用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

食源性疾病目前是全世界关注的重要公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，每年都会有数千万的人因感染食源性致病菌而发病，严重者导致死亡。志贺氏菌(shigella)作为主要的食源性致病菌之一，在我国引起感染性腹泻的致病菌中居首位。志贺氏菌属由4种革兰氏阴性、非运动性、无芽孢形成的杆状细菌组成，分别是鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。毒力较强的志贺氏菌可以引起人类细菌性痢疾，可表现出轻度痢疾、发热、腹部绞痛以及严重的体液流失。

目前的分子生物学检测方法可以有效地克服传统检测方法的部分劣势而被多数研究者所青睐，其中重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification,rpa)技术因其特异性强、灵敏性高、反应时间短、操作简便等优点而受到广泛的关注，具有巨大的发展前景。

传统的志贺氏菌检测主要依赖于细菌培养及一系列的生化鉴定，检测周期较长，无法实现快速检测。目前已建立了多种志贺氏菌的检测方法。常规的检验程序需要增菌、选择性平板分离培养、生化试验、血清学分离鉴定等，耗时长，操作繁琐，难以满足大批量样品检测或突发公共卫生事件处理的需求。在分子生物学检测方面，常用的方法包括聚合酶链式反应(pcr)、环介导等温扩增法(lamp)和基因芯片技术等。pcr反应由变性、退火、延伸三个基本步骤构成，反应完成后进行电泳检测，必要时需要对产物进行纯化或测序分析，一般需要经验丰富的技术人员进行操作，且需要昂贵的pcr仪。lamp扩增目的片段时依赖于一种具有链置换特性的dna聚合酶和4-6条能够识别靶序列六个特异区域的引物，引物设计较为繁琐，其扩增产物经电泳检测呈现出梯度条带，不易与非特异性条带区分。

技术实现要素：

针对现有志贺氏菌检测程序复杂、引物设计繁琐、仪器昂贵等问题，本发明提供一种用于志贺氏菌的检测试剂盒。

进一步地，本发明还提用于志贺氏菌的检测方法及应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光rpa检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原h基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-ctgcatggctggaaaaactcagtgcctctg-3'

下游引物：5'-gttctgactttatcccgggcaatgtcctcc-3'

探针：5'-ccatcaggcatctgaaggccttttcga-fam-dt-thf-a-bhq1-dt-gataccggcgctctgctc-c3-3'。

进一步地，本发明还提供一种用于志贺氏菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光rpa方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组dna；

步骤2、采用上述用于志贺氏菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述dna进行等温扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；

步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌。

本研究以志贺氏菌侵袭性质粒抗原h基因(ipah)作为靶基因，根据其保守序列设计特异性引物及exo探针，建立了用于食品中志贺氏菌快速检测的real-timerpa方法。

相对于现有技术，本发明提供的用于志贺氏菌检测的实时荧光rpa方法的建立，具有以下优势：(1)操作简便，仅需增菌提取核酸后即可上机检测，所有试剂均以冻干粉的形式保存在反应管中；(2)反应时间短，不需要热变性，20min内即可完成；(3)反应结果可直接观察，无需电泳检测；(4)便携式荧光检测设备的使用。本研究中使用的genieiii等温扩增荧光检测系统紧凑小巧，轻便耐用，仅为1.75kg左右，触摸屏操作，无需连接电脑，其内置长航时锂电池，可在无电源环境中全天户外工作，可用于微生物性食品中毒事件原因的现场检测。

进一步地，本发明还提供所述的检测试剂盒或检测方法在志贺氏菌检测技术领域的应用。

本研究中运用建立的real-timerpa方法，对人工污染志贺氏菌的不同样品进行检测，当样品污染量为46cfu/25g、增菌6h时，鸡肉中可检出志贺氏菌。本研究中real-timerpa和real-timepcr检测结果一致，但是前者检测所需时间明显小于后者。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的real-timerpa灵敏性试验结果示意图；

图2是本发明对比例提供的real-timepcr灵敏性试验结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光rpa检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原h基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-ctgcatggctggaaaaactcagtgcctctg-3'

下游引物：5'-gttctgactttatcccgggcaatgtcctcc-3'

探针：5'-ccatcaggcatctgaaggccttttcga-fam-dt-thf-a-bhq1-dt-gataccggcgctctgctc-c3-3'。

优选地，所述检测试剂盒还包括冻干酶制剂和醋酸镁溶液。

优选地，所述检测试剂盒的反应体系组成如下：2μl的10μm的上游引物，2μl的10μm的下游引物，0.6μl的10μm的探针，12.5μl的体积浓度为20％的聚乙二醇，1μl的病毒dna模板，29.4μl的ddh2o。

