17－去甲基雷帕霉素及其类似物、它们的制备方法和它们作为免疫抑制剂、抗癌剂、抗真...的制作方法

专利名称：17－去甲基雷帕霉素及其类似物、它们的制备方法和它们作为免疫抑制剂、抗癌剂、抗真 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚酮化合物和其他天然产物的生产，并且涉及化合物文库和单个的新型化合物。因此，一方面，本发明提供了17-去甲基雷帕霉素(17-demethylrapamycin)及其类似物，它们的生产方法，包括重组菌株，以及本发明的化合物的分离和用途。另一方面，本发明提供了这些新的17-去甲基雷帕霉素类似物在诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维变性疾病，和调控伤口愈合中的用途。在具体实施方案中，本发明提供了用于控制雷帕霉素的生产的生物合成基因的工程化的方法，以便制备能产生17-去甲基雷帕霉素及其类似物的工程菌株。本发明还涉及通过将非天然启动酸(non-natural starter acid)供给所述菌株制备17-去甲基雷帕霉素类似物文库的方法，以及由此生产的化合物的文库，并涉及衍生菌株的产生，其中表达克隆的基因或基因盒，以便产生其他类似物，并且以便加工用于它们的制备，并且涉及其中所使用的工具(例如，核酸，载体，基因盒和遗传修饰菌株)。
背景技术：
雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(图1)由吸湿链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491生产的亲脂性大环内酯(Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)，其具有连接在六氢哌啶羧酸内酯(pipecolic acid lactone)上的1，2，3-三羰基部分(Paiva等，1991)。其他相关的大环内酯(图2)包括FK506(他克莫司(tacrolimus))(Schreiber and Crabtree，1992)，FK520(子囊霉素(ascomycin)或免疫霉素(immunomycin))(Wu等，2000)，FK525(Hatanaka H，等，1989)，FK523(Hatanaka，H.，等，1988)，antascomicins(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)。对于本发明来说，雷帕霉素是首先通过McAlpine等(1991)的编号规定，然后通过Findlay等(1980)或化学文摘(Chemical Abstracts)(11th累积索引(Cumulative Index)，1982-1986p60719CS)的编号规定进行说明。
雷帕霉素的聚酮化合物主链是通过一共七个丙酸和七个乙酸单元与莽草酸衍生的环己烷羧酸起始单元从头到尾稠合(heat-to-tail condensation)产生的(Paiva等，1991)。L-赖氨酸衍生的氨基酸，六氢吡啶羧酸通过酰胺键稠合在聚酮化合物主链的最后一个乙酸上(Paiva等，1993)，然后通过内酯化作用形成所述大环。已经对包括所述生物合成基因簇的107kb基因组区进行了测序(Schwecke等，1995)。分析所述开放读框发现了编码模块聚酮化合物合酶(PKS)的三个大基因(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。包埋在PKS基因之间的是编码蛋白的rapP基因，所述蛋白与非核糖体肽合成酶的激活结构域具有序列相似性，并且被认为起着类似作用(Knig等，1997)。在编码PKS基因的区域的两侧有24个额外的开放读框，它们所编码的酶被认为是雷帕霉素生物合成所必需的(Molnar等，1996)。其中包括以下聚酮化合物后修饰酶两种细胞色素P-450单加氧酶，称为RapJ和RapN，和相关的铁氧化还原蛋白RapO，以及三种SAM-依赖型O-甲基转移酶RapI，RapM和RapQ。其他相邻的基因在雷帕霉素的调控和输出方面具有推定的作用(Molnar等，1996)。所述基因簇还包括基因rapL，它的产物RapL被认为能通过L-赖氨酸的环脱氨作用催化雷帕霉素前体L-甲基哌啶的形成(Khaw等，1998；Paiva等，1993)。
雷帕霉素的聚酮化合物核心是通过非常大的，多功能蛋白组装的，包括I型聚酮化合物合酶(rap PKS)。该多肽复合物包括加载模块(loading module)和十四个延伸模块(extension module)，每一个模块负责将特异性酰基-CoA前体添加到生长中的聚酮化合物链上，并且负责β-酮羰基的还原程度。每一个模块进行若干种生物化学反应，这些反应是由所述多肽的特定的结构域执行的。所有延伸模块包括酰基转移酶(AT)结构域，它从前体上选择酰基并且将它提供给酰基载体蛋白(ACP)结构域，以及β-酮合酶(KS)结构域，其通过脱羧稠合作用将预先存在的聚酮化合物链添加到新的酰基-ACP上。在某些延伸模块上存在其他结构域β-酮还原酶(KR)结构域，它将β-酮基还原成羟基，脱水酶(DH)结构域，它作用于羟基以形成双键，以及烯酰还原酶(enoyl reductase)(ER)结构域，它还原双键以形成饱和的碳。可预测模块3和6中存在的β-酮加工结构域是无活性的，因为这些结构域的作用没有体现在最终结构上。最终的延伸模块(延伸模块14)似乎不包括任何β-酮-加工结构域。雷帕霉素生物合成的启动是通过4，5-二羟基环己-1-烯羧酸的并入(incorporation)进行的，后者是由莽草酸途径衍生的(Lowden，P.A.S.，等2001)，并且是其他FKBP-结合分子诸如FK506和FK520所共有的(common)(图2)。在聚酮化合物的生物合成之后，由rapP编码的NRPS模块结合了六氢吡啶羧酸(L-赖氨酸衍生的)，它通过酰胺键稠合在聚酮化合物主链的最后一个乙酸上(Paiva等，1993)。随后通过内酯化作用形成大环。
三种雷帕霉素PKS基因、NRPS-编码基因和侧翼晚期基因(flanking lategene)序列的每一种的核苷酸序列以及相应的多肽在Aparicio等，1996，和Schwecke等，1995中鉴定，并且由NCBI以保藏号X86780保藏，对该序列的修正最近已经在WO 04/007709中公开。
雷帕霉素生物合成基因簇的第一种无酶产物已经被命名为前-雷帕霉素(WO 04/007709，Gregory等，2004)。全面加工过的雷帕霉素的生产需要通过由雷帕霉素晚期基因所编码的酶，RapJ，RapN，RapO，RapM，RapQ和RapI对聚酮化合物/NRPS核心进行额外加工。
雷帕霉素具有重要的药理学价值，因为该化合物表现出宽的活性光谱；这强调了制备所述药物的新型类似物的必要性。雷帕霉素表现出中等抗真菌活性，主要是抗念珠菌属(Candida)的菌种，不过还能抗丝状真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)。雷帕霉素通过靶向多种细胞类型中的信号传导途径，例如，通过抑制使细胞周期从G1期发展到S-期的信号传导途径来抑制细胞增殖(Kuo等，1992)。在T细胞中，雷帕霉素抑制来自IL-2受体的信号传导和随后的导致免疫抑制的T细胞自发增殖。雷帕霉素的抑制作用并不局限于T细胞，因为雷帕霉素能抑制多种哺乳动物细胞类型的增殖(Brunn等，1996)。因此，雷帕霉素是有效的免疫抑制剂，在预防器官同种异体移植排斥和治疗自身免疫疾病方面具有已经确定的或推测的治疗应用(Kahan等，1991)。40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，Certican，everolimus)是半合成的雷帕霉素类似物，它表现出免疫抑制药理学作用(Sedrani，R.等，1998；Kirchner等，2000；U.S.5,665,772)。该药物于2003年在欧洲获得批准，并且预计不久将在美国上市。雷帕霉素酯CCI-779(Wyeth-Ayerst)在体外抑制细胞生长，并且在体内抑制肿瘤生长(Yu等，2001)。CCI-779目前正处在第III阶段临床试验。雷帕霉素在治疗慢性斑块性银屑病方面的价值(Kirby and Griffiths，2001)，在诸如刺激PC12细胞的神经突长出方面的潜在用途(Lyons等，1994)，在机械损伤之后通过血管和平滑肌细胞阻断对细胞因子的增殖响应(Gregory等，1993)，以及它在预防同种异体移植纤维化方面的作用(Waller and Nicholson，2001)是强化研究的领域(Kahan and Camardo，2001)。最近的报导揭示了雷帕霉素与进行长期免疫抑制治疗的器官同种异体移植患者与进行其他免疫抑制方案的患者相比较低的癌症发病率相关，并且这种降低的癌症发病率归因于抑制了血管生成(Guba等，2002)。已报导亲免素(immunophilin)配体的神经营养活性独立于它们的免疫抑制活性(Steiner等，1997)，并且神经生长刺激作用通过成熟类固醇受体复合物的破坏而得到促进，正如在专利申请WO01/03692中所概括的。已经报导了诸如高脂血症和血小板减少症以及潜在的致畸效应的副作用(Hentges等，2001；Kahan and Camardo，2001)。
在高等真核生物中，雷帕霉素通过抑制p70S6k激酶，一种丝氨酸/苏氨酸激酶来影响细胞内的信号传导级联反应，所述酶使核糖体蛋白S6磷酸化(Ferrari等，1993；Kuo等，1992)。S6蛋白位于核糖体40S亚基中，并且据信是与tRNA和mRNA结合相关的重要功能位点。已经推测了由p70S6k通过S6磷酸化作用对mRNA翻译产生的调控作用(Kawasome等，1998)。雷帕霉素通过它对其他生长相关事件的影响来抑制蛋白合成，包括细胞周期蛋白-依赖性激酶活性，cAMP-响应元件调节子(CREM)的磷酸化，和伸长因子结合蛋白4E-BP1(PHAS1)的磷酸化(Hung等，1996)。所述药物诱导与翻译起始因子elF-4E结合的4E-BP1的脱磷酸化种类的积累，因此，抑制cap-依赖性rRNAs的翻译起始(Hara等，1997；Raught等，2001)。
迄今为止所表征的雷帕霉素的药理学作用据信是通过与被称为FKBP或亲免素的细胞液受体的相互作用介导的。亲免素(该术语用于表示免疫抑制剂结合蛋白)催化顺式和反式肽酰-脯氨酸键的异构化，并且属于存在于多种生物中的酶的高度保守的家族(Rosen and Schreiber，1992)。FKBP和亲环素表示两大类属于亲免素家族的酶(Schreiber and Crabtree，1992)。真核T-细胞中的主要细胞内雷帕霉素受体是FKBP12(DiLeIIa and Craig，1991)，并且所得到的复合物特异性地与靶蛋白相互作用，以抑制细胞的信号转导级联反应。对FKBP12-雷帕霉素复合物的晶体结构进行分析，已经鉴定了称作′结合结构域′的雷帕霉素-结合药效团(pharcophore)(Van Duyne等，1993)(参见图1)。′结合结构域′是与亲免素相互作用所需要的，并且由包括酯键，六氢吡啶羧酸-衍生的环，二羰基(dicarbonyl)和半酮缩醇环(hemiketal ring)的C-1至C-14区组成。所述相互作用的特征是，很多疏水性接触，以及一些氢键，包括与环己烷环上的羟基结合的氢键。所述哌可啉基(pipecolinyl)环(C2-N7)穿入蛋白最深，其中，它周围是高度保守的内衬疏水结合腔(binding cavity)的芳族氨基酸残基。C1和C8羰基都参与了氢键结合，而C9羰基突出进入由FKBP12中三个完全保守的芳族氨基酸残基(一个酪氨酸和两个苯丙氨酸残基)形成的凹穴(pocket)。与靶蛋白相互作用的亲免素-配体复合物的结构域从FKBP上突出。
大部分亲免素都没有表现出直接与免疫抑制活性相关，并且对有关它们的天然配体的了解相对较少，尽管已经报导了被称为FKBP-相关蛋白(FAP)的FKBP的天然配体的候选物，如FAP48和FAP1。在形成复合物期间FAP与FKBP之间的特异性相互作用以剂量依赖性方式受到了雷帕霉素的抑制(Chambraud等，1996；Kunz等，2000)。亲免素似乎在多种细胞活性中起作用，例如蛋白折叠；蛋白的组装和运输；分子复合物包括热休克蛋白的共调节；类固醇受体；离子通道；细胞-细胞相互作用和基因的转录和翻译(Galat2000；Hamilton and Steiner 1998)。所有亲免素都具备肽酰-脯氨酰顺-反异构作用的蛋白折叠特性，并且发现，若干亲免素位于内质网中，它是细胞中蛋白合成的主要位点。除了FKBP12(U.S.5,109,112)之外，其他亲免素包括FKBP12.6(U.S.5,457,182)，FKBP13(Hendrickson等，1993；U.S.5,498,597)，FKBP25(Hung and Schreiber，1992；Jin等，1992)，FKBP14.6(U.S.5,354,845)，FKBP52(U.S.5,763,590)，FKBP60(Yem等，1992)和FKBP65(Patterson等，2000)。
已经在酵母中鉴定了雷帕霉素-FKBP12复合物的靶物，称为TOR(雷帕霉素的靶物)(Alarcon等，1999)，并且将哺乳动物蛋白称作FRAP(FKBP-雷帕霉素相关蛋白)或mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶物)(Brown等，1994)。所述蛋白显示与磷脂酰肌醇3-激酶的磷酸转移酶结构域的显著相似性，并且发现mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合结构域(FRB)中的点突变破坏mTOR激酶活性，这提供了FRB参与激酶结构域功能的证据(Vilella-Bach等，1999)。已经获得了具有包括FRB结构域的mTOR截短形式的FKBP12-雷帕霉素的晶体结构(Chen等，1995)，因此定义了雷帕霉素的′效应子′结构域(Choi等，1996；Liang等，1999)。对晶体结构进行的分析发现与雷帕霉素和每个蛋白之间的相互作用相比，蛋白-蛋白接触是比较有限的。没有发现雷帕霉素和FRB之间的氢键。相互作用集中在雷帕霉素的三烯区和FRB的主要芳族残基之间的一系列疏水性接触上(Liang等，1999)。雷帕霉素嵌入最深的原子是结合在C23上的甲基(参见图1)。雷帕霉素的C23-C34区和环己基环形成了与FRB的疏水性接触。在二元和三元络合物之间存在雷帕霉素的小的构象变化是明显的(Liang等，1999)。
检测到了在C16甲氧基上修饰过的雷帕霉素类似物的生物学效应和它们结合FKBP12的能力之间的趋异性(divergence)，并且推测了C16取代基在FKBP12和mTOR之间的界面空间中的位置(Luengo等，1995)。具有非-免疫抑制28-O-甲基雷帕霉素的FKBP12的晶体结构分析，揭示了环己基环的取向的重大差异，它可能导致mTOR结合的破坏(Kallen等，1996)。
已经描述了mTOR信号传导和神经元中的定位蛋白合成之间的联系；它对参与翻译控制的蛋白磷酸化状态的影响；翻译机构(translation machinery)的成分在转录和翻译水平上的丰度；氨基酸透性酶活性的控制，以及参与代谢途径的多种酶的转录调节(Raught等，2001)。雷帕霉素敏感型信号传导途径似乎还在胚胎大脑发育，学习和记忆形成方面发挥重要作用(Tang等，2002)。在酵母中对TOR蛋白的研究也已发现了它们在调节营养物敏感型信号传导途径中的作用(Hardwick等，1999)。类似地，已将mTOR鉴定为蛋白激酶B(akt)作用的直接靶物，并且在胰岛素信号传导中起着关键作用(Shepherd等，1998；Navé等，1999)。也已将哺乳动物TOR与肌动蛋白细胞骨骼的极化和翻译起始的调控相关(Alarcon等，1999)。磷脂酰肌醇3-激酶，如mTOR，在肿瘤病理学的若干方面起作用，如细胞-周期进展，粘附，细胞存活和血管生成(Roymans and Siegers，2001)。
存在于不同细胞类型中的多种FKBP还强调分离具有潜在改变的结合和/或效应子结构域的新型FKBP-配体类似物的效用。例如，正是旋转异构酶FKBP52的抑制作用，形成了类固醇受体复合物的一部分，这已经被确认为雷帕霉素类似物(以及其他结合FKBP12的化合物)调节神经再生和神经突长出的机制(WO 01/03692)。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物的药物动力学研究已经证实需要开发新型雷帕霉素化合物，该化合物在溶液中更稳定，具有更高的对于代谢攻击(metabolic attack)的抗性和/或具有改善的生物利用率。利用化学可利用位点修饰雷帕霉素已经进行过广泛的研究(参见下文)。不过，该方法局限于可用于化学修饰的少数部位，并且进一步受到它的效用的限制，因为在分子上存在其他反应性位点的情况下难于对特定位置进行选择性修饰。
已经报导了利用所述分子的化学可利用位点的多种合成的雷帕霉素类似物。以下化合物的说明适合图1所示的雷帕霉素分子的编号系统。所述分子上的可用于衍生化或置换的化学可利用位点包括C40和C28羟基(例如，U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)，C39和C16甲氧基(例如，WO 96/41807；U.S.5,728,710)，C32，C26和C9酮基(例如，U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)。在C17，C19和/或C21上的氢化，对三烯的靶向，导致了抗真菌活性的保留，不过相对损失了免疫抑制作用(例如，U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)。通过衍生化已经获得了所述分子稳定性(例如，在C32，C40和/或C28上形成肟，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048)，对代谢攻击的抗性(例如，U.S.5,912,253)，生物利用率(例如，U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO98/04279)和药物前体(prodrug)产生(例如，U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)的显著改善。然而，化学修饰需要大量的雷帕霉素模板，并且，作为碱性和酸性不稳定化合物，它是难于处理的。由于化学衍生化可以是组选择性的，它通常难于是位点选择性的。因此，化学修饰通常需要多个保护和脱保护步骤，并且能够以可变的产量产生混合产物。
生产新型雷帕霉素类似物的生物学方法最初是缓慢生产的，因为在用生产生物的操作(working)中遇到难题(Lomovskaya等，1997；Kieser等，2000)，尽管可以利用来自吸湿链霉菌的雷帕霉素的生物合成基因簇的序列(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。本发明人的最近的专利申请描述了通过操作后PKS修饰基因获得的比以前通过修饰雷帕霉素生物合成途径所能获得的更宽范围的雷帕霉素类似物(WO 04/007709)。通过用其他物质取代整合到雷帕霉素结构中的雷帕霉素PKS的天然启动酸还可以获得其他类似物(WO04/007709)。尽管上述方法提供了接近雷帕霉素分子周围的明显更多的化学空间的途径，该技术不能允许修饰由I型聚酮化合物合酶基因编码的雷帕霉素分子的核心构架。
也已经描述了利用诸如生物转化和基于噬菌体的遗传学修饰的其他生物学方法分离雷帕霉素类似物。从突变菌株和生产雷帕霉素的菌株中分离次要(minor)代谢物，已经提供了少量雷帕霉素类似物。这些菌株通常是低产量的，并且产生雷帕霉素类似物的混合物。报导了从吸湿链霉菌NCIMB 40319的培养上清液中分离27-O-去甲基雷帕霉素和27-去甲氧基雷帕霉素(Box等，1995)。27-O-去甲基雷帕霉素的抗真菌活性比雷帕霉素的活性低，不过，FKBP12 PPIase活性的抑制似乎提高了。与雷帕霉素相比，ConA-刺激的鼠脾T细胞增殖的抑制和LPS-刺激的鼠脾B细胞增殖的抑制减弱了(Box等，1995)。类似地，雷帕霉素类似物脯氨酰雷帕霉素，27-O-去甲基雷帕霉素和27-去甲氧基雷帕霉素的抗真菌活性(雷帕霉素分子的编号系统如图1所示)低于雷帕霉素的抗真菌活性(Wong等，1998)。在向培养物中添加细胞色素P450抑制剂和/或前体之后或在对分离的雷帕霉素进行生物转化之后，还从游动放线菌属(Actinoplanes)的菌种N902-109中分离了雷帕霉素类似物(16-O-去甲基雷帕霉素，27-O-去甲基雷帕霉素，39-O-去甲基雷帕霉素，16，27-O-双去甲基雷帕霉素，脯氨酰雷帕霉素，26-O-去甲基脯氨酰雷帕霉素，9-脱氧雷帕霉素，27-去甲氧基雷帕霉素，27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素，9-脱氧-27-去甲氧基雷帕霉素，28-脱氢雷帕霉素，9-脱氧-27-去甲氧基-39-O-去甲基雷帕霉素)(Nishida等，1995)。不过，所述抑制剂的使用只允许靶向特定的酶功能，并且不是位点选择性的，因此通常能得到产物混合物。通过这种方法不可能合理地生产单一选择的类似物。所得到的雷帕霉素类似物混合物的生产而不是单一的所需产物的生产，还影响了产率。评估了所述化合物的混合淋巴细胞反应(MLR)抑制活性，并且在失去C27或/和C16上的甲基之后几乎检测不到对所述活性的影响。观察到9-脱氧雷帕霉素活性的更显著的降低；另外，C27上的甲氧基，C28上的羟基的失去，以及用脯氨酰取代六氢吡啶羧酸-衍生的基团，都导致了效力的减弱(Nishida等，1995)。类似地，已经报导了雷帕霉素的生物转化和16，39-O-双去甲基雷帕霉素的分离(WO 94/09010)。使用在环己基环上修饰过的化合物，例如39-O-去甲基雷帕霉素和C40修饰，如SDZRAD和CCI-779进行的细胞增殖试验中一些抑制活性的保留，，确定了所述分子的该区域是制备具有免疫抑制和抗癌特性的新型雷帕霉素类似物的目标。
已经报导了在向生产雷帕霉素的野生型吸湿链霉菌的培养物中添加环己烷羧酸，环庚烷羧酸，环己-1-烯羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环己-3-烯羧酸，3-羟基环己-4-烯羧酸和环庚-1-烯羧酸之后，产生了新型雷帕霉素类似物，因此说明了雷帕霉素聚酮化合物合酶的加载模块中的灵活性(PAS.Lowden，Ph.D dissertation，University of Cambridge，1997；Lowden等，2004)。这些新型雷帕霉素类似物是以与天然起始物4，5-二羟基环己-1-烯羧酸竞争中产生的，导致了较低的产量和混合的产物。
通过将(±)哌啶甲酸添加到生产雷帕霉素的吸湿链霉菌NRRL5491中，来抑制L-六氢吡啶羧酸产生，并且同时添加含硫哌可酸盐(pipecolate)类似物(S)-1，4-噻嗪烷-3羧酸或(S)-1，4-噻嗪烷-4羧酸从而分离了雷帕霉素的两种新型含硫雷帕霉素类似物(Graziani等，2003)。
已经报导了采用噬菌体技术介导的方法分离两种重组吸湿链霉菌菌株，所述菌株产生各种雷帕霉素类似物(Lomovskaya等，1997)。在存在添加的脯氨酸类似物的条件下，吸湿链霉菌rapL缺失突变体合成了新型雷帕霉素类似物脯氨酰雷帕霉素、4-羟基脯氨酰雷帕霉素和4-羟基脯氨酰-26-去甲氧基-雷帕霉素(Khaw等，1998)。类似地，新型雷帕霉素3-羟基-脯氨酰-雷帕霉素、3-羟基-脯氨酰-26-去甲氧基-雷帕霉素和反式-3-氮杂-二环[3，1，0]己烷-2-羧酸雷帕霉素已经从相同突变菌株的补料培养物中鉴定，如WO 98/54308中所述。在增殖试验中评估了脯氨酰雷帕霉素和4-羟基脯氨酰-26-去甲氧基-雷帕霉素的活性，并且，后一种化合物的抑制活性明显比雷帕霉素的抑制活性低(Khaw等，1998)。五个连续基因，rapQONML的缺失(负责C16，C27处的后-聚酮化合物修饰，和L-六氢吡啶羧酸的生产)以及利用基于噬菌体的方法用吸湿链霉菌ATCC29253上的新霉素抗性标记取代它们，导致了在补加六氢吡啶羧酸时产生16-O-去甲基-27-去甲氧基雷帕霉素(Chung等，2001)。没有证实该缺失突变体的补偿作用(complementation)。另外，在这项研究中没有确定rapM或rapQ的位点特异性；因此，Chung等(2001)没有实现需要在C16-OH或C27-OH的甲基化的雷帕霉素类似物的合理设计。所述基于噬菌体的方法存在多种缺陷，正如在下面更详细地披露的，例如，自基因序列的公开九年时间中报道的仅仅三株重组吸湿链霉菌菌株。它存在获得工程菌株的困难的和持久的过程，并且与本发明人较早申请中披露的方法(WO 04/007709)相比在实用方面受到显著制约。
使用生物学方法操作雷帕霉素修饰基因的常规途径包括在宿主菌株的染色体中单个基因的突变或缺失或/和单独地或作为基因盒插入单个基因作为同源或异源基因的额外拷贝(WO 01/79520，WO 03/048375)。然而，使用所述生物学方法分离新型雷帕霉素类似物由于难于转化生产雷帕霉素的生物体吸湿链霉菌而受到限制。已经报导了用质粒DNA转化的常用方法或或接合转移用于生产雷帕霉素的菌株是不成功的(Lomovskya等，1997，Schwecke等，1995，Kieser等，2000)。在WO 04/007709之前的现有技术的状态使用Lomovskya等(1997)的方法，这是一种基于噬菌体的劳动力密集型方法，它受到了转入吸湿链霉菌中的克隆的DNA片段大小的严重限制(Kieser等，2000)。该技术受限于转移最大约为6.4kbp的克隆DNA。因此，在利用该技术补偿缺失突变体时，技术人员受限于采用该大小极限内的遗传材料，例如，除需要的启动子，同源性区(如果需要的话)和抗性标记外，补偿局限于两种典型的功能基因(其大小通常各为大约1kbp)。WO 04/007709首次公开了用于有效转化诸如吸湿链霉菌吸湿亚种NRRL5491的菌株的重组技术方法，该菌株包括雷帕霉素生物合成基因簇。在此之前，尽管从1995年雷帕霉素生物合成基因簇的遗传信息就已经是可用的(Schwecke等，1995)，但迄今为止，在该领域所取得的进展有限(Khaw等，1998；Chung等，2001；WO 01/34816)。WO 04/007709描述了通过补偿缺失突变体操纵雷帕霉素生物合成途径并且生产多种雷帕霉素类似物的方法，其中，后-PKS加工的量是特异性变化的，并且可选择地向菌株中加入外源启动酸，在该菌株中，至少rapK已经缺失或失活。
以前的研究已经证实，聚酮化合物合酶(PKS)基因原则上可以进行操作，以便提供新型聚酮化合物。这些改变包括●缺失已经显示红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)中的生产红霉素的(ery)PKS的模块5的KR结构域的DNA编码部分的框内缺失导致了红霉素类似物的形成，即5，6-双脱氧-3-α-碳霉糖基-5-氧红霉内酯B(5，6-dideoxy-3-α-mycarosyl-5-oxoerythronolide B)和5，6-双脱氧-5-氧红霉内酯B(5，6-dideoxy-5-oxoerythronolide B)(Donadio等，1991)。
●单个结构域的失活通过对相应的编码PKS的DNA进行遗传工程改造并且将它导入红色糖多孢菌，改变ery PKS的模块4上的ER结构域的活性位点残基，导致了6，7-脱水红霉素C的产生(Donadio等，1993)。
●加载模块交换WO 98/01546公开了用来自除虫菌素(avermectin)(ave)PKS的加载模块取代ery PKS的加载模块，以便产生杂合体I型PKS基因，其整合了不同的起始单位，以便制备新型红霉素类似物。制备了杂合的tylactone加载/platenolide聚酮化合物合酶(Kuhstoss等，1996)，其将甲基丙二酰-CoA的tylactone加载模块的特异性成功地转移到platenolide分子上。在WO00/00618中公开了KSQ功能的说明(Bisang等，1999)以及含有KSQ的加载模块的操作。也已经在WO 03/070908中描述了棘甙(spinosyn)生物合成途径中的加载模块交换。
●AT交换Oliynyk等，(1996)和WO 98/01546描述了AT结构域交换，其中红霉素模块1AT被雷帕霉素模块2的AT结构域取代并相应改变了延长单位(extender unit)的模块1的特异性。例如，已经描述了红霉素聚酮化合物合酶(WO 98/01546，Ruan等，1997；Stassi等，1998)和棘甙聚酮化合物合酶(WO03/070908)中的其他AT结构域交换。
●还原性环交换例如，在WO 98/01546，WO 00/01827和Kao等，(1997)中描述了在每一次缩合期间形成的β-酮基的还原处理量的改变。
●结构域交换方法的组合在McDaniel等，(1999)中举例说明。
●定点诱变WO 02/14482，Reeves等，(2001)，Reid等，(2003)和Del Vecchio等，(2003)证实了可以通过特定残基的选择的诱变影响AT结构域的底物特异性。
●环缩作用例如，使用不完整的模块聚酮化合物合酶(Kao等1994)，或移动红霉素PKS的模块1，2，3，5或6的红霉素链终止硫酯酶结构域下游(Cortés等，1995；Kao等，1995；Kao等，1996；Bhm等，1998)，导致了预期的截短的红霉素分子的产生。
●环扩大将雷帕霉素模块插入红霉素PKS模块1和2之间的红霉素PKS的第一个ORF，导致了预期的16-员大环内酯的产生(Rowe等，2001)。
PKS簇的修饰并不局限于上文所述。
不过，已经发现，并非PKS基因的所有操作都能产生预期的新型类似物。当Donadio等(1993)使红霉素PKS的烯酰还原酶(ER)结构域失活时，所得到的脱水-类似物不能完全加工，因为它不再是碳霉糖-O-甲基转移酶的底物。类似地，改变聚酮化合物起始单位，在地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)中阻止了利福霉素(rifamycin)类似物的完整的延伸以及加工(Hunziker等，1998)。
如果雷帕霉素类似物可以通过对生物合成簇中的聚酮化合物合酶基因进行工程改造来制备，它们将是非常理想的，因为推测它们具有令人感兴趣的生物学活性。
雷帕霉素生物合成簇的序列首先于1995年公开(Schwecke等；Aparicio等，1996)。尽管有大量上述有关PKS操作的现有技术，迄今为止还没有报导雷帕霉素簇的核心聚酮化合物合酶的成功的聚酮化合物工程改造。雷帕霉素的生产菌吸湿链霉菌，是难于操作的生物(Lomovskaya等，1997)。
在US 6,670,168中要求了被修饰以产生17-去甲基雷帕霉素的宿主细胞，不过，该专利缺少如何制备该化合物的任何说明或工作实施例，只是假设这种菌株可以通过取代模块10的AT结构域来构建。假设在该位置上的取代可以导致17-去甲基雷帕霉素的事实对任何本领域技术人员来说是显而易见的，但考虑到上文所强调的困难，如何进行这种取代并非显而易见，并且在US6,670,168中没有提供对这种作用的教导。鉴于用吸湿链霉菌操作的公知困难，以及缺少如何制备这种重组宿主菌株的详细说明，显然只是对这些作者所希望取得的进行了描述，而未能披露所述菌株。另外，US 6,670,168没有为本领域技术人员提供有关如何制备或分离17-去甲基雷帕霉素的任何教导。有关雷帕霉素类似物的生物合成的技术状态局限于WO 04/007709，其中对编码后PKS修饰酶的基因进行操作，以及描述添加外源启动酸用于整合到雷帕霉素中的相关申请。在对雷帕霉素的PKS进行工程改造方面的进展的总体性缺乏是由于转化生产生物吸湿链霉菌NRRL5491的技术难度造成的。
本发明涉及17-去甲基雷帕霉素及其类似物的制备。获得17-去甲基雷帕霉素类似物需要对雷帕霉素PKS进行工程改造。在该技术的当前状态中并非显而易见的是，可以完成产生所述菌株所需要的工程改造。在本发明中，最初的目标是对吸湿链霉菌MG2-10进行工程改造。当如WO 04/007709和Gregory等(2004)所公开的添加外源酸3，4-二羟基环己烷羧酸时，吸湿链霉菌MG2-10能产生前-雷帕霉素。对该生物体进行了工程改造，以制备工程菌株，在添加外源酸3，4-二羟基环己烷羧酸时，该菌株能产生17-去甲基前-雷帕霉素。技术的当前状态教导了如何将该菌株作为通过晚期基因盒(late gene cassette)进行互补的基础菌株(WO 04/007709)和/或作为添加外源酸(WO 04/007709)并产生其他雷帕霉素类似物的基础菌株用于其他实验，但是没有教导如何通过PKS工程改造用吸湿链霉菌制备这种菌株。令人惊讶地，与Oliynyk等，1996所描述的技术类似，本发明描述了可将PKS工程改造方法成功地应用于雷帕霉素PKS。这一结果是出乎预料的，因为上述重组DNA技术以前从未成功地应用于吸湿链霉菌。生产17-去甲基前-雷帕霉素类似物的菌株的制备，是通过晚期基因框进行互补的有用的基础菌株(WO 04/007709)和/或作为添加外源酸的基础菌株(WO 04/007709)。上述每一种雷帕霉素类似物然后可以通过半合成进一步修饰。这是一种真正的组合方法的首次验证，该方法可用于制备雷帕霉素类似物文库，它可以在下列一种或多种进行改变PKS工程改造水平，辅助基因水平，启动酸掺入，氨基酸掺入，以及该分子上的可接触的化学官能度，对于半合成方法来说这些功能度仍然是可以接触的。

