miR-106b-5p及其检测引物和其反义核苷酸序列在诊断、治疗缺血性脑卒中领域中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微小核糖核酸的应用领域，更具体地说，设及miR-106b-5p的检测引物 和反义核巧酸序列在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 脑卒中（S化oke)属于中医的"中风"范畴，是好发于中老年人的一种常见病、多发 病、难治病，其病残率、病死率、复发率仍居高不下。据2013年报道，脑卒中已经成为中国人 死亡的主要原因。脑卒中最常见的类型是缺血性脑卒中。目前，缺血性脑卒中的诊断主要依 赖接诊医生的临床观察和影像学证据。在缺血性脑卒中的早期，临床表现并不总是很典型， 计算机断层扫描的影像变化并不显著，磁共振成像虽然可W发现轻度缺血性脑卒中，但是 一些急性期患者躁动不安不能立即进行检查。鉴于目前诊断方法的单一 W及早期发现与预 后判断的困难，我们亟待找到一种比目前现有方法更简单可靠的新方法来鉴定疾病的发生 W及判断病理阶段。尽管已有一些标志物应用于基础研究，如S-100A蛋白、神经元特异性締 醇化酶、降巧素基因相关肤、超敏C反应蛋白和转化生长因子m等，但对缺血性脑卒中诊断 的敏感性及特异性都未尽如人意，因此尚不能推荐任何指标进行常规的临床检测。可W说， 找到一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测标志物已经成为目前临床诊断该类疾病的重中 之重。
[0003] 微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一种短（19-25nt)的非编码的内源性RNA，参 与多种生物学功能。miRNAs表达异常与癌症、神经退行性疾病、屯、血管疾病W及感染性疾病 等的发生密切相关。随着人们认识的深入，miRNAs在临床中的应用越来越广泛。miRNAs在脑 组织中表达存在着时间特异性，可用作临床诊断脑缺血后脑损伤和预后的非常有前景的生 物标记物。研究表明，miRNAs在血清和血浆中也有稳定的表达。有学者报道外周血中的 miRNAs可作为肿瘤及其他疾病诊断的一种新的标志物。缺血性脑卒中患者外周血miRNAs升 高的原因可能是脑缺血坏死组织表达的miRNAs W-定的方式释放入外周血中。因此，选取 缺血性脑卒中患者血清中的miRNAs作为研究对象，通过检测血清miRNA能够解决具体问题。 检测血清miRNAs有W下几个优势：首先，血清较易获得，甚至在平常体检的时候即可收集 到;其次，血清miRNAs反映的是整个机体的生理病理情况，其检测结果具有指导意义;第Ξ， 血清中某些特定的miRNAs可W提示脑组织的病变，可作为疾病诊断的一个指标。总之，检测 血清miRNAs,简单易行且效果显著，从血清miRNAs的特异性变化运一角度发现脑卒中并且 区分类型，将建立一种更敏感、更精确的、早期确诊脑卒中的全新技术。
[0004] 与传统生物标志物相比，血清miRNAs标志物具有稳定、易于检测且定量精确等优 点，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。尽管如此，由于miRNAs种类繁多，迄今为止，经 发现命名的miRNAs多达3100个，难W找到特异的miRNAs,并且血清中的miRNA表达丰度普遍 较低。目前，国内外较少有关于检测血清特异性miRNAs用于缺血性脑卒中临床诊断的报道。 miR-106b位于染色体7q22.1，21nt长。有报道称miR-10化可参与人类淋己瘤、前列腺癌、结 直肠癌、胃癌的发生和进展。迄今为止，人们发现miR-106b-5p可作为癒痛、胃癌等的检测标 '志物（Wan邑 J,Yu JT,Tan L,et al .Genome-wide circulating microRNAexpression profiling indicates biomarkers for epilepsy[J].Sci Rep,2015,5:9522;ShiotaniA, Murao T,Kimura Y,et al. Identification of serummiRNAs as novel non-invasive biom曰rkers for detection ofhigh risk for early gastric c曰ncer[J]. Brit J Cancer，2013,109(9) :2323-2330);然而，还没有将miR-106b-5p用于急性缺血性脑卒中标 志物的报道。
