专利名称：米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属米格列奈的应用，特别涉及米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
背景技术：
脑卒中(stroke)是一组突然起病、以局灶性神经功能缺失为特征的脑血液循环障碍性疾病。其病因主要是各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂，从而导致急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性神经功能障碍的症状和体征，具有高发病率、高致死率、高致残率、高复发率等特点，存活患者中多遗留有偏瘫、失语等功能障碍。在欧美国家，脑卒中是继肿瘤、心脏疾病之后的的第三大死亡原因，而在我国位居死亡原因第二位。给患者本人、家庭乃至社会带来极大的经济负担和不良影响。脑卒中患者中80%属于缺血性脑卒中，目前临床除了早期溶栓措施，急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)的临床治疗依然缺乏有效手段，而溶栓治疗的时间窗极短且不能打断AIS所致的继发性损害及其引起的恶性循环。应用实验动物制备中枢神经系统损伤模型的研究发现，由缺血诱导的一系列瀑布样延迟性生化反应是导致脑卒中组织损伤及长期行为学障碍的关键原因，其病理机制包括兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、炎症反应和再生障碍等等，深入研究脑卒中神经损伤及神经保护机制，开拓有效治疗脑卒中的药物已成为不容忽视的社会性问题，故研发理想的缺血性脑卒中神经保护剂和治疗策略显得十分紧迫和必要。米格列奈属苯丙氨酸衍生物，非磺酰脲类促胰岛素分泌剂，特异性作用于Kir6.2 / SURl亚型抑制K-ATP通道，通过关闭胰岛β细胞上的K+-ATP通道使β细胞膜去极化，钙通道开放，Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度增加而促使含胰岛素的囊泡脱颗粒，从而刺激胰岛素分泌，近年来作为早期及轻、中度2型糖尿病患者一线治疗的降糖药。与磺脲类药物相比，米格列奈具有速效、强效、短效降糖的特点，以及受体特异性高、给药灵活方便、安全性高、耐受性好、在体·内无蓄积等优势，被认为是未来的一种理想的餐时血糖调节剂。近年来研究发现，米格列奈降低餐后血糖的同时，还具有降低餐后氧化应激和炎症因子的作用。此外，研究发现米格列奈能维持并延长缺血预处理对心肌缺血的保护作用，但其对脑缺血神经损伤、神经退行性疾病等神经损伤性疾病的保护作用目前尚未见报道，将其发展为缺血性脑卒中治疗药物具有极高的潜在价值与社会意义。
发明内容
发明目的本发明的目的是通过米格列奈药理作用的研究，设计其在米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。技术方案米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。所述缺血性脑卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中。
米格列奈的用量在不引起血糖降低的范围内，可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗疾病的严重程度等有所变化，每日一次或多次使用。所述米格列奈的单次应用量为单次应用量为小鼠0.0lmg/kg 1.0mg/kg，大鼠0.0035mg/kg 0.35mg/kg,人 0.00056mg/kg 0.056mg/kg ;标准体重人(70kg)单次使用量 0.04mg 4mg。有益效果:1、迄今为止，寻找和发现新的脑卒中神经保护剂对于临床医生和科研工作者来说都是一项挑战。本发明将米格列奈应用暂时性缺血性脑卒中小鼠模型、永久性缺血性脑卒中大鼠，以及离体氧糖剥夺(OGD)细胞损伤性模型研究发现:(I)米格列奈在不降低血糖的剂量下显著改善短暂性大脑中 动脉栓塞模型(tMCAo)小鼠神经功能障碍，减小脑梗死面积；随米格列奈剂量增加，降糖作用增强，脑缺血损伤保护作用却减弱或无；(2)米格列奈降低永久性大脑中动脉栓塞模型(PMCAo)大鼠脑梗死体积；(3)米格列奈显著改善OGD所致SH-SY5Y神经元细胞株活性与细胞活力的降低，抑制LDH的释放，减少细胞凋亡。这些研究结果表明米格列奈具有治疗缺血性脑卒中、减少OGD所致神经元损伤的作用，可用于制备缺血性脑卒中的治疗药物。2、本发明中米格列奈的单次剂量是对治疗效果有重要意义，具体为低于或高于剂量都没有效果或效果很差。3、本发明首次证实米格列奈在不降低血糖剂量时对缺血性脑卒中具有治疗作用，将其作为制备治疗缺血性脑卒中用药将具有巨大的市场价值和社会效益。