发明内容
一方面，本发明提供了17-去甲基雷帕霉素及其类似物，具体地讲，本发明提供了根据下式的17-去甲基雷帕霉素类似物 其中x表示直接键，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-X-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示选自下组的结构片段A，B，C，D，E和F，
其中波形线表示片段结合位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，卤基，硫醇或C1-4烷基；或R4可替换地表示5-至7-员杂环，其包括选自下组的一个或多个杂原子O，S和N，所述杂环是用选自C1-4烷基，OH，F和Cl的一个或多个取代基任选取代的；和R5和R6各自独立地为H或OH，或其可以药用的衍生物。
另一方面，本发明提供了用本发明方法制备的17-去甲基雷帕霉素类似物的文库。
所述新型雷帕霉素类似物是直接使用的，以及作为模板用于其他半合成或生物转化，来产生化合物，该化合物可用作免疫抑制剂，抗真菌剂，抗癌剂，抗炎剂，神经再生剂或用于治疗移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，血管疾病和纤维变性疾病的试剂或用于调控伤口愈合的试剂。
另一方面，本发明提供了将17-去甲基雷帕霉素或其类似物用于医药的用途。另一方面，本发明提供了将17-去甲基雷帕霉素或其类似物用于制备药物的用途，所述药物用于诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或癌症治疗，B-细胞恶性肿瘤，真菌感染，移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，炎性疾病，血管疾病或纤维变性疾病，或用于调控伤口愈合。
在一种实施方案中，17-去甲基雷帕霉素或其类似物被用于组合治疗，所述组合治疗用于诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或癌症治疗，B-细胞恶性肿瘤，真菌感染，移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，炎性疾病，血管疾病或纤维变性疾病，或用于调控伤口愈合。
本发明还提供了药物组合物，其包括17-去甲基雷帕霉素或其类似物，或可以药用的盐连同可以药用的载体。
另一方面，本发明还提供了用于生产17-去甲基雷帕霉素或其类似物的方法，所述方法包括(a)用丙二酰-CoA-特异性AT结构域取代雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域，(b)在合适的宿主细胞中表达工程改造的雷帕霉素PKS，
(c)在能产生17-去甲基雷帕霉素或其类似物，包括选择性地提供外源前体的条件下，培养所述宿主细胞，(d)任选地分离由此产生的化合物。
在优选实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素(monensin)，spinosyn，FK506，红霉素，FK520，两性霉素(amphotericin)，安哥拉霉素(angolamycin)，泰乐菌素(tylosin)，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素和FK506。在更高度优选的实施方案中，所述AT结构域选自下组雷帕霉素模块2，莫能菌素模块3，莫能菌素模块6，莫能菌素模块8，FK506模块3和FK506模块7。在最高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域来自雷帕霉素的模块2。
本领域技术人员可以理解的是，该转化可尝试用于多种丙二酰-CoA选择性酰基转移酶结构域中的任意一种，所述结构域来自任何I型PKS或混合的NRPS/PKS。本领域技术人员还可以理解的是，丙二酰-CoA通过模块10AT的掺入可以通过使天然rap AT10突变以改变它们的特异性来实现，例如，使用如WO 02/14482中所述的方法，或通过用包括对丙二酰-CoA具有选择性的AT结构域的模块取代完整的模块10来实现，所述模块包括天然模块和组合模块。
另一方面，本发明提供了制备重组菌株的方法，该菌株包括编码工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇，其中，模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代。在优选实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列PKS簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素，FK506，红霉素，FK520，两性霉素，安哥拉霉素，泰乐菌素，′hyg′，FK523，metidamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素，FK506。在更高度优选的实施方案中，所述AT结构域选自下组雷帕霉素模块2，莫能菌素模块3，莫能菌素模块6，模块8，FK506模块3和FK506模块7。在最高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域来自雷帕霉素的模块2。
尽管本文已经在吸湿链霉菌MG2-10(该菌株的制备在WO 04/007709和Gregory等，(2004)中公开)中举例说明了雷帕霉素聚酮化合物合酶途径的工程改造，但本领域技术人员可以理解的是，这些方法可同样应用于野生型吸湿链霉菌NRRL5491和其他相关菌株。优选的工程菌株选自下组吸湿链霉菌MG2-10和吸湿链霉菌NRRL 5491。
本发明以上方面的一种实施方案提供了用于生产17-去甲基雷帕霉素及其类似物的方法，以及制备重组菌株的方法，所述菌株包含编码工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇，所述方法包括以下附加步骤(a)分离待导入的AT作为具有合适的侧翼限制位点单DNA片段，(b)利用合适的限制位点扩增并且分离与目标AT的侧翼序列同源的DNA序列的区域，(c)将如(a)和(b)中所述三种DNA片段连接在一起，以得到LHS同源性，随后是供体AT结构域，随后是RHS同源性的框内序列，(d)将来自(c)的完整序列导入用于导入宿主菌株的载体，以得到最终质粒，所述质粒包括i)用于接合的oriT，ii)一种或多种抗性标记，iii)温度敏感型复制起点，以便可以通过在37℃下培养选择整合体，和iv)大肠杆菌复制起点，(e)使用如上面(d)中所述的最终质粒通过接合转化所述宿主菌株，(f)通过对相关抗生素的抗性选择转化体，(g)通过在37℃培养，用抗生素选择产生初级整合体，(h)同样在37℃，通过在不存在抗生素选择的条件下生长筛选次级重组体，(i)通过它产生目标产物的能力鉴定需要的菌株，和(i)任选地通过标准方法验证所述菌株的遗传学。
另一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，和；(b)在适合聚酮化合物生产的条件下将非天然启动酸加入所述重组菌株的培养物，和(c)任选地分离由此产生的化合物。
因此，本发明提供了用于制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，该类似物整合了非天然启动酸。在优选实施方案中，所述重组菌株已进行了rapK缺失或失活。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株进行了rapK缺失或失活，而补料给该菌株的非天然启动酸选自下组环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在一种实施方案中，所述菌株不是产生17-去甲基雷帕霉素的重组吸湿链霉菌宿主细胞。在另一种实施方案中，所述菌株不是能在不提供外源前体的条件下产生17-去甲基雷帕霉素的重组吸湿链霉菌宿主细胞。
另一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代(如上文更详细地描述)，(b)附加地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)培养由此获得的菌株，如果需要的话，任选在存在外源前体的条件下培养，以生产17-去甲基雷帕霉素类似物，和(d)任选地分离由此产生的化合物。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapI，rapJ和rapQ。在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapJ，rapM和rapQ。
另一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代(如上文更详细地描述)，(b)附加地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)沿反式方向重新导入辅助基因的全部或亚组，以补偿或部分补偿所述缺失，(d)培养由此获得的菌株，如果需要的话，任选地在存在外源前体的条件下培养，以生产17-去甲基雷帕霉素类似物，和
(e)任选地分离由此产生的化合物。
在优选实施方案中，在步骤(b)中，使所有的雷帕霉素辅助基因缺失或失活。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是与选自下组的一个或多个辅助基因遗传互补的rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同系物。在特定实施方案中，所述菌株是与所有所述的辅助基因互补的。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是与辅助基因rapK，rapM，rapN，rapO和rapL或其同源物遗传互补的。在可替换的优选实施方案中，所述重组菌株是与雷帕霉素辅助基因rapK，rapI，rapN，rapO和rapL或其同源物遗传互补的。
在本发明的另一方面，将上述修饰组合，因此，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)附加地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)任选地沿反式方向重新导入辅助基因的全部或亚组，以补偿或部分补偿所述缺失，(d)在生产聚酮化合物的合适条件下将非天然启动酸供给所述重组菌株，和(e)任选地分离由此产生的化合物。
在优选实施方案中，已经缺失或失活的一个(或多个)辅助基因包括rapK。
在优选实施方案中，在步骤(b)中，使所有雷帕霉素辅助基因缺失或失活。在特定方面，本发明提供了通过对重组菌株进行遗传互补用非天然启动酸制备17-去甲基雷帕霉素类似物的替代方法，其中所有雷帕霉素辅助基因已经用雷帕霉素辅助基因rapI，rapJ，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物缺失或失活，这产生了包含除了rapK以外的所有辅助基因的菌株，并且供给外源启动酸。在优选实施方案中，所述外源非天然启动酸是环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸是3-甲基环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸是环庚烷羧酸。在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸选自下组3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在另一种实施方案中，本发明提供了用辅助基因活性和非天然启动酸的组合制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法。在优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapM和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸是环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，供给具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然启动酸是3-甲基环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，供给具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然启动酸是环庚烷羧酸。在优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapM和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸是3-甲基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK和rapM，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapM，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI，rapJ和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapJ，rapM和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种实施方案中，本发明提供了通过对重组菌株进行遗传互补制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，在所述重组菌株中，所有雷帕霉素辅助基因已经用选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物中的一个或多个辅助基因连同供给的天然或非天然启动酸缺失或失活。在优选实施方案中，所述重组菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的非天然启动酸环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在优选实施方案中，所述重组菌株是用rapJ，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的非天然启动酸环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中所述重组菌株是用rapJ，rapM，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸与3-甲基环己烷羧酸一起。
在另一种优选实施方案中所述重组菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中所述重组菌株是用rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中所述重组菌株是用rapM，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用rapI，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
另一方面，本发明提供了用于制备17-去甲基雷帕霉素类似物的文库的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)任选地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)任选地将全部或亚组雷帕霉素辅助基因沿反式方向重新导入，以便补偿或部分补偿所述缺失，(d)将一系列非天然启动酸供给所述重组菌株的生产培养物，以制备多种17-去甲基雷帕霉素类似物，(e)在合适条件下将天然或新型氨基酸供给所述重组菌株的生产培养物，从而生产聚酮化合物，(f)任选地分离由此产生的化合物，和(g)任选地对分离的雷帕霉素类似物进行半合成。
在下面的说明书、实施例和权利要求书中将更详细地描述本发明的这些和其他实施方案。