[000引当前针对缺血性脑卒中治疗的研究主要是从神经保护、抗凝、溶栓、增加血流量及 降血压等角度进行。脑卒中临床治疗的一线药物是溶栓药，但溶栓疗法具有治疗时间窗小、 再灌注损伤严重等一系列不足，且其不断被报道存在破坏血脑脊液屏障、增加出血风险、加 剧兴奋性神经毒性等严重不良反应。miRNA是基因表达和蛋白翻译过程中的调节分子，在脑 卒中的发生发展过程中起到调控的枢纽作用。
【发明内容】
[0006] 1.要解决的问题
[0007] 针对现有的脑卒中治疗方法存在治疗时间窗小、破坏血脑脊液屏障等不足之处， 本发明提供了 miR-106b-5p的检测引物和反义核巧酸序列在制备治疗缺血性脑卒中药物中 的应用;本发明发现了 miR-106b-5p的新医药用途，即作为急性缺血性脑卒中的辅助检测指 标，或者针对miR-106b-5p设计干扰片段，直接用于急性缺血性脑卒中的防治。
[000引 2.技术方案
[0009] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0010] miR-106b-5p在制备诊断缺血性脑卒中的试剂盒中的应用。
[001。 miR-106b-5p在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
[0012] 优选地，包括检测miR-106b-5p的检测引物序列，检测引物序列包括逆转录引物的 序列、上游引物序列和下游引物序列;其中，
[0013] 逆转录引物的序列为：5 ' -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCTGCAC- 3 '，上游引物序列为：5 ' -ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTGACAGT-3 '，Taqman巧光探针序列为： 5'-ATCTCAACTGA-3'，下游引物序列为:5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。
[0014] 上述的miR-106b-5p的检测引物序列在制备诊断急性缺血性脑卒中的试剂盒中的 应用。
[001引miR-106b-5p的反义核巧酸序列在制备治疗急性缺血性脑卒中药物中的应用。 [0016]优选地血3-10613-59的反义核巧酸序列为5'-41]抓6〔4抓61〇6〔4抓1]1^-3'。
[0017] 原理:在采用miRNAs忍片技术探究急性缺血性脑卒中患者血清miRNAs表达谱时， 首次意外发现miR-10化-5p在缺血性脑卒中患者外周血清中表达相对升高，由此发明人联 想到miR-106b-5p在缺血性脑卒中患者血清中具体地绝对表达量，是否成为一种新颖而有 效诊断急性缺血性脑卒中的标志物，经过实验发现miR-106b-5p与急性缺血性脑卒中具有 相关性，使其可W成为急性缺血性脑卒中临床检测的辅助指标，为该疾病的防治提供了祀 点。
[001引 3.有益效果
[0019] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0020] (1)本发明首次证明miR-106b-5p与急性缺血性脑卒中的相关性，使其可W成为急 性缺血性脑卒中临床检测的辅助指标，为该疾病的诊断提供了祀点；
[0021 ] (2)本发明分析了大量急性缺血性脑卒中病人与正常人血清中miR-106b-5p的表 达水平，诊断灵敏性和特异性较好，miR-106b-5p的检测引物序列可用于制备诊断急性缺血 性脑卒中的试剂盒；
[0022] (3)本发明首次证明针对miR-106b-5p设计的反义核巧酸序列可有效降低脑缺血 再灌注损伤模型大鼠脑梗死面积，改善神经功能评分，有制备治疗急性缺血性脑卒中药物 的应用价值；
[0023] (4)miR-106b-5p作为脑卒中生物治疗的祀分子比编码基因作为祀分子更加有效， miR-106b-5p干预可W治疗脑卒中，miR-106b-5p可W作为急性缺血性脑卒中的检测指标， 也可作为治疗祀标。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明采用磁珠法分离外周血miRNAs的操作过程示意图；
[0025] 图2为本发明中mi