210> 44

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cgttagcgag gtgccgccgg cttatattcc ccagaacatc aggttaa 47

<210> 45

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tcgacctgaa tggaagccgg cgatttactt ttttgacaaa ggtttgatc 49

<210> 46

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ggcttaccat gtgatttccc ccttaaaaat aaattc 36

<210> 47

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gggaaatcac atggtaagcc gatacgtacc cg 32

<210> 48

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

cgttagcgag gtgccgccgg cctacccaat cagtacgtta attttgg 47

<210> 49

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tcgacctgaa tggaagccgg cgatcttctt ttctaacaac gtttcga 47

<210> 50

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gaattgcatt gatttccccc ttagatgaat tcg 33

<210> 51

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gggggaaatc aatgcaattc aaagtttaca catacaaa 38

<210> 52

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cgttagcgag gtgccgccgg cttagatgcc ccagaacata aggtt 45

<210> 53

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tcgacctgaa tggaagccgg cgatcttctt ttctaacaac gtttcga 47

<210> 54

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gagaaaccat tgatttcccc cttagatgaa ttcg 34

<210> 55

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ggggaaatca atggtttctc gttacgttcc tga 33

<210> 56

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgttagcgag gtgccgccgg cttagccgat aagaacgttg atttt 45

<210> 57

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

acacattaac tagacagatc ttttgccgaa gctgatccg 39

<210> 58

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

atggcatgca tcgatagatc tgaagtgtta cctgttgacg cgc 43

<210> 59

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

acacattaac tagacagatc tcgaagccga catgctgttc t 41

<210> 60

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

atggcatgca tcgatagatc tttttctaaa taaaaactcc tttatctcca 50

<210> 61

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

tgcaaaagcc gcagcagatc tatgagccat attcaacggg aaa 43

<210> 62

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

atggcatgca tcgatagatc tttagaaaaa ctcatcgagc atcaaa 46

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

cagcagctaa acccgctgta agca 24

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ttacttttta ccgtggtctg ggctt 25

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

atgtttgcaa aacgattcaa aacct 25

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

tcaatgggga agagaaccgc ttaag 25

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

atgaacgaag ccgacatgct gttct 25

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ctatacactt tttacttgat ataaa 25

<210> 69

<211> 1000

<212> DNA

<213> thrC上游同源臂

<400> 69

tttgccgaag ctgatccgac ttctgacgtg gaagggcttg acgccgcacg gaaaatggcg 60

atattggcgc gcctcggctt ctcgatgaac gtggatctgg aagacgtcaa agtaaagggg 120

atctcccaaa ttacagacga ggacatcagc ttcagcaaac gcctcggcta tacaatgaag 180

ctgatcggga ttgctcagcg tgacggcagc aaaatcgagg tcagcgtaca gccgacactg 240

cttcctgacc atcatccgct ttctgctgtt cataatgagt ttaacgctgt ttatgtatac 300

ggcgaggctg tcggtgagac gatgttctac gggccgggag ccggaagcat gccgacagcg 360

acatccgttg tttctgacct cgtcgctgtc atgaaaaata tgcgcctagg tgtaaccggc 420

aacagctttg tcggaccgca atatgagaaa aacatgaaat cgccgtctga catttatgca 480

cagcagtttt taagaattca tgtaaaagat gaggttggtt cattctcgaa aattacatct 540

gtgttctcag agcggggcgt gagctttgaa aaaatccttc agctgccaat taaaggccat 600

gatgagttag ctgaaatcgt aattgtcaca catcatacat cagaagctga tttcagtgat 660

atcctgcaaa acctaaatga tttggaagtc gttcaagaag tcaaaagcac atatcgtgta 720

gaagggaacg gttggagcta atgtggaaag gacttatcca tcaatataaa gaatttttac 780

ctgtaacaga tcaaacaccg gcgctaactt tacatgaagg aaacacacct cttattcacc 840

tgccgaagct gtctgagcag ctcggaattg agcttcatgt caaaacggaa ggcgtcaatc 900

ctacgggatc atttaaagat cgcggaatgg ttatggctgt ggcaaaggca aaagaagaag 960

gcaatgacac gattatgtgc gcgtcaacag gtaacacttc 1000

<210> 70

<211> 1001

<212> DNA

<213> thrC下游同源臂

<400> 70

cgaagccgac atgctgttct ctgtcactgt tcccggaagc acagctaacc taggccccgg 60

ctttgattca gtcggaatgg cgctcagcag atatttgaag ctgaccgtct ttgaaagcga 120

caaatggtct tttgaggctg aaacagaaac agtcgccgga attccggcgg gtacagataa 180

cctgatctac caagtggcta aacggaccgc agatttgtac ggaaaagaaa tgcctcctgt 240

ccatgtgaag gtgtggagcg acatcccgct tgcacgcggc cttggcagca gcgccgcagc 300

gattgtagcg gccattgaac tggctgatga attatgcggc ttaaagctgt ctgaagcgga 360

caagctgcat ttagcgagtc tagaagaagg acacccggac aatgctggcg cttctctcgt 420

cggcggactt gtgatcggcc tgcatgagga tgacgagacc caaatgatcc gcgtcccgaa 480

tgctgacatt gacgtagtcg ttgtcattcc tttttatgaa gtgctgacaa gagacgcgag 540

agacgtgctt ccgaaggagt ttccatatgc cgatgccgta aaagcaagtg ctgtcagcaa 600

tatcctcatt gctgcgatca tgtccaagga ttggccgctt gtcgggaaaa tcatgaagaa 660

ggatatgttc catcagccgt accgggcgat gcttgtgcct gagctgtcaa aagtagagca 720

cgtcgccgag atgaagggcg catatggaac ggctctcagc ggagcaggcc caacgattct 780

cgtcatgacc gaaaaaggaa agggagaaga gctaaaagaa cagctcgcgc ttcatttccc 840

tcattgtgaa gtagacgctt tgaccgttcc gaaagaggga agtataatag agcgaaatcc 900

tttatatcaa gtaaaaagtg tatagatcat gccaagcgtt cctcagcgtc agcggagggc 960

gctttttttt gctggagata aaggagtttt tatttagaaa a 1001