图1雷帕霉素的结构A是′结合结构域′，而B是′效应子结构域′。
图2雷帕霉素(A)，FK506(B)，FK520(C)和meridamycin(D)的结构。
图3MG2-10的遗传工程以制备MG7-9。
图4通过质谱碎裂39-去甲氧基-17-去甲基前-雷帕霉素。
图517-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的LC-FT-ICR-MS分析。
图617-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的LC-FT-ICR-MSn分析。
图717-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的显著NMR相关。
图8质粒pLL150的示意图。
定义在本文中使用冠词″a″和″an″表示一种或一种以上(即至少一种)的该冠词的语法实体。作为实例，″类似物″表示一种类似物或一种以上类似物。
如本文中使用的术语″类似物″表示在结构式与其他类似物相似但是在组成上略微不同的化合物(例如，一个原子被另一个原子取代或存在或不存在特定的官能团)。
如本文中使用的术语″17-去甲基雷帕霉素及其类似物″意图包括以下结构式I范围内的化合物 其中x表示直接键，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-x-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示选自下组A，B，C，D，E和F的结构片段，
其中，波形线指示片段结合位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，卤基，硫醇或C1-4烷基；或R4还可以表示5-至7-员杂环，所述杂环包含选自O，S和N的一个或多个杂原子，所述杂环用选自C1-4烷基，OH，F和Cl的一个或多个取代基任选地取代；和R5和R6各自独立地为H或OH，或其可以药用的衍生物，该化合物以下被称作″本发明的化合物″。
如本文中使用的术语″可以药用的衍生物″包括可以药用的盐(例如，酸加成盐)。它还包括涉及溶剂化物(例如，水合物)。
如本文中使用的术语″卤基″包括氟，氯，溴和碘。
如本文中使用的术语″硫醇″包括基团SH。
除非另有说明，本文所提到的C1-4烷基可以是直链的，或者，在存在足够数量的C-原子时(即最少3个)可以是分支的。所述C1-4烷基还可以被一个或多个卤基(例如，氟)原子取代。
R4可表示的杂环基团的在性质上可为完全饱和的，部分不饱和的，全部芳族的或部分芳族的。所述基团还可以是单环的或，可能的话，是双环的。可提及的杂环R4基团的意义可以包括二噁烷基(dioxane)，间二氧杂环戊烯基(dioxolyl)，呋喃基(furanyl)，六氢嘧啶基(hexahydropyrimidinyl)，乙内酰脲基(hydantoinyl)，咪唑基(imidazolyl)，异噁唑烷基(isoxazolidinyl)，异噁唑基(isoxazolyl)，马来酰亚胺基(maleimido)，吗啉基(morpholinyl)，噁二唑基(oxadiazolyl)，1，2-或1，3-oxazinanyl，噁唑基(oxazolyl)，哌嗪基(piperazinyl)，哌啶基(peperidinyl)，吡喃基(pyranyl)，吡嗪基(pyrazinyl)，吡唑基(pyrazolyl)，吡啶基(pyridinyl)，吡啶酮基(pyridonyl)，嘧啶基(pyrimidinyl)，吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)，吡咯烷基(pyrrolidinyl)，吡咯啉基(pyrrolinyl)，吡咯基(pyrrolyl)，二氧噻吩烷基(sulfolanyl)，3-二氧噻吩烯基(3-sulfolenyl)，四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)，四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)，3，4，5，6-四氢吡啶基(3，4，5，6-tetrahydropyridinyl)，1，2，3，4-四氢嘧啶基(1，2，3，4-tetrahydropyrimidinyl)，3，4，5，6-四氢嘧啶基(3，4，5，6-tetrahydropyrimidinyl)，四唑基(tetrazolyl)，噻二唑基(thiadiazolyl)，噻唑烷基(thiazolidinyl)，噻唑基(thiazolyl)，噻吩基(thienyl)，和三唑基(triazolyl)等(例如，饱和的或部分不饱和的单环基团，如二噁烷基，间二氧杂环戊烯基，六氢嘧啶基，乙内酰脲基，异噁唑烷基，马来酰亚胺基，吗啉基，哌嗪基，哌啶基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，吡咯啉基，二氧噻吩烷基，3-二氧噻吩烯基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，3，4，5，6-四氢吡啶基，1，2，3，4-四氢嘧啶基，3，4，5，6-四氢嘧啶基，和噻唑烷基等或，尤其是包括一个选自N，S或，特别是O的杂原子的饱和的单环基团，如哌啶基，吡咯烷基，四氢呋喃基，和四氢吡喃基等)。然而，在与本发明的化合物相关的具体实施方案中，R4表示选自下组的结构片段A，B，C，D，E和F(即它不表示杂环基团)。
如本文中使用的术语″修饰基因″包括聚酮化合物的后-聚酮化合物合酶修饰所需要的基因，例如，但不局限于，细胞色素P-450单加氧酶，铁氧化还原蛋白和SAM-依赖型O-甲基转移酶。在雷帕霉素系统中，所述修饰基因包括rapN，rapO，rapM，rapI，rapQ，和rapJ。本领域技术人员可以理解的是，这些基因的同源物存在于相关的生物合成基因簇中，并且还预期这些同源基因在本发明方法中的用途。
如本文中使用的术语″前体补偿基因″包括供给所述天然或非天然前体所需要的基因，合成任何天然或非-天然整合的前体所需要的基因，以及整合任何天然或非-天然整合的前体所需要的基因。例如，但不局限于在雷帕霉素系统中，这些基因包括rapL，rapK，rapP和rapA。本领域技术人员可以理解的是，这些基因的同源物存在于相关生物合成基因簇中，并且还预期这些同源基因在本发明的方法中的用途。
如本文中使用的术语″辅助基因″包括涉及修饰基因，前体供给基因或同时包括修饰基因和前体供给基因。
如本文中使用的术语″前体″包括天然启动酸(即4，5-二羟基环己-1-烯羧酸)，非天然启动酸，天然整合的氨基酸(即六氢吡啶羧酸，脯氨酸)，非-天然整合的氨基酸，丙二酰-CoA和甲基丙二酰-CoA。
如本文中使用的术语″非-天然启动酸″表示在聚酮化合物合成中可以作为启动酸整合的任何化合物，它不是PKS通常选择的启动酸。
为了避免疑问，术语″前体″和″非-天然启动酸″包括寡聚酮化合物(oligoketides)(例如，二聚酮化合物(diketide)和三聚酮化合物(triketides))的N-乙酰半胱胺硫酯(N-acylcysteamine thioester)，以及可以整合到最终产物中的羧酸的N-乙酰半胱胺硫酯或酯。
如本文中使用的术语″天然模块″指一组从KS到ACP结构域的连续的结构域，其包括KS-AT-ACP(按该顺序排列)并任选地包括一个或多个选自下组的结构域β-酮还原酶(KR)结构域，KR结构域和脱水酶(DH)结构域，以及KR结构域，DH结构域和烯酰还原酶(ER)结构域。
如本文中使用的术语″组合模块″表示一组连续的结构域，它从天然模块上的一个点延伸到随后的模块的相应的点，例如，从模块A的AT结构域的起点到模块B的AT结构域的起点，或从模块B的KS结构域的中间到模块C的KS结构域的中间。所述组合模块可以是″双重的″或较大的，即可以包括相同数量的结构域，如两个或更多个天然模块。
如本文中使用的术语″前-雷帕霉素″表示在任何修饰基因作用之前，通过雷帕霉素聚酮化合物合酶(包括rapA，rapB，和rapC)和rapP的活性产生的的最初的无酶产物，并尤其表示具有以下所示结构的化合物 如本文中使用的术语″自身免疫疾病″包括，但不局限于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythrematosis)(SLE)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，重症肌无力(myasthenia gravis)和多发性硬化(multiple sclerosis)。
如本文中使用的术语″炎性疾病″包括，但不局限于牛皮癣(psoriasis)，皮炎(dermatitis)，湿疹(eczema)，皮脂溢(seborrhoea)，炎性肠病(inflammatorybowel disease)(包括，但不局限于溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和克罗恩氏病(Crohn’s disease))，肺炎(pulmonary inflammation)(包括哮喘(asthma)，慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)，肺气肿(emphysema)，急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)和支气管炎(bronchitis))和眼葡萄膜炎(eye uveitis)。
如本文中使用的术语″癌症″表示新的恶性肿瘤生长，这些肿瘤来自上皮，存在于皮肤中，或者更常见的是存在于身体器官的衬里(lining)中，例如，乳房，前列腺，肺，肾，胰，胃，或肠。癌倾向于渗透到相邻的组织中，并且扩散(转移)到远处的器官，例如，扩散到骨，肝，肺或大脑中。在本文中，术语癌同时包括转移类型的肿瘤细胞，如，但不局限于，黑素瘤(melanoma)，淋巴瘤(lymphoma)，白血病(leukaemia)，纤维肉瘤(fibrosarcoma)，横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)，和肥大细胞瘤(mastocytoma)，以及各种类型的组织癌，如，但不局限于，结肠直肠癌，前列腺癌，小细胞肺癌和非-小细胞肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，肾癌，胃癌，神经胶母细胞瘤(gliobastoma)，原发性肝癌和卵巢癌。
如本文中使用的术语″B-细胞恶性肿瘤″包括一组疾病，所述疾病包括慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukaemia)(CLL)，多发性骨髓瘤(multiple myeloma)，和非-Hodgkin′s淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(NHL)。它们是血液和血液形成器官的肿瘤性疾病。它们导致骨髓和免疫系统功能障碍，使得宿主高度易受感染和出血。
如本文中使用的，术语″血管疾病″包括，但不局限于增殖过度血管疾病(hyperproliferative vascular disorder)(例如，再狭窄(restenosis)和血管闭塞(vascular occlusion))，移植血管动脉粥样硬化(graft vascular atherosclerosis)，心血管疾病(cardiovascular disease)，脑血管疾病(cerebral vascular disease)和外周血管疾病(peripheral vascular disease)(例如，冠状动脉病(coronary arterydisease)，动脉硬化(arteriosclerosis)，动脉粥样硬化(atherosclerosis)，非动脉粥样硬化的动脉硬化(nonatheromatous arteriosclerosis)或血管壁损伤)。
如本文中使用的术语″神经元再生″表示刺激神经细胞生长，并且包括神经突长出，和神经细胞的功能性恢复。神经元再生可具有重要治疗益处的疾病和病症包括，但不局限于，阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)，帕金森氏症(Parkinson’s disease)，亨廷顿舞蹈病(Huntingdon′s chorea)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amytotrophic lateral sclerosis)，三叉神经痛(trigeminal neuralgia)，舌咽神经痛(glossopharyngeal neuralgia)，贝耳氏麻痹(Bell’s palsy)，肌萎缩(muscular dystrophy)，中风(stroke)，进行性肌萎缩(progressive muscularatrophy)，进行性延髓继承性肌萎缩(progressive bulbar inherited muscularatrophy)，颈椎病(cervical spondylosis)，Gullain-Barre综合症，痴呆(dementia)，周围神经病(peripheral neuropathies)和周围神经损伤(peripheral nerve damage)，无论是由物理损伤(例如，脊髓损伤或创伤(trauma)，坐骨或面神经损害或损伤)引起的或由疾病状态(例如，糖尿病)引起的。
如本文中使用的术语″纤维变性疾病″表示与细胞外基质的过量产生相关的疾病，并且包括(但不局限于)结节病(sarcoidosis)，瘢痕疙瘩(keloid)，肾小球性肾炎(glomerulonephritis)，晚期肾病(end stage renal disease)，肝纤维症(liver fibrosis)(包括，但不局限于硬化(cirrhosis)，酒精性肝病(alcohol liverdisease)和脂肪-肝炎(steato-heptatitis))，慢性移植肾病(chronic graftnephropathy)，血管病变(vasculopathy)，心纤维化(cardiac fibrosis)，肺纤维化(pulmonary fibrosis)(包括，但不局限于特发性肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis)和隐原性纤维化肺泡炎(cryptogenic fibrosing alveolitis))，黄斑变性(macular degeneration)，视网膜和玻璃体视网膜病变(retinal and vitrealretinopathy)和化疗或辐射引起的纤维化。
如本文中使用的，术语″伤口愈合″表示在皮肤和其他软组织损伤之后的修复过程，并且包括，但不局限于，手术后伤口的愈合，治疗烧伤或肥大性或瘢痕疙瘩的疤痕，以及预防手术粘连。
本发明的说明一方面，本发明提供了17-去甲基雷帕霉素及其类似物，具体地，本发明提供了根据以下结构式的17-去甲基雷帕霉素类似物
其中x表示直接键，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-X-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示选自下组的结构片段A，B，C，D，E和F， 其中，波形线表示片段结合的位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，卤基，硫醇或C1-4烷基；或R4还可以表示5-至7-员杂环，其包括选自下组的一个或多个杂原子O，S和N，所述杂环任选地用选自C1-4烷基，OH，F和Cl的一个或多个取代基取代；和R5和R6各自独立地为H或OH，或其可以药用的衍生物。
在一种实施方案中，R4表示选自下组的结构片段A，B，C，E和F(例如，选自下组的结构片段A，C，E和F)，如上文所定义的，其中，R7和R8是上文所定义的(例如，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，Cl或F(如H，OH，OMe或F))。
在另一种实施方案中R4表示选自下组的结构片段A(i)，C(i)，E(i)和F(i) 其中，R7和R8是上文所定义的(例如，R7表示H或OH，而R8表示H，OH或OMe)。
在另一种优选实施方案中，R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R8是H，而R7是H，OMe，或者尤其是OH。
在优选实施方案中，当R5表示OH时，R6表示H，而当R6表示OH时，R5表示H；x表示直接键，或者尤其是CH2。
在另一种实施方案中，R2表示OH。
在另一种实施方案中，R4表示在4位上具有氧的6-员环(即，四氢吡喃-4-基)。
本发明的化合物的优选实施方案是这样的，其中R1表示(H，H)或＝O；R2表示OH或OMe；R3表示OH或OMe；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH，而R8表示H，OH或OMe；和x表示CH2。
在更高度优选的实施方案中R1表示(H，H)；R2表示OH；R3表示H；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH，而R8表示H；和x表示CH2。
在优选实施方案中R1表示(H，H)；R2表示OH；
R3表示H；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7和R8都表示OH；和x表示CH2。
在更高度优选的实施方案中R1表示(H，H)；R2表示OH；R3表示H；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH，而R8表示F；和x表示CH2。
在更高度优选的实施方案中R1表示＝O；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH而R8表示F或Cl；和x表示CH2。
在更高度优选的实施方案中R1表示＝O；R2表示OH；R3表示OMe；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH，而R8表示H；和x表示CH2。
在更高度优选的实施方案中R1表示＝O；R2表示OH；R3表示OH；R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH，而R8表示H；和x表示CH2。
在更高度优选的实施方案中R1表示＝O；R2表示OH；R3表示OMe；
R4表示结构片段C(i)，如上文所定义，其中R7表示OH，而R8表示OMe；和x表示CH2。
在一种实施方案中，所述化合物不是17-去甲基雷帕霉素。
与上述本发明的化合物所有实施方案相关，其中，基团R4表示取代的环己烷环，可被提及的其他实施方案包括，其中环己烷环上的取代基的相关立体化学是这样的，以使每一个取代基(包括基团R4可以结合的聚酮化合物环)在环己烷环处于椅式构象时，可同时采取平伏位置(equatorial position)。因此，例如，可被提及的本发明的化合物包括以下化合物，其中结合在结构片段C，D，F，C(i)和F(i)的环己烷环的2-，4-和/或6-位的基团相对于结合在环己烷基团的1-位的聚酮化合物环来说是反式的。另外，可被提及的本发明的其它化合物包括以下化合物，其中，结合在结构片段C，D，F，C(i)和F(i)的环己烷环的3-和/或5-位的基团相对于结合在环己烷基团的1-位的聚酮化合物环来说是顺式的。因此，可被提及的本发明的其它化合物包括以下化合物，其中，当基团R4表示结构片段C(i)时，相对于结合在环己烷环的1-位的聚酮化合物环来说，基团R7(如果存在，尤其是如果为OH或OMe基团的话)具有反式-立体化学，而基团R8(如果存在，尤其是如果为OH或OMe基团的话)具有顺式-立体化学。类似地，当基团R4表示环己-3-烯环(即，结构片段A或A(i))时，可被提及的本发明的化合物包括以下化合物，其中，相对于结合在环己烯环的1位的聚酮化合物环来说，2-和/或6-位的取代基具有反式-立体化学，3-位的取代基具有顺式-立体化学。
本领域技术人员可以理解的是，本文所描述的用于制备17-去甲基雷帕霉素及其类似物的方法可用于制备相关类似物的文库。因此，另一方面，本发明提供了使用本发明的方法制备的17-去甲基雷帕霉素类似物的文库。具体地，本发明提供了在下列一个或多个方面不同的17-去甲基雷帕霉素类似物的文库整合的启动酸，整合的氨基酸，后-PKS加工的程度和半合成衍生化。
所述新型雷帕霉素类似物是直接使用的，并且作为模板用于其他半合成或生物转化，以产生化合物，该化合物可用作免疫抑制剂，抗真菌剂，抗癌剂，抗炎剂，神经再生剂，或用于治疗移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病，血管疾病和纤维变性疾病的试剂或用于调控伤口愈合的试剂。用于雷帕霉素及其类似物的半合成衍生化的方法为本领域所熟知，并且包括(但不局限于)在以下文献中描述的改进，例如，U.S.5,665,772；U.S.5,362,718,WO 96/41807；U.S.5,728,710，U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772，U.S.5,391,730；U.S.5,023,262，U.S.5,563,145，U.S.5,446,048，U.S.5,912,253，U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279，U.S.6,015,815和U.S.5,432,183)。
另一方面，本发明提供了17-去甲基雷帕霉素或其类似物在医药中的用途。另一方面，本发明提供了将17-去甲基雷帕霉素或其类似物在制备用于如下方面的药品诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维变性疾病或用于调控伤口愈合的制剂中的用途。
也已知雷帕霉素类似物可用于治疗其他症状，包括，但不局限于淋巴管平滑肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis)和结节性硬化症(tuberous sclerosis)。与本发明的化合物相关的用途和方法还扩展到这些其他适应证(indication)。