:附图1:MCA0模型的制备与监测，A:大脑中动脉闭塞模型图解；B:激光多普勒血流仪监测的局部脑血流；附图2:米格列奈对 tMCAo 小鼠血糖的影响(*P〈0.05, #P〈0.01, vs.tMCAOO; #P<0.05，##P<0.01，###P<0.0Olvs.BeforeI/R;mean±S.E.M, n=6)；附图3:米格列奈对tMCAo小鼠神经功能障碍的影响(*P〈0.05，**P〈0.01，vs.Sham; #P<0.05，##P<0.01 VS.tMCAOO; Mean ± S.E.M, n=6 )；附图4:米格列奈对tMCAo小鼠脑梗死体积的影响(*P〈0.05, ***P〈0.001, tMCAOO;mean +S.E.Μ, n=6)；附图5:米格列奈对pMCAo大鼠脑梗死体积的影响(A:pMCAo大鼠脑切片TTC染色；B:pMCAo 小鼠脑梗死体积统计，*Ρ〈0.05, vs.pMCAo; mean土 S.Ε.Μ, η=6)；附图6.米格列奈对SH-SY5Y细胞OGD后细胞活力的影响(*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.0Olvs.Control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.0Olvs.0GD; mean + S.E.M, n=4.)；附图7:米格列奈对SH-SY5Y细胞OGD后LDH释放的影响(*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.0Olvs.Control; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.0Olvs.0GD; mean + S.E.M, n=4.)；附图8.米格列奈对SH-SY5Y细胞OGD所致凋亡的影响具体实施方式
:实施例1米格列奈对短暂性大脑中动脉栓塞模型(tMCAo)小鼠的神经保护作用1.1实验材料1.1.12-3月龄，雄性C57BL/6J小鼠，24-28g。购自南京医科大学实验动物中心，动物生产许可证号=SCXK (苏)2008-0004。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2) °C，湿度50-60%，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。1.1.2米格列奈钙(连云港润众制药有限公司，批号1612001)，以生理盐水配制，母液浓度 1.2mg/ml, -20°C|C存。2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(2，3, 5-triphenyItetrazoliumchloride, TTC,购自sigma公司),余均为市售商品。1.2 方法1.2.1tMCAo小鼠模型:小鼠术前禁食8_10h，自由饮水。腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉小鼠,参照Longa法,用6-0娃胶包被的尼龙单丝线(Doccol Corp)制备单丝管腔内右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCA0)模型。在缺血60分钟后，轻取出尼龙线，并恢复颈总动脉血供。缺血和再灌注过程都由激光多普勒血流仪(LDF) (Moor Instruments, Devon, UK)监测证实(图1),体温维持在 36°C _37°C。伪手术组动物，接受相同的麻醉和手术过程，除了不进行tMCAO。1.2.2给药与取样检测 :C57BL/6J小鼠随机分为暂时性大脑中动脉栓塞再灌注模型组(tMCAo)，米格列奈不同剂量组。小鼠在大脑中动脉栓塞再灌注后60min灌胃给予不同剂量的米格列奈，0.2ml/10g体重，模型组同法给予等量的生理盐水。