一种血液循环肿瘤DNA点突变检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种血液循环肿瘤dna点突变检测方法。

背景技术：

cfdna存在于人体循环系统这一发现加强了其在不同临床领域的研究，cfdna检测最大的进步是近期被批准可以用于胎儿性别鉴定。1948年mandel和metais使用高氯酸沉淀的方法在人血浆和血清中检测出cfdna,但是这一发现在当时没有引起大家的关注，30–40年后cfdna吸引了很多小组的研究，其中leon他们发现癌症患者体内cfdna浓度显著增高，而stroun则证实cfdna源自肿瘤并携带肿瘤的分子学特征，由此诞生了“液体活检”这一概念。由于cfdna检测可以提供很多诊断、治疗和预后信息，一些研究人员正在集中研发新的技术，它可以通过分析癌症患者体内血浆或血清中cfdna来发现和描述肿瘤细胞遗传学和表观遗传变异特征，通过检测cfdna突变，实现肿瘤靶向治疗、个性化治疗的监测改变癌症患者的管理护理模式。cfdna分析近期已用于产前诊断并用于其它临床领域的检测，如：自身免疫性疾病、创伤、脓毒症和心肌梗死。

虽然有集中的研究，但是基于cfdna的实验很少转化为临床应用。用于检测和描述癌症患者体内cfdna特征的几项技术虽得到发展，包括限制性片段长度多态性、直接测序、高分辨率溶解分析、数字pcr、低温pcr和其它一些技术，但通常仅用于肿瘤组织分析。cfdna浓度作为癌症标记物尚未得到证实，因为大量的数据显示癌症患者血浆中的cfdna浓度由几纳克每毫升到几千纳克每毫升，与健康人体内cfdna的浓度有很大范围的重叠，此外发现肿瘤患者体内cfdna片段与正常对照者相比，或低、或相当或高于正常对照，这些现象就目前对cfdna知识的了解无法得到解释。

长期以来循环总dna浓度被设想作为一个潜在的肿瘤标记物，但是健康人和癌症患者体内cfdna浓度已经被证实有部分重叠，这点限制了其在临床上的应用。最近用现有的方法和特别设计一个特定的pcr体系，发现健康受试者和癌症受试者之间存在统计学意义上的差异。cfdna分析为肿瘤病人提供了一种非侵入性的肿瘤分子检测方法，特别是用于检测遗传或表观遗传改变，如点突变或单核苷酸多态性、微卫星变异、甲基化或拷贝数变异，特别是在过去的十年里利用点突变对癌症类型的研究。对诸如alk、egfr、braf或kras点突变的研究，可以作为筛选靶向治疗肺癌、黑色素瘤或结肠癌的一个先决条件，这是cfdna最先应用的领域。突变检测的标本通常来源于肿瘤组织，主要是原发性肿瘤，血液活检则很少应用。通过表1可以看出与肿瘤组织分析相比，血浆cfdna分析具有很多的优势。

循环肿瘤细胞dna(ctdna)点突变的检测方法必须非常灵敏，据推测癌症病人ctdna中不到0.001％携带有特异的基因突变，为此很多荧光定量pcr技术得以发展，例如arms-pcr(突变扩增系统，又称等位基因特异性扩增法)、taqman和flag-pcr(引物n端添加flag)，这些技术通过添加修饰碱基、特定的酶或者附加的程序，提高检测的灵敏性；一些新的先进技术也已经出现，如平行测序或集束技术这些则需要非常专业的知识和特殊精密复杂的仪器设备。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种荧光定量pcr检测突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的成套引物。

本发明提供的成套引物，包括扩增突变型靶序列的特异性引物和阻断序列；

所述突变型靶序列为所述突变型cfdna含有突变位点的区域；

所述扩增突变型靶序列的特异性引物由突变型上游引物和突变型下游引物组成；

所述突变型上游引物和所述突变型下游引物均与所述突变型靶序列结合，且所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基与所述突变型靶序列中位于所述突变位点的突变碱基互补；