本领域技术人员可以通过常规试验确定这些化合物可以抑制真菌生长的能力(例如，Baker，H.，等，1978；NCCLS Reference method for broth dilutionantifungal susceptibility testing for yeastsApproved standard M27-A，17(9)，1997)。另外，本领域技术人员可以通过常规试验确定这些化合物抑制肿瘤细胞生长的能力(参见Dudkin，L.，等，2001；Yu等2001)。另一方面，本发明的化合物可用于诱导免疫抑制，用于确定化合物在这些方面的效力的试验是本领域技术人员所公知的，例如，但不局限于免疫抑制剂活性-Warner，L.M.，等，1992，Kahan等(1991) & Kahan & Camardo，2001)；同种异体移植-Fishbein，T.M.，等，2002，Kirchner等2000；自身免疫/炎症/哮喘-Carlson，R.P.等，1993，Powell，N.等，2001；I型糖尿病-Rabinovitch，A.等，2002；牛皮癣-Reitamo，S.等，2001；类风湿性关节炎-Foey，A.，等，2002；纤维化-Zhu，J.等，1999，Jain，S.，等，2001，Gregory等1993。
可在用于此目的的标准试验中验证本发明的化合物诱导免疫抑制的能力。另一方面，本发明的化合物可用于和抗纤维变性，神经再生和抗血管生成机制有关，本领域技术人员可以通过常规试验确定这些化合物抑制血管发生(angiogenesis)的能力(例如，Guba，M.，等，2002)。本领域技术人员能够通过常规试验确定这些化合物治疗血管过度增殖性疾病例如，用于支架(stent)(例如，Morice，M.C，等，2002)的应用。另外，本领域技术人员可以通过常规试验确定这些化合物的神经再生能力(例如，Myckatyn，T.M.，等，2002，Steiner等1997)。
本发明还提供了药物组合物，其包括17-去甲基雷帕霉素或其类似物，或它的可以药用的盐，连同可以药用的载体的。
本发明的上述化合物或它的制剂可以通过任何常规方法施用，例如，但不局限于它们可以通过肠胃外，口服，局部(包括口腔，舌下，或透过表皮)，通过医疗器械(例如，支架)，通过吸入或通过注射(皮下或肌内)。所述治疗可由单剂或在一段时间内多剂组成。
尽管本发明的化合物可以单独施用，但它优选作为药物制剂连同一种或多种可接受的载体存在。所述载体在与本发明的化合物兼容的意义上必须是可接受的，并且对它的受体是无害的。合适载体的例子在下文进行更详细地描述。
本发明的化合物可以单独或者与其他治疗剂组合施用，两种(或更多种)试剂的共施用用于显著降低待施用的每一种的剂量，从而减少出现的副作用。
在一种实施方案中，将17-去甲基雷帕霉素或其类似物与另一种治疗剂共施用，用于诱导或维持免疫抑制，用于治疗移植排斥，移植物抗宿主病，自身免疫疾病或炎性疾病，优选的试剂包括，但不局限于，免疫调节剂，例如，咪唑硫嘌呤(azathioprine)，皮质激素(corticosteroid)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，环孢素A(cyclosporin A)，FK506，霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)，OKT-3和ATG。
在另一种实施方案中，将17-去甲基雷帕霉素或其类似物与另一种治疗剂共施用用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤，优选的试剂包括，但不局限于，氨甲喋呤(methotrexate)，亚叶酸(leukovorin)，阿霉素(adriamycin)，prenisone，博来霉素(bleomycin)，环磷酰胺，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，紫杉醇(paclitaxel)，多西紫杉醇(docetaxel)，长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，长春瑞滨(vinorelbine)，多柔比星(doxorubicin)，他莫昔芬(tamoxifen)，托瑞米芬(toremifene)，醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，阿纳托唑(anastrozole)，戈舍瑞林(goserelin)，抗-HER2单克隆抗体(例如，赫赛汀(HerceptinTM))，卡培他滨(capecitabine)，盐酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride)，EGFR抑制剂(例如，lressa，TarcevaTM，ErbituxTM)，VEGF抑制剂(例如，AvastinTM)，蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM)，Glivec或hsp90抑制剂(例如，17-AAG)。另外，17-去甲基雷帕霉素或其类似物可以与其他治疗组合施用，所述的其它治疗包括，但不局限于，放射治疗或手术。
在一种实施方案中，将17-去甲基雷帕霉素或其类似物与另一种治疗剂共施用，用于治疗血管疾病，优选的试剂包括，但不局限于，ACE抑制剂，血管紧张素II受体拮抗剂(angiotensin II receptor antagonist)，纤维酸衍生物(fibricacid derivative)，HMG-CoA还原酶抑制剂，β肾上腺素能阻断剂(adrenergicblocker)，钙通道阻断剂(calcium channel blocker)，抗氧化剂，抗凝血剂和血小板抑制剂(例如，波立维(PlavixTM))。
在一种实施方案中，将17-去甲基雷帕霉素或其类似物与另一种治疗剂共施用，用于刺激神经元再生，优选的试剂包括，但不局限于，神经营养因子，例如，神经生长因子，神经胶质衍生的生长因子，大脑衍生的生长因子，纤毛神经营养因子和神经营养蛋白-3(neurotrophin-3)。
在一种实施方案中，将17-去甲基雷帕霉素或其类似物与另一种治疗剂共施用，用于治疗真菌感染；优选的试剂包括，但不局限于，两性霉素B，氟胞嘧啶(flucytosine)，棘球白素(echinocandin)(例如，卡泊芬净(caspofungin)，阿尼芬净(anidulafungin)或米卡芬净(micafungin))，灰黄霉素(griseofulvin)，咪唑或三唑抗真菌剂(例如，克霉唑(clotrimazote)，咪康唑(miconazole)，酮康唑(ketoconazole)，益康唑(econazole)，布康唑(butoconazole)，奥昔康唑(oxiconazole)，特康唑(terconazole)，伊曲康唑(itraconazole)，氟康唑(fluconazole)或伏力康唑(voriconazole))。
共施用包括作为相同治疗方案的一部分给患者递送两种或两种以上治疗剂的任何方法，正如对于技术人员显而易见的。尽管两种或两种以上药剂可以在单一剂型同时施用，这样做并非是必需的。所述药剂可以以不同剂型并且在不同的时间施用。
所述制剂可方便地以单位剂型形式存在，并且可以通过药学领域的任何公知方法来制备。所述方法包括以下步骤使活性成分(本发明的化合物)与构成一种或多种辅助成分的载体结合。一般，通过使活性成分均匀并且紧密地与液体载体或细碎的固体载体或这两者结合，然后，如果需要的话对产品进行成型来制备所述制剂。
本发明的化合物通常是口服或通过任何肠胃外途径，以包括所述活性成分的药物制剂形式服用，任选地以无毒有机，或无机的，酸，或碱，加成盐的形式，以可以药用的剂型施用。根据待治疗的疾病和患者，以及施用途径，能够以变化的剂量施用所述组合物。
例如，能够以片剂，胶囊，胚珠(ovule)，酏剂，溶液或悬浮液的形式通过口服，口腔(buccally)，或舌下施用本发明的化合物，它还可以含有芳香剂或着色剂，用于直接，延迟或控制释放应用。本发明的化合物还可以通过海绵体内(intracavernosal)注射施用。
适合口服施用的本发明的化合物的溶液或悬浮液还可以含有赋形剂，例如，N，N-二甲基乙酰胺，分散剂，例如，聚山梨醇酯80(polysorbate 80)，表面活性剂，和增溶剂，例如，聚乙二醇，Phosal 50PG(它由磷脂酰胆碱，大豆脂肪酸，乙醇，甘油单酯/甘油二酯，丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯(ascorbylpalmitate)组成)。
片剂可以包括赋形剂，如微晶纤维素，乳糖(例如，乳糖一水合物，或无水乳糖(lactose anyhydrous))，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙(dibasic calciumphosphate)和甘氨酸，崩解剂，如淀粉(优选玉米，马铃薯或木薯淀粉)，羟基乙酸淀粉钠(sodium starch glycollate)，交联羧甲纤维素钠(croscarmellosesodium)和某些复合硅酸盐，以及颗粒粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟基-丙基纤维素(HPC)，聚乙二醇8000(macrogol 8000)，蔗糖，明胶和阿拉伯树胶。另外，还可以包括润滑剂，如硬脂酸镁，硬脂酸，山嵛酸甘油酯(glyceryl behenate)和滑石。
还可将相似类型的固体组合物用作明胶胶囊中的填料。在此方面优选的赋形剂包括乳糖(lactose)，淀粉，纤维素，乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂(elixir)来说，本发明的化合物可以与各种甜味剂或芳香剂、着色物质或染料组合，与乳化剂和/或悬浮剂组合，以及与诸如水，乙醇，丙二醇和甘油，及其组合的稀释剂组合。
片剂可以通过压缩或模制(moulding)制备，任选地使用一种或多种辅助成分。压缩片剂可以通过在合适的机器中将自由流动形式的活性成分，如粉末或颗粒进行压缩来制备，任选地与粘合剂(例如，聚维酮(povidone)，明胶，羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠，交联的聚维酮，交联的羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂混合。模制的片剂可以通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物进行模制来制备。所述片剂可任选地包衣或刻痕(score)，并且可以配制，以提供其中的活性成分的缓慢或控制释放，例如，以变化的比例使用羟丙基甲基纤维素，以提供需要的释放曲线(release profile)。
适合口服施用的根据本发明的制剂能够作为分离单元提供，如胶囊，扁囊剂(cachet)或片剂，其各自含有预定量的活性成分；粉末或颗粒；含水液体或非水液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。所述活性成分还能够作为大丸剂(bolus)，药糖剂(electuary)或糊剂(paste)存在。
适合在口腔中局部施用的制剂包括在芳香底料(basis)中含有活性成分的锭剂(lozenge)，所述底料通常包括蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶(tragacanth)；还包括在惰性底料中含有活性成分的锭剂(pastille)，所述惰性底料如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶；以及漱口水，其在合适液体载体中含有活性成分。
应当理解的是，除了上面具体提到的成分之外，本发明的制剂可以包括本领域常用于所述制剂类型的其他试剂，例如，适合口服施用的那些试剂可以包括芳香剂。
适合局部施用的药物组合物可以配制成软膏(ointment)，乳剂(cream)，悬浮液，洗液，粉末，溶液，糊剂，凝胶，浸泡过的敷料，喷雾剂，气雾剂或油剂，经皮肤的装置，和扑粉(dusting powder)等。所述组合物可以通过包含活性剂的常规方法制备。因此，它们还可以包括兼容性常规载体和添加剂，如防腐剂，有助于药物渗透的溶剂，乳剂或软膏中的润滑剂和用于洗剂的乙醇或油醇(oleyl alcohol)。所述载体可以以组合物的大约1％至大约98％存在。更常见的是，它们形成组合物的大约80％。仅仅是用于说明目的，通过将足量的亲水材料和水混合来制备乳剂或软膏，它含有大约5-10重量％的化合物，以足量产生具有需要的一致性(consistency)的乳剂或软膏。
适合经过皮肤施用的药物组合物能够作为独立贴片提供，用于与受体的表皮保持长时间地紧密接触。例如，活性剂可以通过离子电渗疗法(iontophoresis)从贴片中输送。
为了施用于外部组织，例如，口腔和皮肤，所述组合物优选作为外用软膏或乳剂应用。在配制成软膏时，所述活性剂可以用在石蜡或可弥散于水的软膏底料中。
另外，所述活性剂能够用水包油乳剂底料或油包水底料配制成乳剂。
为了肠胃外施用，使用活性成分和无菌载体制备流体单位剂型，所述载体例如，但不局限于水，醇，多元醇，甘油和植物油，优选水。取决于载体和使用的浓度，活性成分可以悬浮或溶解在载体中。在制备溶液时，所述活性成分可以溶解在水中用于注射，并且在填充到合适的小瓶或安培瓶中之前进行过滤消毒，然后密封。
有利地，可以将诸如局部麻醉剂，防腐剂和缓冲剂的试剂溶解在载体中。为了提高稳定性，可以在填充到小瓶中之后对所述组合物进行冷冻，并且在真空下除去水分。然后将冷冻干燥的粉末密封在所述小瓶中，并且可供给装水用于注射的附带小瓶，以在使用之前重建所述液体。
肠胃外悬浮液是以与溶液大体上相同的方式制备的，所不同的是将活性成分悬浮在而不是溶解在载体中，并且不能够通过过滤进行消毒。可以在悬浮到无菌载体中之前通过暴露于环氧乙烷对活性成分进行消毒。有利地，在该组合物中包括表面活性剂或湿润剂，以促进活性成分的均匀分布。
本发明的化合物还可以使用本领域公知的医疗器械施用。例如，在一种实施方案中，本发明的药物组合物可以用皮下无针注射装置施用，例如，公开于以下文献中的装置U.S.5,399,163；U.S.5,383,851；U.S.5,312,335；U.S.5,064,413；U.S.4,941,880；U.S.4,790,824；或U.S.4,596,556。可用于本发明中的众所周知的植入物和模块的例子包括US 4,487,603，该专利公开了可植入的微型输液泵，用于以控制的速度分配药物；US 4,486,194，它公开了通过皮肤施用药物的治疗设备；US 4,447,233，它公开了用于以精确的输液速度输送药物的药物输液泵；US 4,447,224，它公开了变速流可植入的输液装置，用于连续输送药物；US 4,439,196，它公开了具有多个腔室的渗透压药物输送系统；和US 4,475,196，它公开了渗透压药物输送系统。在具体实施方案中，本发明的化合物可以使用药物洗脱支架来输送，例如，对应于在WO 01/87263以及相关出版物中所描述的那些或由Perin(Perin，EC，2005)所描述的那些。多种其他此类植入物，输送系统，和模块为本领域技术人员所公知。
在本方面的另一种实施方案中，本发明的化合物能够以″前药(prodrug)″的形式提供给患者，这特别适用于抗癌剂的情形，不过，还可应用于其他适应症。
本申请所使用的术语″前药″表示前体或衍生形式的药物活性物质，与母体药物相比它具有较低的毒性，并且能够通过酶促方式激活或转化成活性更高的母体形式(参见，例如，Wilman D.E.V.，1986和Stella VJ.等，1985)。
本发明的化合物的待施用的剂量可以根据具体化合物、相关的疾病、受试者(subject)以及疾病的性质和严重程度，和受试者的身体情况，和选择的施用途径而改变。本领域技术人员能够方便地确定合适剂量。
根据施用方法，所述组合物可以包括本发明的化合物的0.1重量％，优选10-60重量％或以上。
本领域技术人员可以理解的是，可以通过要治疗的症状的性质和程度，施用的形式、途径和部位，以及被治疗的具体受试者的年龄和状态来确定本发明的化合物的最佳用量和单独剂量的间隔，并且医生将最终确定待使用的合适剂量。该剂量可以以合适的频率重复。根据常规临床实践，如果出现副作用，可以改变或减少所述剂量和/或频率。
另一方面，本发明提供了用于生产17-去甲基雷帕霉素或其类似物的方法，所述方法包括(a)用丙二酰-CoA-特异性AT结构域取代所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域，(b)在合适的宿主细胞中表达工程改造的雷帕霉素PKS，(c)在能产生17-去甲基雷帕霉素或其类似物的条件下培养宿主细胞，包括任选地供给外源前体(d)任选地分离由此产生的化合物。
在具体实施方案中，所产生的化合物不是17-去甲基雷帕霉素。
这种取代导致与雷帕霉素或前-雷帕霉素相比，雷帕霉素PKS模块10整合了丙二酰-CoA并缺少位于C17的甲基分支。在优选实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列聚酮化合物合酶基因簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素，FK506，红霉素，FK520，两性霉素，安哥拉霉素，泰乐菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素或FK506。在更高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下组来自雷帕霉素模块2的AT结构域，来自莫能菌素模块3的AT结构域，来自莫能菌素模块6的AT结构域，来自莫能菌素模块8的AT结构域，来自FK506模块3的AT结构域和来自FK506模块7的AT结构域。在最高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域是来自雷帕霉素模块2的AT结构域。
应当指出的是，已经在保藏的序列中鉴定了多种错误，例如，在WO04/007709中报道的那些。本文作者预测，在保藏的序列中可能还有其他错误，这些错误中的一些可能存在于用于本发明工程改造簇的区域。序列表中的序列表示合成的寡核苷酸的序列，它是根据公开的序列和已测序的通过多核苷酸链式反应(PCR)扩增的DNA片段设计的。因此，它们可能与保藏的序列不相同。本领域技术人员可以理解的是，已经测序的克隆的DNA片段具有生物学正确的序列以形成功能性蛋白，并且在保藏序列中的错误对此没有影响。还鉴定了(NCBI登录号X86780)PKS基因的预测的翻译产物，以及所述结构域和模块的边界(Aparicio等，1996)。本领域技术人员可以理解的是，如Schwecke等，(1995)所定义的，在结构域和所述边界的定义中存在的一定量的流动性应当被视为边界可以存在的例子。
本领域技术人员可以理解的是，在I型聚酮化合物合酶(和混合的PKS-NRPS)中，存在多个丙二酰-CoA特异性AT结构域，这些结构域可用作供体AT结构域，并且这种转化可用于来自任何I型PKS或混合的NRPS/PKS的多种丙二酰-CoA选择性酰基转移酶结构域中的任意一个。本领域技术人员还可以理解的是，模块10AT对丙二酰-CoA的整合可以通过使rapAT10突变以改变它的特异性而实现，例如，使用WO 02/14482中描述的方法，或通过用包含对丙二酰-CoA具有选择性的AT结构域的模块取代模块10，所述模块包括天然模块或组合模块。
将所述丙二酰-CoA特异性AT导入雷帕霉素PKS的模块10是通过导入供体结构域侧翼的限制位点，并且在框内并在与雷帕霉素模块10的酰基转移酶相同的位置克隆来实现。本领域技术人员可以理解的是，这一目的可以通过使用多个限制酶位点和多种结合位置来实现。在优选实施方案中，将雷帕霉素AT2的丙二酰-CoA特异性AT结构域导入其侧翼为限制酶位点MscI和AvrII的DNA片段上。MscI位点被导入与编码保守氨基酸序列PGQ的DNA序列重叠的AT结构域的开始部分，参见下文。AvrII位点被导入与编码保守氨基酸序列VLG的DNA序列重叠的AT结构域的末端，，参见下文。本领域技术人员可以理解的是，在该克隆策略中，MscI位点是甲基化的，并且通过诸如ET12567的大肠杆菌菌株传代，以制备dcm-DNA，是用限制酶MscI消化之前所必需的。其他实施方案涉及使用不同的限制位点，例如，但不局限于SpeI和AvrII，MscI和BglII，SpeI和BglII。另一种限制位点组合是SpeI和AvrII。
产生位于AT结构域起始部分的MscI位点
Rap At10 P P G Q G(SEQ ID NO1)ttt ccc ggg cag gga (SEQ ID NO2)Rap AT2 F P G Q G(SEQ ID NO3)ttc ccg ggt cag ggg (SEQ ID NO4)MscI结合 F P G Q G(SEQ ID NO5)ttt cct ggc cagggg (SEQ ID NO6)产生位于AT结构域末端的AvrII位点Rap AT10 A V L G D(SEQ ID NO7)gcg gtg ctg ggt gat (SEQ ID NO8)Rap AT2 A V L G D(SEQ ID NO9)gcg gtg ctg ggt gat (SEQ ID NO10)AvrII结合 A V L G D(SEQ ID NO11)gcg gtc cta ggt gat (SEQ ID NO12)在优选实施方案中，对吸湿链霉菌MG2-10的雷帕霉素聚酮化合物合酶进行工程改造，以在模块10中具有丙二酰-CoA特异性AT。在高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA AT是雷帕霉素AT2，如本文的实施例1所述。
本领域技术人员可以理解的是，有多种方法可以将DNA导入细胞，以实现PKS基因簇的工程改造。在实施例1中，我们描述了使用温度敏感型起点质粒的接合方法。本领域技术人员可以理解的是，还可以使用其他方法，例如，但不局限于，不使用自我复制载体的同源重组，如WO 03/033699所述的方法。因此，制备工程改造的雷帕霉素PKS重组方法不应当局限于上述可选择的方法。
不过，本文所描述的方法是用于制备工程改造的PKS簇的优选方法。迄今为止，还没有用上述可选择的方法对rapA，rapB或rapC进行工程改造的成功报导。
另一方面，本发明提供了制备重组菌株的方法，该菌株包含编码雷帕霉素聚酮化合物合酶的工程改造的生物合成基因簇，其中模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，如上文所述。在优选实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列聚酮化合物合酶基因簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素，FK506，红霉素，FK520，两性霉素，安哥拉霉素，泰乐菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。在更优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素或FK506。在更高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下组雷帕霉素模块2，莫能菌素模块3，莫能菌素模块6，莫能菌素模块8，FK506模块3和FK506模块7。在最高度优选的实施方案中，所述丙二酰-CoA特异性AT结构域来自雷帕霉素的模块2。