在小鼠缺血前、缺血后2、24h尾静脉取血测定血糖值，术后24h进行神经功能障碍评分、脑梗死体积等药效学评价。1.2.3神经功能障碍评分:根据五分制评分标准，对各组小鼠进行神经运动功能障碍评分:0分，正常，无神经学征象；1分，不能完全伸展左前肢；2分，行走时左侧转圈；3分，行走时左侧倾倒；4分，无自主行走并伴有意识水平降低；5分，死亡。1.2.4脑梗死体积测定:小鼠断头处死，迅速取出脑组织，去除嗅球、小脑及低位脑干，-2(TC冰冻lOmin。自前极(anterior pole)连续切取Imm厚度脑冠状切片，置2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2，3, 5-triphenyltetrazoliumchloride, TTC,购自 sigma 公司)生理盐水溶液中37°C避光孵育lOmin，10%甲醛中性缓冲液(pH7.4)固定过夜。微距相机拍摄，Image pro plus5.1图像分析软件计算并统计脑梗死体积。1.3 结果1.3.1血糖监测:tM0AC小鼠单次灌胃0.05,0.1,0.33mg/kg米格列奈血糖波动与给药前比较无显著性差异(P > 0.05)，灌胃给予l、3、6mg/kg米格列奈小鼠血糖显著低于给药前(P < 0.05或P < 0.01或？ < 0.001);给药2h时，3、6mg/kg米格列奈组小鼠血糖较对照显著降低(与tMCAOO比较P < 0.05或卩< 0.01)，如图2所示。提示，lmg/kg米格列奈以上剂量具有降低tMCAO小鼠血糖的作用。1.3.2神经功能评价:tMCAo模型组小鼠手术后出现损伤对侧的左前肢不能伸展，行走时左侧转圈或倾倒，甚至无法自主行走、意识水平降低或死亡等显著的缺血性脑卒中神经功能障碍症状。单次灌服米格列奈对小鼠tMCAo所致神经功能活动障碍呈双向反应，当剂量增加作用增强，至0.33mg/kg时保护作用最强(与tMCAO对照比较P < 0.05或P <
0.001)，大于此剂量后随剂量的增加保护作用减弱或几无(图3)。对照血糖测定结果发现:随剂量的增加小鼠血糖降低，神经功能活动障碍增加。提示米格列奈具有减轻小鼠tMCAo所致神经功能障碍的作用，对缺血性脑卒中神经损伤的保护作用呈剂量相关性。1.3.3脑梗死体积:图4结果显示与图3相似，单次灌服米格列奈对小鼠tMCAo所致脑梗死体积的增加呈双向反应，随剂量增加脑梗死体积降低，至0.33mg/kg时保护作用最强(与tMCAO对照比较P < 0.05或卩< 0.001)，此后随剂量的增加保护作用减弱或几无，该作用与米格列奈降糖程度呈反比。提示米格列奈具有降低tMCAo小鼠脑梗死体积的作用。本实施例提示米格列奈对缺血性脑卒中的治疗作用具有双向性，在不降低血糖的剂量下可减轻缺血性脑卒中神经功能障碍，减少脑梗死体积；随米格列奈剂量增加，降糖作用增强，脑缺血损伤保护作用减弱或无。表明米格列奈具有治疗缺血性脑卒中的可能。实施例2米格列奈对永久性大脑中动脉栓塞模型(pMCAo)大鼠的神经保护作用研究2.1实验材料2.1.1动物:2-3月龄，雄性SD大鼠，230_270g。购自南京医科大学实验动物中心，动物生产许可证号=SCXK (苏)2008-0004。喂养条件包括标准饲料，自来水，室温保持在(24±2) °C，湿度50-60%，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。2.1.2 同 1.1.2。2.2 方法pMCAo大鼠模型:大鼠术前禁食12h，腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠，使大鼠停止自主活动，肌肉松弛。参照tMCAo小鼠模型，制备单丝管腔内右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAo)模型。结扎ICA止血,剪除导线并固定血管内栓线，逐层缝合肌肉、腺体和皮肤，伤口消毒后局部使用抗生素防止感染，仰卧置于温箱中待麻醉清醒。手术过程由激光多普勒血流仪监测证实，体温维持在36°C_37°C。伪手术组动物，接受相同的麻醉和手术过程，除了不向血管内插入栓线与结扎ICA。分组与给药:SD大鼠随机分为永久性大脑中动脉栓塞模型组(pMCAo)，0.16mg/kg米格列奈治疗组。大鼠在大脑中动脉栓塞3h灌胃给予米格列奈，0.2ml/100g体重，对照组同法给予等量的生理盐水，每日I次，连续给药3天后进行脑梗死体积评价。评价指标:脑梗死体积评价方法同实施例1中1.2.
