R-106b-5p在急性缺血性脑卒中和健康对照血清中的含量图，采 用实时巧光定量PCR分析IS (缺血性脑卒中）组(53例）和NC(健康对照）组(50例)血清miR- 106b-5p 含量，林冲 <0.001;
[0026] 图3为本发明中miR-106b-5p对缺血性脑卒中患者的诊断效能，其中，图(A)为血清 miR-106b-5p诊断急性IS患者的R0C曲线分析；图（B)为miR-10化-5p诊断急性IS患者的敏感 性和特异性；
[0027] 图4为本发明中antagomir miR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能 评分的影响(n = 6)冲<0.05;
[0028] 图5为本发明中antagomir miR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面 积(TTC代表图）的影响；
[0029] 图6为本发明中antagomir miR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面 积(核磁共振分析代表图）的影响；
[0030] 图7为本发明中统计学分析antagomir miR-106b-5p对急性脑缺血再灌注损伤大 鼠脑梗死面积的影响。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0032] 实施例1
[0033] miR-106b-5p在急性缺血性脑卒中的诊断价值
[0034] 第一步:急性缺血性脑卒中外周血miRNAs的初步分离：
[0035] 1.急性IS初发患者组:所有患者诊断符合1996年全国第四届脑血管病学术会议修 订的急性脑卒中诊断标准，并同时经头烦CT或MRI检查证实，且发病时间不超过24小时。排 除标准:合并有意识障碍或精神症状;严重的屯、、肝、肾、肺功能不全;有外伤史、手术史;月中 瘤病史。发病24小时内对患者进行空腹血糖、血常规、尿常规、生化全项、糖化血红蛋白、凝 血六项、C反应蛋白检测。另选健康体检者(negative control，NC)作为正常对照组。在采集 样本前均获得患者的知情同意，获伦理委员会批准。
[0036] 2 .标本采集及处理：采集所有入选者外周血标本3mL，在室溫静置30分钟后取 1. OmL上清液，4°C、500g离屯、10分钟；取上清液后4°C、16000g离屯、10分钟，取上清液到新的 离屯、管中。
[0037] 3.血清总RNA提取:血清中总RNA包括miRNA的提取利用磁珠法(上海漫贞秦生物有限 公司）富集，按照试剂盒说明书进行提取（图1)。向10化L血清样本中加入10化lOnM人工合 成线虫39miRNA(cel-lin-39)作为外参，用于标准化提取、反转录及控制后续的定量检测全 过程操作的样本间差异。具体步骤如下：在50化L离屯、管中放置40化振荡混匀后的纳米磁 珠，置于磁力架上数秒待液体澄清后移除液体。加入10化L结合缓冲液振荡混匀，置于磁力 架上数秒待液体澄清后移除液体。加入l(K)yL血清，外加1化Lcel-lin-39,再加入1(Κ)化的结 合缓冲液。振荡混匀磁珠后静置不少于10分钟。将离屯、管置于磁力架上10秒，待磁珠吸附分 离后移除液体。加入1(Κ)化洗涂缓冲液，振荡混匀，低速离屯、，收集挂壁液滴。无需静置，直接 将离屯、管置于磁力架上10秒，待磁珠吸附分离后移除液体，重复洗涂一次。加入30化洗脱缓 冲液I，振荡混匀，低速离屯、收集挂壁液滴。再将离屯、管置于磁力架上10秒，待磁珠吸附分离 后收集液体置新的离屯、管中加入10化洗脱缓冲液II。所收集溶液用于后续实验。利用 Eppendo;rf Biophotometer plus核酸蛋白测定仪（德国lippendorf公司）测定RNA浓度和纯 度。要求总RNA溶液的A260/A280在1.8~2.0范围之内。利用1 %变性琼脂糖凝胶电泳分析总 RNA提取的质量。获得的RNA溶液于-80°C保存备用。
[0038] 第二步:血清miR-106b-5p的定量检测：