所述阻断序列与野生型靶序列中含有野生型碱基片段互补，

所述野生型靶序列为所述突变型靶序列核苷酸序列中位于所述突变位点的突变碱基恢复为野生型碱基，使该突变位点变为野生型位点，其余核苷酸不变，得到的序列；

所述阻断序列的3’端封闭标记；

所述突变型cfdna为与野生型cfdna相比存在突变碱基的cfdna。

上述成套引物中，

所述试剂盒还包括用于扩增野生型靶序列的特异性引物，

所述用于扩增野生型靶序列的特异性引物由野生型上游引物和野生型下游引物组成；

所述野生型上游引物与所述突变型上游引物相同；

所述野生型下游引物为将所述突变型下游引物的3’末端最后一个碱基替换为所述野生型靶序列中位于所述野生型位点的野生型碱基的互补碱基，其余核苷酸不变，得到的引物。

上述成套引物中，

所述突变型靶序列和所述野生型靶序列的大小均为60-100bp；

或所述突变位点不位于所述突变型靶序列的两端或位于所述突变型靶序列的中部；

或所述突变位点位于所述突变型靶序列从5‘端起30-50bp的区域内；

或所述野生型靶序列中含有野生型碱基片段大小为15-25nt；

或所述野生型碱基的互补碱基不位于所述阻断序列的两端或位于所述阻断序列的中部；

或所述野生型碱基的互补碱基位于所述阻断序列从5‘端起6-15bp的区域内；

或所述各个引物大小均为20-30nt；

或所述阻断序列的大小为15-25nt。

上述成套引物中，

所述突变型上游引物、所述突变型下游引物和所述阻断序列的摩尔比为1:1：1；

或所述突变型上游引物和所述突变型下游引物的摩尔比为1:1。

上述成套引物中，

所述cfdna或其含有突变位点的部分片段为血液循环肿瘤dna或其含有突变位点的部分片段；

所述血液循环肿瘤dna或其含有突变位点的部分片段为k-ras基因或k-ras基因含有突变位点的部分片段；

所述k-ras基因含有突变位点的的核苷酸序列为序列1；

k-ras突变型靶序列的核苷酸序列为序列1；

k-ras突变位点为序列1第49位；

k-ras突变型上游引物的核苷酸序列为序列2；

k-ras突变型下游引物的核苷酸序列为序列3；

k-ras野生型靶序列为序列1的第49位的突变碱基a恢复为野生型碱基g，其余核苷酸不变，得到的序列；

k-ras野生型靶序列中含有野生型碱基片段为所述k-ras野生型靶序列第40－56位核苷酸；

所述阻断序列的核苷酸序列为序列4；

k-ras野生型上游引物的核苷酸序列均为序列2；

k-ras野生型下游引物为序列5。

本发明另一个目的是提供一种荧光定量pcr检测突变型cfdna的pcr试剂。

本发明提供的pcr试剂，包括a或a+b，

所述a包括上述成套引物中的所述扩增突变型靶序列的特异性引物、所述阻断序列和含有dna聚合酶的pcr缓冲液；

所述b包括上述成套引物中的所述扩增野生型靶序列的特异性引物和含有dna聚合酶的pcr缓冲液；

所述扩增突变型靶序列的特异性引物中各条引物在所述a中的浓度均为3pmol/ml；

所述扩增野生型靶序列的特异性引物中各条引物在所述b中的浓度均为3pmol/ml；

所述阻断序列在所述a中的浓度均为3pmol/ml。

含有上述成套引物或上述试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述成套引物或上述试剂的试剂盒或上述的试剂盒在制备检测突变型cfdna产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述成套引物或上述试剂的试剂盒或上述的试剂盒在制备检测突变型cfdna产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第3个目的是提供一种检测待测样品中突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的相对含量的方法。