优选地，所述冻干酶制剂包括1mm的脱氧核糖核苷三磷酸，90ng/μl的单链结合蛋白，120ng/μl的reca重组酶，30ng/μl的bsudna聚合酶，30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三羟甲基甘氨酸，体积浓度为20％的聚乙二醇，5mm的二硫苏糖醇，100ng/μl的肌酸激酶。

本发明还提供一种用于志贺氏菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光rpa方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组dna；

步骤2、采用上述用于志贺氏菌的检测试剂盒对步骤1所提取的所述dna进行等温扩增反应；其中，所述等温扩增反应的温度为37-39℃，时间为20-30min；

步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌。

优选地，所述等温扩增反应在温度设定为39℃的等温扩增荧光检测仪中进行，反应时间为20min。

优选地，所述志贺氏菌的上、下游引物的终浓度均为0.4μm，探针的终浓度为0.12μm。

优选地，所述志贺氏菌的dna的提取包括以下步骤：将宋内氏志贺氏菌纯培养菌接种于8-12ml营养肉汤中，在34-36℃下培养16-18h；取1ml菌液以10000rpm转速离心1min，弃上清液；将菌体沉淀按照细菌dna提取试剂盒方法提取细菌基因组dna，提取完毕后立即使用或-20℃保存备用。

优选地，使用超微量分光光度计测定所提取的细菌基因组dna的核酸浓度。

本发明还提供所述的检测试剂盒或检测方法在志贺氏菌检测领域中的应用。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

本实施例与对比例提供的用于志贺氏菌检测的实时荧光rpa方法的建立，所采用的主要试剂与设备有：志贺氏菌增菌肉汤、木糖赖氨酸脱氧胆盐(xld)琼脂、营养肉汤等细菌培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司；细菌基因组dna提取试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；premixextaq购自宝生物工程(大连)有限公司；raa试剂盒(荧光型)购自浙江泰晶生物科技有限公司；引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

genieiii等温扩增荧光检测系统，英国optigene公司；abi7500实时荧光pcr仪，美国abi公司；nanodrop2000c超微量分光光度计，美国thermoscientific公司。

实施例1用于志贺氏菌的检测方法-实时荧光rpa方法的建立

1、引物及探针序列的设计及制备

本研究以志贺氏菌侵袭性质粒抗原h基因(ipah)作为靶基因，根据其保守序列设计特异性引物及exo探针，建立了用于食品中志贺氏菌快速检测的real-timerpa方法。

本发明发明人通过对于genebank中志贺氏菌ipah基因序列(登录号：ae005674)，进行分析，选择保守区域，设计real-timerpa引物及exo探针，目的片段大小为247bp。

本发明设计合成了一对引物和一条探针，如表1所示。

表1本发明设计的志贺氏菌real-timerpa引物和探针

2、志贺氏菌菌株及细菌基因组dna的提取

将志贺氏菌(cicc21679)纯培养菌接种于10ml营养肉汤中，36℃培养18h；取菌液1ml加入1.5ml移液管中，以10000rpm的转速离心1min，弃上清液；将菌体沉淀按照细菌基因组dna提取试剂盒所述方法提取细菌dna，立即使用或-20℃保存备用，同时使用nanodrop2000c超微量分光光度计测定所提取的宋内氏志贺氏菌的核酸浓度。

3、志贺氏菌检测试剂盒的制备

使用raa试剂盒(荧光型)配制单个反应体系，反应体系中如下：2μl的10μm的上游引物(终浓度为0.4μm)，2μl的10μm的下游引物(终浓度为0.4μm)，0.6μl的10μm的探针(终浓度为0.12μm)，12.5μl的体积浓度为20％的聚乙二醇，1μl的病毒dna模板，29.4μl的ddh2o。将上述将47.5μl体系混匀后加入到装有冻干酶制剂的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，然后向反应管中加入2.5μl的280mm的醋酸镁，瞬时离心并涡旋后放入等温扩增荧光检测仪genieiii中，温度设定为39℃，反应时间为20min。

所述冻干酶制剂包括1mm的脱氧核糖核苷三磷酸，90ng/μl的单链结合蛋白，120ng/μl的reca重组酶，30ng/μl的bsudna聚合酶，30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三羟甲基甘氨酸，体积浓度为20％的聚乙二醇，5mm的二硫苏糖醇，100ng/μl的肌酸激酶。

4、志贺氏菌检测方法-real-timerpa方法的建立

所述检测方法的建立包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组dna；

步骤2、对步骤1所提取的所述dna进行等温扩增反应；其中反应液采取上述的志贺氏菌的上、下游引物及探针，将所述反应液混匀，加入到装有冻干酶制剂的反应管中，溶解，再向反应管中加入2.5μl的280mm的醋酸镁溶液，进行扩增反应；

扩增反应在温度设定为37-39℃的等温扩增荧光检测仪中进行，反应时间为20-30min；

步骤3、通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在志贺氏菌。

为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。

对比例1用于志贺氏菌检测方法-real-timepcr方法的建立

1、real-timepcr的一对引物和探针如表2所示.