尽管在本文中已经以吸湿链霉菌MG2-10为例说明了对雷帕霉素聚酮化合物合酶途径的工程改造(它的产生在WO 04/007709和Gregory等，(2004)中公开)，本领域技术人员将理解的是，这些方法同样适用于野生型吸湿链霉菌NRRL5491和其他相关菌株(参见下文)。优选地，所述工程菌株选自下组吸湿链霉菌MG2-10和吸湿链霉菌NRRL5491。
在本上下文中，与吸湿链霉菌NRRL5491相关的菌株包括游动放线菌属的菌种N902-109(例如，FERM BP-3832)，链霉菌属的菌种AA6554，吸湿链霉菌子囊霉素变种MA 6475(例如，ATCC 14891)，吸湿链霉菌子囊霉素变种MA 6678(例如，ATCC 55087)，吸湿链霉菌子囊霉素变种MA 6674，吸湿链霉菌子囊霉素变种(例如，ATCC 55276)，筑波链霉菌(Streptomycestsukubaensis)No.9993(例如，FERM BP-927)，吸湿链霉菌yakushimaensis亚种，链霉菌属菌种(例如，DSM 4137)，链霉菌属菌种(例如，DSM 7348)，小单孢菌属菌种A92-306401(例如，DSM 8429)和链霉菌属菌种MA 6858(例如，ATCC 55098)。在一种实施方案中，所述菌株不是能产生17-去甲基雷帕霉素的重组吸湿链霉菌宿主细胞。在另一种实施方案中，所述菌株不是能在不提供外源前体的情况下产生17-去甲基雷帕霉素的重组吸湿链霉菌宿主细胞。在另一种实施方案中，所述菌株不是包括五个连续基因，rapQONML的缺失的重组吸湿链霉菌宿主细胞。
任选地，该方法可与WO 04/007709中公开的方法组合，以允许生产17-去甲基雷帕霉素类似物，它与天然雷帕霉素结构的差别在于由后-PKS酶的加工程度，或在于整合了非天然启动酸。
本发明以上各方面的实施方案提供了用于生产17-去甲基雷帕霉素及其类似物的方法，以及制备重组菌株的方法，该菌株包括编码工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇，所述方法包括以下额外步骤(a)分离要导入的AT，它是具有合适的侧翼限制位点单一DNA片段，(b)利用相同的合适的限制位点扩增并且分离与目标AT的侧翼序列同源的DNA序列的区域，(c)将如(a)和(b)中所述三种DNA片段连接在一起，以便得到LHS同源性，随后是供体AT结构域，随后是RHS同源性的框内序列，
(d)将来自步骤(c)的完整序列导入用于导入宿主菌株的载体，以便得到最终质粒，所述质粒包括i)用于接合的oriT，ii)一种或多种抗性标记，iii)温度敏感型复制起点，以便可以通过在37℃培养来选择整合体，和iv)大肠杆菌复制起点，(e)通过使用如上面(d)中所述的最终质粒的接合来转化所述宿主菌株，(f)通过对相关抗生素的抗性选择转化体，(g)通过在37℃具有抗生素选择的培养产生初级整合体，(h)同样在37℃，通过在不存在抗生素选择的条件下的生长来筛选次级重组体，(i)通过它产生目标产物的能力鉴定需要的菌株，和(j)任选地通过标准方法验证所述菌株的遗传学。
本领域技术人员可以理解的是，在步骤(b)中所提到的合适的限制位点必须是这样的，以便连接在一起时这三个序列是框内的-它们不一定与用于AT的两个位点相同；具体地，同源性的左侧区域的RHS上的限制位点必须与所述AT的LHS上的位点相同，或者兼容以提供框内序列；同源性左侧区域的LHS上的限制位点可以是适合进行随后的克隆步骤的任何位点。类似地，同源性右侧区域的LHS上的位点必须与所述AT的RHS上的位点相同或兼容，以提供框内序列；同源性的右侧区域的RHS上的限制位点可以是适合进行随后的克隆步骤的任何位点。
另一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)在适合聚酮化合物生产的条件下，将非天然启动酸供给所述重组菌株的培养物，和(c)任选地分离由此产生的化合物。
因此，本发明提供了用于制备已经整合了非天然启动酸的17-去甲基雷帕霉素类似物的方法。具体地，本发明提供了将环状和杂环启动酸整合到17-去甲基雷帕霉素类似物中，所述方法包括将所述可选的启动酸供给菌株，该菌株包括工程改造的雷帕霉素生物合成基因簇，所述基因簇负责17-去甲基前-雷帕霉素核心的合成。在一种实施方案中，所述重组菌株已经缺失或失活了前体提供基因。在优选实施方案中，已经缺失或失活所述前体提供基因是rapK。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株已经缺失或失活了rapK，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在一种实施方案中，所述菌株不是能产生17-去甲基雷帕霉素的重组吸湿链霉菌宿主细胞。在另一种实施方案中，所述菌株不是在不提供外源前体的条件下能产生17-去甲基雷帕霉素的重组吸湿链霉菌宿主细胞。
本发明的此方面提供了通过整合非天然前体(例如，环状或杂环启动酸)有效生产多种基础产物的方法。方法还可以体现如下面所述的其他方面。
因此，一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，该方法整合环状或杂环启动酸，所述方法包括(a)修饰包含工程改造的雷帕霉素PKS基因的所述重组菌株，以额外使至少一个前体提供基因缺失或失活；和(b)将环状或杂环非天然启动酸供给所述重组菌株。
在优选实施方案中，所述重组菌株是使用WO 04/007709中以及本文所述的方法制备的。在优选实施方案中，已缺失或失活的前体提供基因之一是rapK。
在一种实施方案中，供给的外源酸包括(但不局限于)环烷基羧酸，或它们的简单的酯，环的大小从5至7个原子变化。在优选实施方案中，所述羧酸是WO 04/007709中所描述的那些羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸是在本文的实施例2中所述的启动酸。在更优选的实施方案中，供给该菌株的非天然启动酸选自下组环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在一种实施方案中，可以添加的杂环启动酸可以包括(但不局限于)杂环羧酸，或它的简单的酯，环的大小从5至7个原子变化，所述环可以包括一个或多个杂原子，其中，所述环包括一个以上杂原子，所述杂原子可以相同或不同。所述杂原子可选自下组O，S和N。当所述环包括N时，它可以是游离碱(NH)，酰化的胺(N-酰基)，烷基化的胺(N-烷基)或烷基化的N-氧化物(N-烷基，N-O)。当所述环包括S时，它可以是环状硫醚，亚砜或砜。在上述所有杂环羧酸中，所述环的其余部分可以是未取代的或可以任选地包括一个或多个取代基，其包括，但不局限于C1-4烷基，OH，F和Cl。优选地，在一种实施方案中，所述杂环羧酸包括在4位具有氧原子的6员环。在另一种优选实施方案中，所述杂环羧酸是四氢-2H-吡喃-4-羧酸。
另一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代(如上文更详细地描述的)，(b)附加地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)培养由此获得的菌株，如果需要的话，任选地在存在外源前体的条件下培养，以生产17-去甲基雷帕霉素类似物，和(d)任选地分离由此产生的化合物。
在优选实施方案中，已经缺失或失活的辅助基因是rapI，rapJ和rapQ。在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapJ，rap和rapQ。
在本发明的另一方面，改变的雷帕霉素PKS是在宿主细胞中表达的，在所述宿主细胞中，一个或多个雷帕霉素辅助基因已经缺失或失活。在另一种实施方案中，改变的雷帕霉素PKS是在宿主细胞中表达的，在所述宿主细胞中，所有辅助基因已经缺失或失活，例如，但不局限于，宿主菌株吸湿链霉菌MG2-10(WO 04/007709；Gregory等，2004)。本领域技术人员可以理解的是，根据WO 04/007709所公开的内容，如果rapK已经缺失或失活的话，就需要提供外源酸，用于生产17-去甲基雷帕霉素或其类似物。
另一方面，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代(如上文更详细地描述的)，
(b)附加地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)沿反式方向重新导入辅助基因的全部或亚组，以补偿或部分补偿所述缺失，(d)培养由此获得的菌株，如果需要的话，任选地在存在外源前体的条件下培养，以生产17-去甲基雷帕霉素类似物，和(e)任选地分离由此产生的化合物。
在优选实施方案中，在步骤(b)中使所有雷帕霉素辅助基因缺失或失活。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用选自下组的一个或多个辅助基因选遗传互补的rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物。在具体实施方案中，所述菌株是用所有辅助基因互补的。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用雷帕霉素辅助基因rapK，rapM，rapN，rapO和rapL或其同源物遗传互补的。在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用雷帕霉素辅助基因rapK，rapI，rapN，rapO和rapL或其同源物遗传互补的。
因此，在本发明的具体方面，AT交换是在吸湿链霉菌MG2-10中进行的(在WO 04/007709和Gregory等，(2004)中公开)，其中已经去除了所有辅助基因，以制备一种菌株，它需要用外源酸进行化学补偿以生产雷帕霉素。例如，添加环己烷羧酸，导致了17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的产生，而添加启动酸3，4-二羟基环己烷羧酸，导致了17-去甲基前-雷帕霉素的产生。在优选实施方案中，通过进行AT交换在吸湿链霉菌MG2-10中产生的菌株是吸湿链霉菌MG7-9，它如实施例1所述是通过将雷帕霉素模块2的酰基转移酶导入模块10以取代天然AT10而产生的。
本领域技术人员可以理解的是，在吸湿链霉菌MG7-9中，没有rapL的拷贝，并且所述化学补偿并非指添加六氢哌啶羧酸或可替换的氨基酸。通过用赖氨酸补充复合生产培养基，以提供具有六氢吡啶羧酸的菌株(通过未经确定，而是通过观察生产的前-雷帕霉素类似物建立的方法)。培养该菌株(吸湿链霉菌MG7-9)导致了17-去甲基脯氨酰雷帕霉素类似物的共同产生，观察到它的生产水平较低，并且对于RapL缺陷的菌株观察到了类似的结果。通过将外源天然和新型氨基酸添加到生产培养基中与六氢吡啶羧酸直接竞争，可以将外源天然和新型氨基酸整合到野生型雷帕霉素分子上。本领域技术人员可以理解的是，类似地，可将天然或非天然氨基酸供给rapL缺失的菌株，如，但不局限于吸湿链霉菌MG7-9，以提供其他新型雷帕霉素类似物。
任选地，可将一个或多个缺失的辅助基因导入所述宿主细胞，处于合适的启动子控制之下。在优选实施方案中，可以将一个或多个缺失的基因导入链霉菌噬菌体phiBTI的染色体噬菌体结合位点(Gregory等，2003)。本领域技术人员可以理解的是，沿反式方向的补偿并不局限于该噬菌体结合位点，或实际上局限于结合位点的使用。因此，缺失的辅助基因的补偿还可以通过，但不局限于，例如，通过使用pSET152的衍生物(Bierman等，1992)将在合适启动子控制之下的一个或多个辅助基因导入其他噬菌体结合位点，如链霉菌噬菌体DhiC31的结合位点而实现。所述整合同样可以通过使用其他可利用的整合功能来实现，所述整合功能包括，但不局限于基于pSAM2整合酶的载体(例如，pPM927(Smovkina等，1990))，R4整合酶(例如，pAT98(Matsuura等，1996))，VWB整合酶(例如，pKT02(Van Mellaert等，1998))，和L5整合酶(例如，Lee等，1991)。本领域技术人员可以理解的是，预计有多种放线菌噬菌体都包含整合功能，这些功能能够随同合适的启动子一起转移到输送载体上，以产生可用于将基因导入吸湿链霉菌的其他系统。实际上，已经鉴定了很多其他的吸湿链霉菌噬菌体，并且能够由此获得整合功能，并且以类似方式使用。随着越来越多的噬菌体被鉴定，预计会出现能类似使用的其他可利用的整合酶。在某些情况下，可能需要通过添加用于整合酶的特定attB位点来改变宿主菌株，以实现高效整合。导入在合适启动子控制之下的辅助基因还可以通过，但不局限于以下方法实现，同源重组到染色体中的中性位置，同源重组到染色体的非中性位置(例如，用于破坏选择的基因)。还可以使用自我复制的载体，例如，但不局限于，含有链霉菌复制起点的载体，所述复制起点来自pSG5(例如，pKC1139 Bierman等，1992)，pIJ101(例如，pIJ487，Kieser等，2000)和SCP2*(例如，pIJ698，Kieser等，2000)。可以将一种以上上述系统用于重组菌株的工程改造，以制备17-去甲基雷帕霉素类似物。本领域技术人员可以理解的是，还可以产生生物合成途径，根据需要通过使每一个辅助基因失活或缺失，该途径能够产生与所有辅助基因的缺失相同的产物，和沿反式方向的补偿。需要时通过添加游离酸使所述基因在所述宿主细胞中表达，导致了17-去甲基雷帕霉素类似物的产生，该类似物整合了天然或非天然启动酸和/或具有改变的后聚酮化合物加工水平。在另一种实施方案中，改变的雷帕霉素PKS能够在异源宿主细胞中表达，该宿主天然缺乏雷帕霉素辅助基因(或它的等同物)，连同所述辅助基因的选择。在优选实施方案中，至少rapK是缺失的或RapK以其他方式不存在于宿主菌株中，并且可以将多种外源羧酸供给所述宿主菌株，以产生整合了非天然启动酸的17-去甲基雷帕霉素类似物。
在本发明的另一方面，组合了上述修饰，因此，本发明提供了制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)附加地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)任选地沿反式方向重新导入辅助基因的全部或亚组，以补偿或部分补偿所述缺失，(d)在合适条件下将非天然启动酸供给所述重组菌株用于生产聚酮化合物，和(e)任选地分离由此产生的化合物。
在优选实施方案中，已经缺失或失活的辅助基因包括rapK。
在优选实施方案中，在步骤(b)中使所有雷帕霉素辅助基因缺失或失活。在具体方面，本发明提供了用于制备17-去甲基雷帕霉素类似物的可选择的方法，所述类似物通过对重组菌株进行遗传互补已经整合了非天然启动酸，在所述菌株中，所有雷帕霉素辅助基因已经用雷帕霉素辅助基因rapI，rapJ，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物缺失或失活，制备包括除rapK以外的所有辅助基因的菌株，并且供给外源启动酸。在优选实施方案中，所述外源非天然启动酸是环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸是3-甲基环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸是环庚烷羧酸。在另一种优选实施方案中，所述非天然启动酸选自下组3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
另一方面，本发明提供了通过使所述重组菌株发酵，同时与辅助基因活性和非天然启动酸组合用于制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法。在优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapM和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸是环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，供给具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然启动酸是3-甲基环己烷羧酸。在另一种优选实施方案中，供给具有缺失的rapK，rapM和rapQ的菌株的非天然启动酸是环庚烷羧酸。在优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapM和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸是3-甲基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK和rapM，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI和rapM，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapI，rapJ和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，已经缺失的辅助基因是rapK，rapJ，rapM和rapQ，而供给该菌株的非天然启动酸选自下组3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的非天然启动酸是环己烷羧酸。
另一方面，本发明提供了通过对重组菌株进行遗传互补制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，其中所有雷帕霉素辅助基因已经用选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ或其同源物的一个或多个辅助基因连同添加天然或非天然启动酸来缺失或失活。在优选实施方案中，所述重组菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的非天然启动酸环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在优选的实施方案中，所述重组菌株是用rapJ，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的非天然启动酸环己烷羧酸，3-甲基环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用rapJ，rapM，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是3-甲基环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用rapI，rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，供给的启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用rapM，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
在另一种优选实施方案中，所述重组菌株是用rapI，rapN，rapO和rapL遗传互补的，并且供给选自下组的启动酸3-甲基环己烷羧酸，环己烷羧酸，环庚烷羧酸，3-氟-4-羟基环己烷羧酸，4-氟-3-羟基环己烷羧酸，3-氯-4-羟基环己烷羧酸和4-氯-3-羟基环己烷羧酸。在更高度优选的实施方案中，所供给的启动酸是环己烷羧酸。
另一方面，本发明提供了用于制备17-去甲基雷帕霉素类似物的文库的方法，所述方法包括(a)制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)任选地使选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)任选地沿反式方向重新导入所述雷帕霉素辅助基因的全部或亚组，以补偿或部分补偿所述缺失，和，(d)将一系列非天然启动酸供给所述重组菌株，以制备多种17-去甲基雷帕霉素类似物，(e)在适于生产聚酮化合物的条件下添加天然或新型氨基酸，(f)任选地分离由此产生的化合物，和(g)任选地对分离的雷帕霉素类似物进行半合成。
通过如下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应当被理解为是对本发明范围的限定。
实施例材料所有分子生物学酶和试剂是通过商业来源获得的。
细菌菌株和生长条件将大肠杆菌DH10B(GibcoBRL)生长在如Sambrook等(1989)所述的2xTY培养基中，如Paget等(1999)所述的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)生长在含有卡那霉素(25mg/L)的2xTY培养基中。载体pUC18是从New England Biolabs获得的。载体pKC1139在Practical Streptomyces Genetics，Kieser等，(2000)中描述。用100mg/L氨苄青霉素或50mg/L阿泊拉霉素(apramycin)选择大肠杆菌转化体。
将吸湿链霉菌MG2-10(WO 04/007709；Gregory等，2004)及其衍生物在28℃保存在培养基1琼脂平板(参见下文)上，并且如(Khaw等，1998)所描述的在TSBGM(含有1.0％葡萄糖和100mM MES的胰酶大豆肉汤，pH 6.0)中培养，需要时添加50mg/L阿泊拉霉素。
液体培养物生长在28℃，在锥形烧瓶或falcon管中，以300rpm的速度摇动。
培养方法所有菌株的孢子母液是在培养基1上生长之后制备的，保存在蒸馏水中的20％w/v甘油10％w/v乳糖中，并保藏在-80℃。通过将0.1mL的冷冻原液接种到装在250mL烧瓶中的50mL培养基2(参见下文)中来制备营养培养物。所述培养物在28℃、300rpm培养36至48小时。
培养步骤将营养培养物以0.5mL接种到装在50mL管中的7mL培养基3中。在26℃、300rpm培养进行7天培养。所选羧酸(″非天然起始物″或″天然起始物″)的供给/添加在接种24小时之后进行，并且以1mM供给，除非另有说明。
培养基1