本发明提供的方法，为方法1或方法2：

所述方法1包括如下步骤：

1)制备标准品，再稀释所述标准品，得到稀释后不同浓度的标准品，再用上述试剂中b对所述稀释后不同浓度的标准品进行荧光定量pcr扩增，得到稀释后不同浓度的标准品的ct值，以稀释后不同浓度的标准品和对应的ct值作标准曲线；

所述标准品为野生型cfdna或其含有野生型位点的大小为100-150bp的部分片段；

所述野生型cfdna为所述突变型cfdna核苷酸序列中位于所述突变位点的突变碱基恢复为野生型碱基，使该突变位点变为野生型位点，其余核苷酸不变，得到的序列；

2)用上述试剂中b和上述试剂中a分别对待测样品的cfdna进行荧光定量pcr扩增，得到目标野生型cfdna或其含有野生型位点的部分片段的ct值和目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的ct值；

3)将所述目标野生型cfdna或其含有野生型位点的部分片段的ct值和所述目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的ct值分别带入所述标准曲线中，得到目标野生型cfdna或其含有野生型位点的部分片段含量和目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段含量；

4)计算所述目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段含量占所述目标野生型cfdna含量或其含有野生型位点的部分片段含量和所述目标突变型cfdna含量或其含有突变位点的部分片段含量之和的百分比，得到待测样品中目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段相对含量；

所述方法2包括如下步骤：

1)用上试剂中b和上述试剂中a分别对待测样品的cfdna进行荧光定量pcr扩增，得到目标野生型cfdna或其含有野生型位点的部分片段的ct值和目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的ct值；

2)计算所述目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的ct值占所述目标野生型cfdna或其含有野生型位点的部分片段的ct值和所述目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段的ct值之和的百分比，得到待测样品中目标突变型cfdna或其含有突变位点的部分片段相对含量。

上述中，所述cfdna为k-ras；

或所述cfdna含有突变位点的部分片段为序列1。

文中所有的互补均为反向互补。

本发明提供了一种快速、准确的基因突变检测技术，通过等位基因特异性阻断荧光定量pcr技术，根据cfdna的特性比如结构特点和大小来精巧的设计引物，可以在一次反应中同时测定5个参数：(1)cfdna总浓度、(2)突变(肿瘤)cfdna浓度、(3)突变cfdna的比例、(4)cfdna破碎化指数、(5)已知点突变的检测，本发明的方法具有敏感性高、特异性强、耗时短和成本低的优点，且可以同时检测多个指标。

附图说明

图1为原理示意图。

图2为标准曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、cfdna荧光定量pcr检测方法的建立及专用试剂盒

一、cfdna荧光定量pcr检测原理

cfdna在样本中由突变型cfdna和野生型cfdna组成，野生型cfdna占大多数，但突变型cfdna是否含有或者含有的数量多少有助于判断样本是否发生癌变或者复发癌变。

原理示意图如图1所示。本发明根据突变型cfdna和野生型cfdna设计如下特异引物和阻断序列，3’端经过修饰(3’端封闭)的阻断序列包含与突变位点对应的野生型位点，该阻断序列的3‘端经过修饰，修饰后的序列可以与野生型的互补序列特异结合，但不能延伸，阻断野生型模板的扩增；特异引物中的下游引物的3‘端与突变位点互补，在合适的退火温度下，突变型序列得到扩增，野生型序列被阻断。

二、cfdna荧光定量pcr的特异引物和阻断序列及其专用试剂盒

1)特异引物和阻断序列设计原则

在突变型cfdna上选取含有突变位点的突变型靶序列60-100bp，突变位点位于所述突变型靶序列的中部，也就是突变型靶序列从5‘端起30-40bp的区域内；设计如下用于扩增突变型靶序列的特异性引物和阻断序列：

扩增突变型靶序列的特异性引物由突变型上游引物和突变型下游引物组成；

突变型上游引物和突变型下游引物均与靶序列特异结合，且突变型下游引物的3’末端最后一个碱基与靶序列中突变位点的碱基互补。

野生型靶序列为突变型靶序列核苷酸序列中突变位点的突变碱基恢复为野生型碱基，其余核苷酸不变。

阻断序列与野生型靶序列中含有野生型碱基片段互补，阻断序列的3’端进行封闭标记，阻断序列的大小为15-25个碱基，tm值为50-60度之间，野生型碱基位点的互补碱基位于阻断序列的中部。