[0039] 1 .成熟miR-106b-5p的逆转录反应：应用PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)反转录试剂盒(大连TaKaRa公司），加样在超净工作台中进行。20yL反 应体系女日下：5X PrimeScript Buffer 4yL，PrimeScript RT Enzyme Mix I lyL，miR- 106b-5p特异性逆转录引物lyUSEQ ID N0:1，上海生工），total RNA lyg，RNase Free dd出0补足至20化。逆转录反应使用ABI veriti 96孔热循环仪(美国ABI公司），按仪器使用 说明操作。循环程序设置如下：16°C30分钟;42°C30分钟;85°C5分钟。
[0040] 2.成熟miR-106b-5p的实时定量PCR(Q-PCR)检测:采用定量PCR基因检测分析试剂 盒试剂进行定量PCR检测(上海織i秦生物有限公司）。20化反应体系如下：巧光定量探针法反 应预混液2X Probe Mixture lOyL，模板cDNA化L，20XmiR-106b-5p探针和上下游引物预 混液化L，RNase Free dd出0补足至SOiiLemiR-lOeb-Sp的上游引物序列为（SEQ ID N0:2): 5'-ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTGACAGT-3'，下游引物序列为（SEQ ID N0:4) :5'- TGGTGTCGTGGAGTCG-3'，Taqman巧光探针序列为（SEQ ID N0:3):5'-ATCTCAACTGA-3'，实时 定量PCR反应在扩增区操作，将各管置ABI 7500巧光定量扩增仪(美国ABI公司）中，按仪器 使用说明操作。循环程序设置如下:95°C10分钟;95°C15秒，60°C1分钟45个循环，所有反应 重复Ξ次。
[0041 ] 3.成熟miR-10化-5p结果分析:采用SDS software version 2.0软件处理。分析条 件设置：根据分析后图像调节Base line的start值、stop值W及Threshold的Value值，在 analysis菜单下选择analyze自动分析结果。人工合成单链miR-106b-5p标准品由上海 GenePharm公司提供，经十倍梯度稀释，浓度分别为lOfmol/L，102fmol/L，Ipmol/L，lOpmol/ L，102pmol/L，103pmol/L，根据浓度对数数值与Ct值制作标准曲线，计算血清miR-10化-5p的 绝对含量(图2)。
[0042] 第Ξ步:血清miR-106b-5p对IS患者诊断的敏感性和特异性：
[0043] 通过绘制受试者操作特征工作曲线(R0C)分析血清miR-10化-5p绝对表达量在缺 血性脑卒中诊断中的敏感性和特异性。结果发现，miR-106b-5p曲线下面积R0C为0.7773。当 临界值为40扯〇1几，11111?-10613-59诊断缺血性脑卒中的敏感性和特异性分别为79.25%和 64.71%。血清miR-106b-5p表达水平的检测灵敏度> lOfmol/L，线性范围为lOfmol/L~IX 103pmol/L(图3)。运些结果提示采用实时巧光定量PCR检测血清miR-10化-5p的绝对表达 量，作为缺血性脑卒中的生物标志物的检测有一定的准确性和可行性。运为高效准确诊断 急性IS提供了一定的指导意义。
[0044] 实施例2
[004引 miR-106b-5p的反义核巧酸antagomir miR-106b-5p对局灶性脑缺血再灌注损伤 的神经保护效应：
[0046] 1.实验动物分组及处理:SPF级（指无特定病原体级实验动物)8-10周龄雄性SD大 鼠（北京维通利华公司提供），体重(280-330g)。实验分组:总计4组，每组6只，总计需要大鼠 24只。（1)假手术组:仅分离血管和神经，不插入线栓。（2)MCA0模型未治疗组:大鼠建模成功 后，不给予任何干预。（3)antagomir miR-106b-5p治疗组：在再灌注开始前尾静脉注射 antagomir miR-106b-5p 50nmol/kg〇antagomir miR-106b-5p序列为（SEQ ID N0:5):5'- AUCUGCACUGUCAGC ACUUUA-3'，此处为m