表2本发明设计的志贺氏菌real-timepcr引物和探针

2、real-timepcr方法的建立

反应体系为：2μl的10μm的上游引物(终浓度为0.8μm)，2μl的10μm的下游引物(终浓度为0.8μm)，0.9μl的5μm的探针(终浓度为0.18μm)，12.5μl的premixextaq，1μl的病毒dna模板，6.6μl的ddh2o。

将上述体系充分混匀后放入abi7500实时荧光pcr仪中，反应程序设置为：95℃，预变性30s；95℃变性5s，60℃延伸35s，35个循环，60℃收集荧光信号。

为了更好的说明本发明实施例提供的用于志贺氏菌检测的实时荧光rpa方法的应用，下面将实施例1与对比例1分别作特异性、灵敏性试验以及人工污染样品检测的试验。

特异性试验

以表3中所示菌株的基因组dna作为模板进行real-timerpa反应，确定是否出现特异性扩增曲线。

表3

注：+，阳性结果；－，阴性结果。

以志贺氏菌和其他细菌dna作为模板进行real-timerpa检测，结果如表3所示，仅志贺氏菌呈现典型的扩增曲线，其他细菌均无扩增，说明该方法具有良好的特异性。

灵敏性试验

将浓度为35ng/μl的志贺氏菌基因组dna使用ddh2o进行10倍梯度，连续稀释7个梯度后，每个梯度dna分别进行real-timerpa和real-timepcr反应，确定该方法的灵敏性，检测结果如图1和图2所示。

图1为real-timerpa检测结果，图2为real-timepcr检测结果。图1、2中1:3.5×10¹ng/μl；2:3.5×10⁰ng/μl；3:3.5×10^-1ng/μl；4:3.5×10^-2ng/μl；5:3.5×10^-3ng/μl；6:3.5×10^-4ng/μl；7:3.5×10^-5ng/μl。

从图1、2检测结果中可以看出，real-timerpa的检测限为3.5×10^-3ng/μl，同real-timepcr方法检测限一致。

人工污染样品检测的试验

将宋内氏志贺氏菌(cicc21679)经过夜纯培养后，用生理盐水进行10倍梯度稀释，选取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度的菌液200μl涂于xld琼脂平板上，并作3个平行样品，用于计算纯培养菌的初始浓度。选择1-10、10-50、50-100cfu范围内细菌分别添加到25g西兰花和25g鸡肉样品中(样品预先按照gb4789.5-2012检测，均未检出志贺氏菌)；然后再添加到225ml志贺氏菌增菌肉汤中，在36℃条件下培养。增菌6h、8h后分别取1ml菌液参照本发明提供的细菌基因组dna的提取方法进行细菌dna的提取，取1μl作为模板进行real-timerpa和real-timepcr检测，检测结果如表4所示。

表4人工污染样品检测的试验检测结果

注：－，未检出。

由表4可以看出，对人工污染志贺氏菌的西兰花、鸡肉样品增菌后，real-timerpa检测结果表明，三个浓度的污染量在增菌时间为8h时，两种样品中的志贺氏菌均可检出；当样品污染量为46cfu/25g、增菌时间为6h时，鸡肉样品中志贺氏菌可检出，而西兰花样品中未能检出；当样品污染量为101cfu/25g、增菌时间为6h时，两种样品中的贺氏菌均可检出。两种方法对所有样品的检测结果一致，但是real-timerpa仅需要7-12min，而real-timepcr则需要35min以上(ct值为27-34之间)。

在细菌污染量、增菌时间相同的情况下，鸡肉中志贺氏菌检出所需要的时间均小于西兰花样品，这可能是由于不同基质提取核酸的效率不同，或是不同介质中细菌繁殖数量有差异导致。

本发明建立针对志贺氏菌的real-timerpa方法特异性强、灵敏性高，操作简单，反应时间短，可以实现对食品样品中志贺氏菌的有效检测，并可以用于现场检测，为食品和食源性公共卫生事件中的志贺氏菌的检测提供了一种新方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctgcatggctggaaaaactcagtgcctctg30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gttctgactttatcccgggcaatgtcctcc30

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccatcaggcatctgaaggccttttcgaagataccggcgctctgctc46

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttcgtgcatgtcttacctctaagg24

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgcaagcagggagtacaggtaac23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列acctgcgagccttggcgctttc

<400>6

acctgcgagccttggcgctttc22