根据野生型靶序列设计如下用于扩增野生型靶序列的特异性引物：

扩增野生型靶序列的特异性引物由野生型上游引物和野生型下游引物组成；

野生型上游引物为突变型上游引物；

野生型下游引物为将突变型下游引物的3’末端最后一个碱基替换为野生型靶序列中野生型位点的互补碱基。

2)专用试剂盒组分

cfdna荧光定量pcr专用试剂盒包括扩增突变型靶序列的特异性引物、阻断序列和扩增野生型靶序列的特异性引物。

实施例2、cfdna荧光定量pcr专用试剂盒在检测肺癌患者血液标本k-ras突变中的应用

一、荧光定量突变型cfdna特异引物和阻断序列及其专用试剂盒

肺癌患者的肿瘤细胞中存在突变型k-ras和野生型k-ras，k-ras基因是否突变、突变型k-ras的数量多少对于靶向药物的疗效以及是否耐药起到关键作用。

1、荧光定量突变型k-ras特异引物和阻断序列

在突变型k-ras基因上选取含有突变位点的突变型k-ras靶序列69bp(60-100bp)含有突变位点的突变型k-ras靶序列的核苷酸序列为序列1，第49位a为突变碱基；

gcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtgacgtaggcaagagtgccttga

对应的含有野生型位点的野生型k-ras靶序列为序列1的第49位的突变碱基a替换为野生型碱基g，其余碱基不变，得到的序列；

根据实施例1中二的1)的设计原则，设计用于扩增含有突变位点的突变型k-ras靶序列的k-ras突变型特异性引物和阻断序列：

扩增突变型k-ras靶序列的突变型特异性引物由k-ras突变型上游引物和k-ras突变型下游引物组成；

k-ras突变型上游引物的核苷酸序列为序列2：gcctgctgaaaatgactga，

k-ras突变型下游引物的核苷酸序列为序列3：5‘caaggcactcttgcctacgt－3’

其中k-ras上游引物与含有突变位点的突变型k-ras靶序列序列1的第1-19位核苷酸相同；k-ras下游引物与含有突变位点的突变型k-ras靶序列序列1的第49-69位核苷酸互补，k-ras下游引物的3’末端最后一个碱基t与该靶序列中突变位点第49位的碱基a互补；

k-ras阻断序列的核苷酸序列为序列4，gcctacgccaccagctc－pho其与含有野生型位点的野生k-ras靶序列第40－56位互补，序列4第9位c与野生型碱基g互补，3‘末端封闭(磷酸化修饰封闭)。

根据对应的含有野生型位点的野生型k-ras靶序列设计如下用于扩增k-ras野生型靶序列的特异性引物：

扩增k-ras野生型靶序列的特异性引物由k-ras野生型上游引物和k-ras野生型下游引物组成；

k-ras野生型上游引物为突变型上游引物；

k-ras野生型下游引物为5‘caaggcactcttgcctacgc－3’(序列5)。

2、k-raspcr专用试剂盒

k-raspcr专用试剂盒包括扩增突变型k-ras靶序列的突变型特异性引物、阻断序列和扩增k-ras野生型靶序列的特异性引物。

二、k-ras荧光定量pcr

1、提取样本的cfdna

标本处理：5毫升肺癌患者的静脉抗凝血(edta－抗凝)，1600g离心10分钟，取上清，16000g离心10分钟，上清开始提取cfdna或者－80度冻存备用，得到离体血清。

cfdna的提取方法：使用商业化的游离dna提取试剂盒(qiaampcirculatingnucleicacidkit,qiagen,hilden,germany)从离体血清中提取cfdna，提取方法按照说明书进行，得到cfdna。