2.3.结果pMCAo大鼠连续3d灌胃给予0.16mg/kg米格列奈,与模型对照比较脑梗死体积显著降低(图5，p〈0.05)，提示米格列奈具有治疗永久性缺血性脑卒中的作用。实施实例3米格列奈对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞损伤的保护作用3.1实验材料SH-SY5Y细胞株:神经元细胞株，购于中国医学科学院协和细胞所。甲氮甲唑蓝(MTT)购自广州化学试剂厂；酶标仪购自Thermo公司。LDH测定试剂盒:南京建成生物工程研究所产品。
3.2 方法3.2.1SH-SY5Y细胞氧糖剥夺模型:SH_SY5Y细胞株培养于含10%FBS的DMEM培养基中(37°C，5%C02),实验前接种于96孔板上培养24小时。实验日，预先给药孵育30min后换含药无糖DMEM培养基，至三气培养箱中(37°C，1%02，94%N2, 5%C02)氧糖剥夺培养60min后恢复氧糖正常培养24h，取样检测。Mitiglinide药物孵育浓度分别为10_1(1、10_9、10_8、10'10_6和10_5mol。3.2.2LDH与细胞活力:给予不同药物处理的SH-SY5Y细胞经氧糖剥夺恢复氧糖正常培养24h后，收集上清用于测定LDH ;再加入5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150 μ 1DMS0混匀，选择570nm波长测定各孔光吸收值，记录结果。细胞活力(％)=实验组光吸收值/对照组光吸收值X 100%。3.2.3.细胞凋亡:给予不同药物处理的SH-SY5Y细胞经氧糖剥夺后，D-Hanks溶液漂洗两遍，消化离心细胞。重悬清洗两遍，加入500 μ ΙΡΙ/AnnexinV混合液重悬混勻。室温避光作用10分钟后，使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡。3.3 结果离体研究发现，氧糖剥夺Ih导致SH-SY5Y细胞存活率降低，促进LDH释放，增加细胞凋亡，较control组均有显著性差异。l(rlclmol/L l(T7mol/L米格列奈显著改善OGD所致的细胞存活率降低、减少LDH释放、抑制O⑶诱导的细胞凋亡(图6 图8)，以10_8mol/L米格列奈作用较强。本实施例表明，米格列奈显著改善OGD所致的神经元活性与增殖能力的降低，抑制LDH的释放，减少细胞凋亡， 具有保护OGD所致神经元损伤的作用。
权利要求
1.米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
2.根据权利要求书I所述的米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用，其特征在于所述缺血性卒中为急性期或修复期的缺血性脑卒中。
3.根据权利要求书2所述的米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用，其特征在于所述米格列奈的单次应用量仅限于不引起血糖降低的剂量。
4.根据权利要求书2所述的米格列奈在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用，其特征在于所述米格列奈的单次应用量为小鼠0.0lmg/kg 1.0mg/kg,大鼠0.0035 mg/kg ·0.35mg/kg,人 0.00056mg/kg 0.056mg/kg ;标准体重人 70kg 单次使用量 0.04mg 4mg。
全文摘要
本发明提供了米格列奈((Mitiglinide,MGN))在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。本发明通过实验发现米格列奈在不降低血糖剂量时显著改善缺血性脑卒中模型小/大鼠的神经功能障碍，降低脑梗死体积；米格列奈抑制氧糖剥夺(OGD)所致神经元细胞株SH-SY5Y细胞存活率的降低，减少乳酸脱氢酶(LDH)的释放，改善OGD诱导的神经元凋亡。结果表明米格列奈具有治疗缺血性脑卒中、减少OGD所致神经元损伤的药理作用，该治疗作用具有双向性。本发明的作用是将米格列奈作为活性成份用于制备缺血性脑卒中的治疗药物。
文档编号A61P9/10GK103239440SQ20131017270
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月10日 优先权日2013年5月10日
发明者胡刚, 王林晓, 丁建花, 董银凤, 曹文静 申请人:南京医科大学