然后通过在121℃高压灭菌20分钟来灭菌培养基。
培养基2RapV7种子培养基


然后通过在121℃高压灭菌20分钟来灭菌培养基。
灭菌之后在每7mL培养基中添加0.16mL 4％葡萄糖。
培养基3MD6培养基(发酵培养基)

灭菌之前将0.4mL Sigma α-淀粉酶(BAN 250)添加到1L培养基中。
培养基在121℃灭菌20分钟。
灭菌之后在每7mL培养基中添加0.35mL无菌的40％果糖和0.10mL L-赖氨酸(140mg/mL，溶解在水中，过滤灭菌)。
培养基4RapV7a种子培养基

然后通过在121℃高压灭菌20分钟对培养基进行灭菌。
培养基5MD6/5-1培养基(发酵培养基)

在121℃灭菌培养基30分钟。
灭菌之后每升添加15g果糖。
抗癌活性的体外生物分析在单层增殖试验中对一组12个人类肿瘤细胞系进行抗癌活性的化合物的体外评估，该评估在Oncotest Testing Facility，Institute for ExperimentalOncology，Oncotest GmbH，Freiburg进行。12个所选细胞系的特征归纳在表1中。
表1试验细胞系

癌试验细胞系是由人类肿瘤异种移植物建立的，如Roth等1999所描述。供体异种移植物的来源由Fiebig等1992描述。其他细胞系是从NCI(H460、SF-268、OVCAR-3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-468)获得或者从DSMZ，Braunschweig，德国(LNCAP)购买。
所有细胞系，除非另有说明，都在37℃在湿润空气(95％空气、5％CO2)中，在“已经混合”培养基中生长，该培养基含有RPMI 1640培养基、10％胎牛血清和0.1mg/mL庆大霉素(PAA，Clbe，德国)。
单层试验使用改进的碘化丙啶分析方法评估试验化合物对12个人类肿瘤细胞系生长的影响(Dengler等，1995)。
简要地，通过胰蛋白酶消化从指数期培养物中收获细胞，计数并平铺到96孔平底微量滴定板上，平铺的细胞密度取决于细胞系(5-10.000活细胞/孔)。恢复24小时之后使细胞恢复指数生长，将0.01mL培养基(每个平板6个对照孔)或含有39-去甲氧基雷帕霉素的培养基添加到所述孔中。每一种浓度重复平铺三次。39-去甲氧基雷帕霉素是以两种浓度(0.001mM和0.01mM)使用的。在连续培养4天之后，用0.2mL含水碘化丙啶(PI)溶液(7mg/L)取代含或不含39-去甲氧基雷帕霉素的细胞培养基。为了测定活细胞的比例，通过冷冻平板对细胞进行透化。解冻平板之后，使用Cytofluor 4000微量培养板读数器测量荧光(激发530nm，发射620nm)，提供与活细胞总数的直接关系。
生长抑制作用表达为处理/对照×100(％T/C)，并且用于选择细胞系。对于活性化合物来说，通过将化合物浓度对细胞活力作图来估算并且也提供了检查的整个细胞系组中的平均IC50& IC70值。
实施例1 工程菌株吸湿链霉菌MG7-9的分离i)质粒pALK83的制备将引物MG308 5′-GTCCTAGGTGATGTCCCGGCAACACG-3′(SEQ IDNO13)和MG309 5′-CACCTGCAGGCCCAACTCGGCCAGCTCGCT-3′(SEQID NO14)用于扩增雷帕霉素模块10酰基转移酶(rapAT10)上游的同源区(从雷帕霉素簇的nt11693到nt13289，如Schwecke等，1995所述)，使用从吸湿链霉菌NRRL5491制备的粘粒DNA(cos26，参见Schwecke等，1995)作为模板。用T4多核苷酸激酶对1596bp的PCR产物(SEQ ID NO15)进行磷酸化，并且连接到已经去磷酸化的用SmaI消化过的pUC 18中。转化入大肠杆菌DH10B之后，分离质粒pMG255-4。将引物MG3105′-CCTGGCCAGGAAAGACGAACACGATCCT-3′(SEQ ID NO16)和MG3115′-CGAAGCTTGAGCCGCTGGCGATCGTGGGA-3′(SEQ ID NO17)用于扩增雷帕霉素模块10AT下游的同源区(从雷帕霉素簇的nt14191到nt15742，如Schwecke等，1995所述)，使用从吸湿链霉菌NRRL5491制备的粘粒DNA(cos26，参见Schwecke等，1995)作为模板。用T4多核苷酸激酶对1551bp的PCR产物(SEQ ID NO18)进行磷酸化，并且连接到已经去磷酸化的用SmaI消化过的pUC18中。转化入大肠杆菌DH10B之后，分离质粒pMG256-1。通过序列分析验证每一种质粒的插入片段的完整性。
将质粒pCJR26(Rowe等，1998)和pMG256-1各自转化入大肠杆菌ET12567，并且分离未甲基化的(dam-，dcm-，hsdn-)质粒DNA。用AvrII/HindIII消化质粒pMG255-4，并且分离大约4.3kbp的片段；用MscI/AvrII消化去甲基化的pCJR26，并且分离大约1kbp的片段；用HindIII消化、用MscI部分消化去甲基化的pMG256-1，并且分离大约1.5kbp的片段。连接这三个DNA片段，并用于转化大肠杆菌DH10B。分离所得质粒pMG291-14。用HindIII/XbaI消化该质粒，并且分离大约4kbp的片段，连接到HindIII/XbaI消化过的pKC1139中，并且将所述DNA用于转化大肠杆菌DH10B。所得质粒pALK83包含模块2的雷帕霉素酰基转移酶结构域，其侧翼是允许同源重组入模块10的DNA区域，以通过双重组实现AT交换。
ii)工程菌株吸湿链霉菌MG7-9的分离用pALK83转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌-供体菌株。利用该菌株通过接合转化吸湿链霉菌MG2-10(WO04/007709；Gregory等，2004)。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在(patch)添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸(nalidixic acid)的培养基1上。然后将该贴片用于接种盛有含50mg/L阿泊拉霉素的TSBGM的烧瓶。在28℃将该培养物培养2天，然后在37℃培养2天。将该培养物在含有50mg/L阿泊拉霉素的培养基1的平板上进行划线，并且在37℃培养7天。将单一菌落重新贴在含有50mg/L阿泊拉霉素的培养基1的平板上，并且在37℃再生长7天。将所述贴片用于接种不含抗生素的TSBGM烧瓶，并且在37℃生长3天。将该培养物在培养基1的平板上划线，并且将单菌落用于贴在含和不含阿泊拉霉素(50mg/L)的培养基1的平板上，以便观察敏感度，其代表了涉及质粒主链损失的第二个重组事件。将十四个阿泊拉霉素敏感型贴片用于接种14×7mL的培养基2(rapV7)，并且将这些种子培养物在28℃生长3天。然后将这些培养物用于接种(将0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃培养5天，在24小时之后添加环己烷羧酸至最终浓度为1mM。通过LCMS分析所述培养物的提取物的雷帕霉素类似物的生产。发现九种独立的培养物能产生新型化合物，具有接近于17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的分子量。根据生产水平和鲁棒性选择所述培养物中的一种进行较大规模的培养，以分离所述新型化合物；将该菌株命名为吸湿链霉菌MG7-9。
iii)分析来自吸湿链霉菌MG7-9的新型雷帕霉素类似物根据以下分析数据，认为所观察到的新型雷帕霉素类似物是期望的17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素。正如所预料的，由于失去了甲基，所述新型雷帕霉素类似物的极性(保留时间5.9-6.2分钟)比39-去羟基前-雷帕霉素(保留时间6.35-6.95分钟)更高。
对MG7-9提取物进行的LCMS和LCMSn分析显示，所述新型雷帕霉素类似物的m/z比例比39-去羟基前-雷帕霉素低14个质量单位，与缺少一个甲基吻合。所观察到的离子[M-H-]810.8，[M+Na]+834.8，[M+K]+850.8。按照以前确定的碎裂途径(图4)(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University ofCambridge，2000)碎裂钠加合物，得到了预测的17-去甲基-39-去甲氧基前-雷帕霉素的离子。该质谱碎裂数据缩小了所述新型rapalogue的范围，其中在天然形式包括3个甲基的片段C16-C27中发生了甲基的丢失。这些甲基结合在C17(三烯)，C23(从三烯上去掉一个碳)和C25(从三烯上去掉3个碳)上。观察到了雷帕霉素的UV三烯特征，不过中央峰的UV最大值发生了偏移(由39-去羟基前-雷帕霉素的λ＝278nm变为λ＝270nm)。这强烈地说明了在所述三烯上的官能度已经发生了改变，因为这种波长的变化在C16(OH/OCH3)的官能度变化中没有被观察到；所观察到的变化与预期的C17上甲基的丧失保持一致。
还通过LC高分辨率-傅立叶转变-离子回旋共振，质谱分析(LC-FT-ICR-MS)分析了积累的产物。获得了母离子的钠加合物的精确质量数据(分析值834.51342(图5，A)，C47H73NO10Na的计算值834.51319，偏差0.28ppm)，以及关键子离子的质量数据，如下表所示(有关碎裂途径参见所附的图4)。