2、荧光定量pcr制备标准曲线

(1)标准品的制备

为了模板cfdna，选用的标准品为含有野生型位点的野生型k-ras基因100-150bp的片段溶于水中，得到的溶液。

上述含有野生型位点的野生型k-ras基因100-150bp的片段dna长度为150bp,序列如下：gcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtgacgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagta(序列6)。

序列合成的公司为生工生物工程(上海)股份有限公司(上海，中国)；根据其分子量、od值，按照公式计算标准品浓度，将标准品配置为终浓度100um。

研究表明，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代ct值。因此，只要获得未知样品的ct值，即可从标准曲线上计算出该样数。

(2)荧光定量pcr检测作标准曲线

将已知浓度的标准品做系列10倍稀释(10,1，0.1，0.01，0.001，0.0001um)，得到稀释后标准品。

分别以稀释后标准品和标准品为模板，用扩增k-ras野生型靶序列的特异性引物进行pcr扩增，根据标准品扩增的ct值做标准曲线。

pcr扩增反应体系25μl：12.5μlsupermixsybrgreenpcr混合物(lifetechnology,cat.no.4309155)、2.5μl标准品扩增引物(每条引物在反应体系中的终浓度为3pmol/ml)、2.5μlpcr分析水和5μl标准品或稀释后标准品。

使用cfx软件的cfx96仪器进行q-pcr。

荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变3min；95℃变性10s和60℃退火30s，40个循环。

结果标曲为图2，函数式是：y＝－1.44ln(x)+20.3(r²＝0.972).

3、荧光定量pcr检测k-ras突变

用上述1提取的cfdna为模板，分别用扩增突变型k-ras靶序列的突变型特异性引物、阻断序列和扩增野生型k-ras靶序列的特异性引物进行pcr扩增，检测突变型k-ras的ct值和野生型k-ras的ct值。

检测突变型k-ras的ct值的反应体系25μl：12.5μl2xpcr混合物(lifetechnology,cat.no.4309155，含有taqdna聚合酶)、2μl扩增突变型k-ras靶序列的突变型特异性引物(每条引物在反应体系中的终浓度为3pmol/ml)、1μl阻断核苷酸序列(终浓度为3pmol/ml)，2μl上述1提取的cfdna，7.5μl的纯水。

检测野生型k-ras的ct值的反应体系25μl：12.5μl2xpcr混合物、2μl扩增野生型k-ras靶序列的特异性引物(每条引物在反应体系中的终浓度为3pmol/ml)、2μl上述1提取的cfdna，9.5μl的纯水。

使用cfx软件的cfx96仪器进行q-pcr。

荧光定量pcr反应程序如下：95℃、3min预变性；95℃、10s和60℃、30s，40个循环；72℃3min。

结果：

突变型k-ras的ct值为33。

野生型k-ras的ct值为27；

将上述ct值带入上述2得到的标曲中，得到突变型k-ras的浓度约为0.005um，野生型k-ras的浓度为约为1.000um。

计算突变型k-ras的相对含量＝突变型k-ras浓度/突变型k-ras浓度+野生型k-ras的浓度。

可以看出，肺癌患者的突变型k-ras的相对含量为1/201，表明在201个拷贝k-ras基因中有1个k-ras基因已经发生了相应位点的突变。

用数字pcr方法检测肺癌患者血清标本中突变型k-ras和野生型k-ras数量，计算突变型k-ras的相对含量，结果与本发明无显著差异，说明本发明的方法正确。

序列表

<110>罗保君

<120>一种血液循环肿瘤dna点突变检测方法

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>69

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<213>

<400>1

gcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtgacgtaggcaaga60

gtgccttga69

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<213>

<400>2

gcctgctgaaaatgactga19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<213>

<400>3

caaggcactcttgcctacgt20

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<213>

<400>4

gcctacgccaccagctc17

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<213>

<400>5

caaggcactcttgcctacgc20

<210>6

<211>146

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<213>

<400>6

gcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtgacgtaggcaaga60

gtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatag120

aggattcctacaggaagcaagtagta146