(还可参见图6)该质谱碎裂数据与17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素完全吻合。
iv)发酵所述新型雷帕霉素类似物用于分离所有菌株的孢子母液是在培养基1上生长之后制备的，保存在蒸馏水中的20％w/v甘油10％w/v乳糖中，并且在-80℃保存。通过将0.1mL的冷冻母液接种到装在250mL烧瓶中的50mL培养基4中来制备初级营养培养物。将该培养物在28℃以250rpm的速度摇动培养48小时。然后将该培养物在装在2000mL烧瓶中的400mL培养基4中进行继代培养，以提供二级营养培养物。将该培养物在28℃、250rpm培养24小时。
将营养培养物以7.5％v/v接种到装在20L发酵罐中的15L培养基5中(参见上文)。培养在26℃，0.5vvm≥30％溶解氧最小端速为1.18ms-1，最大端速为2.75ms-1进行6天。在接种之后24和48小时添加环己烷羧酸，以提供2mM/L的最终浓度。在接种48小时之后，加入200mL水中的9.5g L-赖氨酸。
v)提取和纯化将发酵培养液(12L)与等体积的甲醇一起搅拌2小时，然后离心使细胞沉淀(10min，3500rpm)。将上清液与DiaionHP20树脂(43g/L)一起搅拌1.5小时，然后过滤。用丙酮(总体积7.5L)分批洗涤所述树脂，以分离rapalogue，并且在真空中除去溶剂。然后将所得的浓缩水溶液(800mL)用水稀释到1L，并且用EtOAc(3×1L)萃取。在真空中除去溶剂，以得到粘性褐色提取物(10.9g)。将该提取物溶解在丙酮中(大约20mL)，涂在二氧化硅上，加样到硅柱(3×6.5cm直径)上，并且用丙酮/己烷(20％-40％)分步梯度洗脱。合并含有rapalogue的级份，并且在真空中除去溶剂。在Sephadex LH20上对残余物(840mg)进行进一步的层析，用10∶10∶1氯仿/庚烷/乙醇洗脱。将半纯化的rapalogue(151mg)溶解在乙腈(2.7mL)，离心(10min，13200rpm)并且通过反相(C18)制备型HPLC，使用Gilson HPLC，用21mL/min的60％乙腈/水洗脱Phenomenex 21.2×250mm Luna 5μm C18 BDS柱来进行纯化。合并大部分纯的级份(通过分析HPLC确定)并且在真空中除去溶剂，以得到17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素(10mg)。
vi)特征进行多种NMR实验，即1H、13C、APT、COSY、HMQC、HMBC、TOCSY。对这些数据进行的充分和深入的检查，能够对17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的两种旋转异构体(rotomer)的大部分质子和碳进行排布。烯属甲基共振的缺乏从1H NMR光谱中直接地表现出来。在COSY光谱中可以看出H16和烯属次甲基(没有出现在39-去羟基前-雷帕霉素的光谱上)之间的相关性，这证实了所述化合物缺少C-17上的甲基。图7中显示所述化合物每种已知的旋转异构体包含C17的部分的重要NMR相关性(在该结构酰胺部分的两者之间的差异没有示出)。
表217去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素的1H和13C NMR数据



a，b，c，d，e这些分配可以相互交换1H-NMR的NMR数据是在CDCl3中在500MHz获得的，13C-NMR的NMR数据是在CDCl3中在125MHz下获得的。
实施例2-将启动酸系列供给吸湿链霉菌MG7-9表3用于系列供给实验的酸的来源

方法A合成(1R*，3R*，4R*)-3，4-二羟基环己烷羧酸
(1R*，3R*，4R*)-3，4-二羟基环己烷羧酸可以方便地从商业上可得到的外消旋3-环己烯羧酸获得。通过用间-氯过苯甲酸处理将该酸环氧化，并且通过添加碱(三乙胺)原位转化成(1R*，3R*，4R*)-4-羟基环己烷-1，3-碳内酯，因此建立了相对立体化学。然后通过氢氧化钾水溶液的作用水解这种内酯，并且用离子交换树脂纯化最终产物(Corey，E.J.and Huang，H.1989)。
方法B合成乙基(1R*，5R*)5-羟基环己-3-烯羧酸酯 以外消旋形式制备标题化合物，通过从环己-3-烯羧酸制备(1R*，3R*，4R*)-4-碘环己烷-1，3-碳内酯，然后用碱DBU(1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)处理以消除HI。然后用溶解在乙醇中的氢氧化钾处理所得(1R*，5S*)-环己-3-烯-1，5-碳内酯，以得到标题化合物(Marshall，J.A.，and Shiping，X.，1995)。
方法C合成乙基(1R*，4R*)-3-氟-4-羟基环己烷羧酸酯 将按照方法A制备的(1R*，3R*，4R*)-4-羟基环己烷-1，3-碳内酯，作为(1R*，3R*，4R*)-4-(1-四氢吡喃基)氧环己烷-1，3-碳内酯进行保护，用乙醇中的氢氧化钾处理，以产生乙基(1R*，3R*，4R*)-3-羟基-4-(1-四氢吡喃基)氧环己烷羧酸酯。通过激活-取代方法(Yin等，2004)，将氟导入3位，并且用酸性DOWEX树脂除去4-(1-四氢吡喃基)基团。
i)系列添加实验吸湿链霉菌MG7-9在28℃在培养基1上生长14天，直到发生孢子形成。将0.5cm截面直径的琼脂、菌丝体和孢子从平板上取出，并且转移到装在带有泡沫塞的50mL falcon管中的7mL培养基2(rapV7)中，并且在28℃以300rpm摇动培养48小时。然后将0.5mL该种子培养物转移到装在具有泡沫塞的50mLfalcon管中的7mL培养基3(MD6)中，并且在26℃以300rpm摇动生长24小时。将溶解在0.05mL甲醇中的每一种启动酸添加到合适培养物中，至2mM的最终浓度(启动酸的列举参见表4)。然后在26℃将该培养物再生长4天。从每一个烧瓶中取出1mL培养物，并且添加到装在2mL eppendorf试管中的1mL乙腈中，在室温下振荡1小时，然后以13,000rpm在microfuge上离心15分钟。取出0.2mL的上层放入HPLC试管，并且使用UV和LCMS检测通过HPLC进行分析。
表4提取物分析 *＝还未确定整合的启动酸中羟基和氟基基团的区域化学和/或立体化学；这反映在下面的结构示意图上。然而，应当注意的是，该示意图旨在反映所获得的单一产物，如果需要的话，本领域技术人员在阅读以上实施例之后能够分离并且鉴定该产物。
实施例3-接合载体pLL150的构建。
用SpeI和BstEII消化质粒pSGset1(WO 04/007709)，并且分离2.481kbp的片段，将该片段与同样用SpeI和BstEII消化的载体pRT801(Gregory等，2003)连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化筛选菌落，并且分离最终质粒pLL150。参见图8。
实施例4-通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9来分离17-去甲基雷帕霉素i)制备含有雷帕霉素辅助基因rapK，rapI，rapJ，rapN，rapO，rapM，rapQ和rapL(rap KIJN/OMQL)的补偿质粒pLL158。
用SpeI和HindIII消化质粒pSGsetrapKIJN/OMQL(WO 04/007709)，并且分离8.516kbp的片段(包含rap KIJN/OMQL)，并且与同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定并验证最终的质粒pLL158。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLL158)菌株用pLL158转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。在培养基1(含有50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸)上分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在含有50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。这些贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本(plug)接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃以300rpm培养2天。然后将这些培养物用于接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃以300rpm培养6天。通过添加等体积的乙腈从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。然后通过LC-MS对样品的17-去甲基雷帕霉素产量进行分析评估。
iii)17-去甲基雷帕霉素的分析根据LCMS数据推测，所观察到的新型rapalogue是17-去甲基雷帕霉素。这些数据表明，所述新型rapalogue比雷帕霉素小14个质量单位，与缺少一个甲基吻合。观察到的离子[M-H]898.7，[M+Na]+922.7，[M+K]+938.6。观察到了雷帕霉素的UV三烯特征，但是中央峰的UV最大值发生了偏移(由雷帕霉素的λ＝278nm变为λ＝270nm)。
iv)17-去甲基雷帕霉素的发酵用于分离通过将0.1mL的冷冻母液接种到装在250mL烧瓶中的50mL培养基4中制备初级营养培养物。该培养物在28℃以250rpm摇动培养48小时。然后将该培养物在2000mL烧瓶中的400mL培养基4中进行继代培养，以得到二级营养培养物。该培养物在28℃、250rpm培养24小时。
将营养培养物以7.5％v/v接种到装在20L发酵罐中的15L培养基5(参见上文)中。在26℃培养6天，0.5vvm≥30％溶解氧最小端速为1.18ms-1，最大端速为2.75ms-1。在接种48小时之后，加入200mL水中的9.5g L-赖氨酸。
v)提取和纯化将发酵液(12L)与等体积的甲醇一起搅拌2小时，然后离心使细胞沉淀(10min，3500rpm)。将上清液与DiaionHP20树脂(43g/L)一起搅拌1.5小时，然后过滤。用丙酮(总体积7.5L)分批洗涤树脂，以洗脱rapalogue，并且在真空中除去溶剂。用水将所得的含水浓缩物(～800mL)稀释到1L，并且用EtOAc(3×1L)萃取。在真空中除去溶剂，以得到粘稠的褐色提取物。
将所述提取物溶解在丙酮(大约20mL)中，涂在二氧化硅上，加样到二氧化硅柱(3×6.5cm直径)上，并且用丙酮/己烷(20％-40％)分步梯度洗脱。合并含有rapalogue的级份，并且在真空中除去溶剂。将残余物在Sephadex LH20上进一步层析，用10∶10∶1氯仿/庚烷/乙醇洗脱。将半纯化的rapalogue溶解在乙腈(2.7mL)中，离心(10min，13200rpm)并且通过反相(C18)制备型HPLC，使用Gilson HPLC，用21mL/min的60％乙腈/水洗脱Phenomenex 21.2×250mmLuna 5μm C18 BDS柱来进行纯化。合并大部分纯化级份(通过分析HPLC确定)，并且在真空中除去溶剂，以得到17-去甲基雷帕霉素(133mg)。
vi)鉴定对分离的产物进行LCMSn分析，并且碎裂钠加成物得到了17-去甲基雷帕霉素的预测的离子，该碎裂是基于确定的碎裂途径(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge，2000)。该质谱碎裂数据将所述新型rapalogue中发生了甲基丢失的区域范围缩小到了片段C16-C27上。进行了一系列NMR实验，即1H、13C、APT、COSY、HMQC、HMBC、TOCSY。对上述数据进行全面和深入的检查，可以得到对17-去甲基雷帕霉素的排布。烯属甲基共振的缺乏提供了特殊的信息，并且观察到了重要的相关性，并描述于下表5中。
表517-去甲基雷帕霉素的1H和13C NMR数据




●在CDCl3中获得的NMR数据，1H-NMR的数据是在500MHz下获得的，13C-NMR是在125MHz下获得的。
实施例5通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9来分离9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素i)制备含有雷帕霉素辅助基因rapK，rapN，rapO，rapM和rapL(rapKN/OML)的补偿质粒pLL174用SpeI和HindIII消化质粒pSGsetrapKN/OML(WO 04/007709)，分离5.795kbp的片段(包含rap KN/OML)，并且连接到同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150上。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLL174。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLL174)菌株用pLL174转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。该贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃以300rpm培养2天。然后使用这些培养物接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃以300rpm培养6天。
通过添加等体积的乙腈从这些培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS评估9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素的生产。
iii)9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素的分析根据LCMS数据，推测观察到的新型rapalogue是9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-O-去甲基雷帕霉素。这些数据表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小42个质量单位，与缺少3个甲基吻合。观察到的离子[M-H]856.8，[M+Na]+880.7，[M+K]+896.6。
实施例6通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9来分离9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素i)制备包含雷帕霉素辅助基因rapK，rapI，rapN，rapO和rapL(rap KIN/OL)的补偿质粒pLL173用SpeI和HindIII消化质粒pSGsetrapKIN/OL(WO 04/007709)，分离5.624kbp的片段(包含rap KIN/OL)，并且与同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLL173。
ii)吸湿链霉菌MG7-9(pLL173)菌株的分离用pLL173转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。所述贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃以300rpm培养2天。然后将这些培养物用于接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培养6天。
通过添加等体积的乙腈从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS评估所述培养物的9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素的产量。
iii)9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素的分析根据LCMS数据，推测观察到的新型rapalogue是9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基雷帕霉素。以上数据表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小42个质量单位，与缺少3个甲基吻合。观察到的离子[M-H]856.8，[M+Na]+880.7，[M+K]+896.6。
实施例7通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9并且用启动酸补偿生产培养基来分离17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制备包含雷帕霉素辅助基因rapI，rapJ，rapN，rapO，rapM，rapQ和rapL(rap IJN/OMQL)的补偿质粒pLL178。
用SpeI和HindIII消化质粒pMG262(WO 04/007709)(表达基因rapI，rapJ，rapN，rapO，rapM，rapQ和rapL)，分离7.259kbp的片段(包括rap IJN/OMQL)，并且与同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLL178。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLL178)菌株用pLL178转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。所述贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃，以300rpm培养2天。然后将培养物用于接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃，以300rpm培养6天。在培养基3中生长24小时之后，在培养物中添加环己烷羧酸至最终浓度为1mM。
通过添加等体积的乙腈，从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS评估所述培养物的17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的产量。
iii)17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析根据LCMS数据，推测观察到的新型rapalogue是17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。以上数据表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小30个质量单位，与缺少1个甲氧基吻合。观察到的离子[M-H]868.3，[M+Na]+892.3，[M+K]+908.3。观察到了雷帕霉素的UV三烯特征，但是中央峰的UV最大值发生了偏移(由雷帕霉素的λ＝278nm变为λ＝270nm)。
iv)发酵17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素用于分离通过将0.1mL的冷冻原液接种到装在250mL烧瓶中的50mL培养基4中来制备初级营养培养物。将培养物在28℃以250rpm摇动培养48小时。然后将培养物在装于2000mL烧瓶中的400mL培养基4中继代培养，以提供二级营养培养物。所述培养物在28℃，250rpm培养24小时。
将营养培养物以7.5％v/v接种到装在20L发酵罐中的15L培养基5中(参见上文)。在26℃，0.5vvm≥30％溶解氧最小端速为1.18ms-1，最大端速为2.75ms-1培养6天。在接种48小时之后，加入200mL水中的9.5g L-赖氨酸。
v)提取和纯化将发酵液(12L)与等体积的甲醇一起搅拌2小时，然后离心使细胞沉淀(10min，3500rpm)。上清液与DiaionHP20树脂(43g/L)一起搅拌1.5小时，然后过滤。用丙酮(总体积7.5L)分批洗涤所述树脂，以洗脱rapalogue，并且在真空中除去溶剂。用水将所得到的含水浓缩物(～800mL)稀释到1L，并且用EtOAc萃取(3×1L)。在真空中除去溶剂，以得到粘稠的褐色提取物。
将提取物溶解在丙酮(大约20mL)中，涂在二氧化硅上，加样到二氧化硅柱(3×6.5cm直径)上，并且用丙酮/己烷(20％-40％)以分步梯度洗脱。合并含有rapalogue的级份，并且在真空中除去溶剂。残余物用Sephadex LH20进一步层析，用10∶10∶1的氯仿/庚烷/乙醇洗脱。将半纯化的rapalogue溶解在乙腈(2.7mL)中，离心(10min，13200rpm)并使用Gilson HPLC通过反相(C18)制备型HPLC纯化，用21mL/分钟的60％乙腈/水洗脱Phenomenex 21.2×250mm Luna5μm C18 BDS柱。合并大部分纯化的级份(通过分析HPLC确定)，并且在真空中除去溶剂，以得到17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素(30mg)。
vi)鉴定对分离的产物进行LCMSn分析，并且碎裂钠加成物得到17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的推测的离子，该碎裂是基于确定的碎裂途径(J.A.Reather，Ph.D.Dissertation，University of Cambridge，2000)。该质谱碎裂数据将所述新型rapalogue中发生了甲基丢失的区域范围缩小到了片段C16-C27上，以及发生了甲氧基丢失的区域范围缩小到了片段C28-C44上。进行多种NMR实验，即1H、13C、APT、COSY、HMQC、HMBC、TOCSY。对上述数据进行的全面和深入的检查，可以实现17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的排布。烯属甲基共振的缺乏提供了特别的信息，并且质子NMR排布如下面的表6所示。
表617-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的1H NMR数据


在CDCl3中在400MHz下测定的NMR数据实施例8-通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9并且用启动酸补充生长培养基来分离16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制备包含雷帕霉素辅助基因，rapI，rapJ，rap N/O，rapQ和rapL(rapIJN/OQL)的补偿质粒pLL184用SpeI和HindIII消化质粒pMG260(WO 04/007709)(表达基因rapI，rapJ，rapN，rapO，rapQ和rapL)，分离6.3kbp的片段(包括rap IJN/OQL)，并且连接到同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150上。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLL184。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLL184)菌株用pLL184转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。所述贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃，300rpm培养2天。然后将培养物用于接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培养6天。在培养基3中生长24小时之后，将环己烷羧酸添加到培养物中，至最终浓度为1mM。
通过添加等体积的乙腈，从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS分析所述培养物的16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的产量。
iii)16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析根据LCMS数据，推测观察到的新型rapalogue是16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。以上数据表明，所述新型rapalogue比17-去甲基雷帕霉素小44个质量单位，与缺少1个甲氧基和1个甲基吻合。观察到的离子[M-H]854.2，[M+Na]+878.3，[M+K]+894.3。
实施例9-通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9并且用启动酸补充生产培养基来分离16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制备包含雷帕霉素辅助基因rapJ，rap N/O，rapQ和rapL(rap JN/OQL)的补偿质粒pLSS249用EcoRI和BglII消化质粒pSGsetrapKIJN/OQL(WO 04/007709)，分离3.774kbp的片段(包括rap JN/OQL)，并且与用同样方法消化的pSGsetrapJ连接(WO04/007709)。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定质粒pLSS238。进一步用SpeI和HindIII消化质粒pLSS238，并且分离7.311kbp的片段(包括rap JN/OQL)，并且与同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLSS249。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLSS249)菌株用pLSS249转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。所述贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃，300rpm培养2天。然后将培养物用于接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培养6天。在培养基3中生长24小时之后，在培养物中添加环己烷羧酸，至最终浓度为1mM。
通过添加等体积的乙腈，从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS分析所述培养物的16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的产量。
iii)16-O-去甲基-17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析对所述新型rapalogue进行的LCMS分析表明，其与实施例8所述的rapalogue具有相同的质量和保留时间。
实施例10通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9并且用启动酸补充生产培养基来分离9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素。
i)制备包含雷帕霉素辅助基因rapM，rap N rapO和rapL(rap MN/OL)的补偿质粒pLL191分离质粒pMG237质粒pSGsetrapKJMN/O是pSET152-衍生的质粒，其中将基因rapK，rap J，rapM，rapN和rapO置于actI启动子之下，该启动子自身是由同样存在于所述质粒上的actII-ORF4控制的。这与用于本研究的其他含有盒的质粒的情况类似。用BglII/XbaI消化质粒pSGsetrapKJMN/O，并且将分离的载体片段与pSGLitrapLhis的1kbXbaI/BglII片段连接。分离质粒pMG237(表达rapK，rapJ，rapM，rapN，rapO，和rapL)。
用限制性内切酶SpeI和HindIII消化质粒pMG237(表达基因rapK，rapJ，rapM，rapN，rapO和rapL)，分离6.841kbp的片段，并且与同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定质粒pLL171。用AsiSI和NheI消化质粒pLL171，分离5.293kbp(包含rap MN/OL)，并且与同样用AsiSI和NheI消化的pSGsetrapM(WO 04/007709)连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定质粒pLL180。质粒pLL180表达基因rapM，rap N/O和rapL。通过用SpeI和HindIII消化，将所述质粒转入接合载体pLL150。从pLL180分离4.785kbp的SpeI/HindIII片段，并且与以相同方法消化的pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLL191。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLL191)菌株用pLL191转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。所述贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃，300rpm培养2天。将培养物用于接种(0.5mL接种到7mL中)培养基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培养6天。在培养基3中生长24小时之后，在培养物中添加环己烷羧酸，至最终浓度为1mM。
通过添加等体积的乙腈，从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS分析所述培养物的9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素的产量。
iii)9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基-雷帕霉素的分析根据LCMS数据，推测观察到的新型rapalogue是9-脱氧-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。以上数据表明，所述新型rapalogue比17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素大30个质量单位，与增加了一个甲基和一个羟基吻合。观察到的离子[M-H]840.6，[M+Na]+864.6，[M+K]+880.6。
实施例11-通过用辅助基因盒补偿吸湿链霉菌MG7-9并且用启动酸补充生产培养基来分离9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。
i)制备包含雷帕霉素辅助基因rapI，rap N/O和rapL(rap IN/OL)的补偿质粒PLL190用BglII消化质粒pSGsetKIN/OL，分离3.272kbp的片段(包含rap IN/OL)，并且与用BglII消化且用碱性磷酸酶处理的质粒pSGsetrapI(WO 04/007709)连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定质粒pLL177。用SpeI和HindIII进一步消化质粒pLL177，分离5.624kbp的片段(包含rap IN/OL)，并且与同样用SpeI和HindIII消化的接合载体pLL150连接。在转化入大肠杆菌DH10B之后，通过限制性内切酶消化鉴定和验证最终的质粒pLL190。
ii)分离吸湿链霉菌MG7-9(pLL190)菌株用pLL190转化含有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567，以制备用于接合的大肠杆菌供体菌株。该菌株用于通过接合转化吸湿链霉菌MG7-9。分离阿泊拉霉素抗性菌落，并且贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酸的培养基1上。这些贴片在28℃生长，然后再次贴在添加了50mg/L阿泊拉霉素的培养基ISP3上，并且在28℃生长14-21天。使用来自每个贴片的圆柱状样本接种装有添加了50mg/L阿泊拉霉素的7mL培养基2(RapV7)的独立falcon管。所述种子培养物在28℃，300rpm培养2天。然后将培养物用于接种(0.5mL接种到7mL)培养基3(MD6)，并且在26℃，300rpm培养6天。在培养基3中生长24小时之后，在培养物中添加环己烷羧酸，至最终浓度为1mM。
通过添加等体积的乙腈，从所述培养物中提取次级代谢产物。通过离心除去细胞碎片。通过LCMS分析所述培养物的9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的产量。
iii)9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素的分析根据LCMS数据，推测观察到的新型rapalogue是9-脱氧-16-O-去甲基-17-去甲基-27-O-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素。这些数据表明，所述新型rapalogue比17-去甲基-39-去羟基前-雷帕霉素大16个质量单位，与增加了一个羟基吻合。观察到的离子[M-H]826.7，[M+Na]+850.6，[M+K]+866.6。
实施例12抗癌活性的体外生物分析在单层增殖试验中对一组12个人类肿瘤细胞系的17-去甲基-39-去甲氧基雷帕霉素抗癌活性的体外评估，使用改进的碘化丙啶分析方法如上所述进行。
结果如下面的表7所示，每一个结果表示两次重复实验的平均值。表8显示在所有试验的细胞系中试验化合物和雷帕霉素的IC50和IC70。
表7

表8

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序列表<110>比奥蒂卡科技有限公司(Biotica Technology Ltd)<120>17-去甲基雷帕霉素及其类似物、它们的制备方法和它们作为免疫抑制剂、抗癌剂、抗真菌剂等的用途<130>SIOY/P30824WO<150>GB 0417852.1<151>2004-06-11<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>1Phe Pro Gly Glr Gly1 5<210>2<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>2
tttcccgggc aggga 15<210>3<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>3Phe Pro Gly Gln Gly1 5<210>4<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>4ttcccgggtc agggg 15<210>5<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>SPhc Pro Gly Gln Gly1 5
<210>6<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>6tttcctggcc agggg 15<210>7<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>7Ala Val Leu Gly Asp1 5<210>8<211>15<212>DNA<223>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>8gcggtgctgg gtgat 15<210>9
<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>9Ala Val Leo Gly Asp1 5<210>10<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>10gcggtgctgg gtgat 15<210>11<211>5<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>11Ala Val Leu Gly Asp1 5<210>12<211>15
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>12gcggtcctag gtgat 15<210>13<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工产生的限制位点<400>13gtcctaggtg atgtcccggc aacacg 26<210>14<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>14cacctgcagg cccaactcgg ccagctcgct 30<210>15<211>1596<212>DNA<213>人工的<220>
<223>来自AT10的同源性PCR产物的左区，由吸湿链霉菌使用SEQ ID NOs 1和2扩增，其包含附加的限制位点
<400>15cacctgcagg cccaactcgg ccagcccgcr gatcagcgcc ccgtccgggg cgctgcggga 60cagcaacagc agatgacgca caccgcgttc ggccaccagg tgccgggcgg cgatccccgc120cagcacaccc gaaccaccgg tgatcagaac cgtgccatcc ggatcccaga cgccttcagg180ctcaggctca gcgacgcccg tacgagtcag tcgcggtgcc tcgtaccggc cgtcgatgac240ccgcagccgc ggctcatcga gcccgacggt ggcggccagt tggtccgggg tgagggtgtc300gtcgtcactt tccaccagga cgaaccggcc cgggtgctcc gactgagccg aacgcatcaa360ccccgacacc gcggctgcgg ccaaaccagt tccggtccgc acaaccagcg tactgtcagt420gaaacgctcc cccgccagcc acacctgcac cgcctgcaga acctcagcgg tcagccgacg480agtctgtgcc agcgggtcac cgctgtcggg gagtgcggtg aacacaacga catcgggcat540cggcacctcg ccgtccgcga ggtcttcaaa cttgcccacc gtcacgccga cctgctggga600gaccgggatc tccgtccacg tcagggcgaa cagatcatcg acagcagaac cgagcgcatc660ggctgccacc ggacgggtca ccagcgagcc gatggtggcc accggccgac cgatgtcatc720agcgacccgc acaccccagc catccgcgac ccgtgtcatc gcgacccgca gcgtggccga780gccagtgaca tggacctgga cgtggttcca ggagaacggc aaccgcacgg tgtcgcggtc840ggcatcgggt gtgttcagga tcccggcgtg cagggcggca tccaacaccg cagggtggac900ggcgaatcgt gccgcgtcct gggtctgctc ctcagccaga gcaacctcgg cgaagacggt960gtcaccatca cgccacgcgg cctgcaaacc ctggaaggca ggtccgtact cgtaacccgc 1020cctggtcagc tggtcgtaga agcctgccac gtccaccggc ttggcctgcg caggtggcca 1080cgcggtgagg tccgccgttg gcacagtcgt gtcggacacg ctgacggtgg cggaaacgtg 1140
ccggacccag gcatcggcgc tgtccgcccg ggagaagacc gtcaccgcgc ggtgtccgga1200ttcgtcggcc tcgccgacgg atacggacag ttgcacaccg ccggtctgcg gcagcagaag1260cggggtttcg acgatcagct cgtcaacgac gtcgcagccc acctcatcag ccgcgcggac1320aaccagctcc acaaacccgg taccgggcag caggacactg ccccggaccg cgtgatcagc1380cagccacgcg tgggtggcca gtgatacccg cccggtcagc atcacaccat ccgaacccgg1440catcgccagc accgcaccca gcaacggatg gcccaccgca tccagacccg cccccgacac1500atcggcagac cggccggcct cagcccaata ccgctggtgc tggaacgcgt acgtcggaag1560atccagcacc cgtgttgccg ggacatcacc taggac 1596<210>16<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>16cctggccagg aaagacgaac acgatcct 28<210>17<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>17cgaagcttga gccgctggcg atcgtggga29
<210>18<211>1550<212>DNA<213>人工的<220>
<223>来自AT10的同源性PCR产物的右区，由吸湿链霉菌使用SEQ ID NOs 1和2扩增，其包含附加的限制位点<400>18cctgccagga aagacgaaca cgatcctggg gtcggacacc gcggtgccgg tgacggtctc 60atctccaagg agtacggcgc ggtgctcgaa caccgaccgt gtcaccgcca gcgtcgatgc120cacagcccgt atatccactc cgggogacgc cgccaggtag gcgcggagcc ggtcttcgtg180ttcggtcagg gcgggctggg tcttggccga tatcaccagc ggcaccagtt ccgaaaccag240tacgggtgta gagccagccg tgtcgcccac agactgtgcc ggtgcactct caaggatgac300gtgggcgtta gtgccactga tcccgaacga cgacacacct gcccgacggg gtcggccggt360ctccggccac ggctggttct ccgccaccag ctcgaccgca cccgccgacc agtccacatg420ccgcgacggc tcatccacat gcaacgtgcg cggcaccatg ctgtgctgca gggccatcac480catcttgatg acacccgaca cacctgcggc agcctgggta tggccgacgt tcgacttcag540cgatcccagc agcagcggct ccccgcggcc ctggccgtaa gtagcgatca ccgcctgggc600ctcgatcggg tcacccagcg tcgtacccgt gccgtgcgcc tcgaccacat ccacctcgtg660cggcgccagg cccgcgttgc tgagagcggc ccggatcacc cgctgctgcg aaggaccgtt720cggcgcggac aggccgttcg acgcaccgtc ctggttcacc gccgagctac ggaccaccgc780caatatctgg tgaccgttgg cctgagcatc cgacaaacgc tccaccaata ggacgccgac840gccctcagcc caccccgtgc cgtccgcggc gtcagcgaac gccttgcacc ggccatcggc900
tgacaagcct cgctgccgcg agaactccac gaaagtctgc ggcgtggcca tcacggtcac 960gccgccgscc agggccagcg aacacccacc ctgtcgcagg gcataccccg cctgatgcaa1020cgccaccagc gacgacgaac acgccgtgtc caccgtgaac gcgggacctt cgagaccgaa1080gaagtacgac acccggcccg acaacacact cgccgcacca gcagttgtcc cgaagccgcc1140gaggtcggca ccgatgccgt agccaccggg gtaagcacot atgaagacgc cggtgtcgct1200gccgcgtacg gaaccgggct cgatcccggc ccgctcgaac gcctcccagg acacctcaag1260catcaaccgc tgctgcggat ccatcgccaa cgcctcacgc ggactgatcc cgaagaacga1320ggcgtcgaaa ccggccgcgg catccaggaa gccgccctgc acgctgtagg acttcccggg1380cgcgtccggg tccggatcgt acaggttctc gacgtcccag ccgcggtcgg ttgggaagcc1440ggaaatcgcg tccgtaccgg actcgaccaa gcgccacaga tcctccggcg acgagactcc1500accgggtagg cggcaggcca ttcccacgat cgccagcggc tcaagcttcg 1550
权利要求
1.17-去甲基雷帕霉素及其类似物。
2.如权利要求1的化合物，它具有以下结构式 其中x表示直接键，-CH2-，-S-CH2-，-CH2-S-或-S(＝O)-CH2-；或-CHR5-x-CHR6-表示 R1表示＝O或(H，H)；R2表示OH或OMe；R3表示H，OH或OMe；R4表示选自下组的结构片段A，B，C，D，E和F， 其中，波形线表示片段结合位置，R7表示H，OH或OMe和R8表示H，OH，OMe，卤基，硫醇或C1-4烷基；或R4还可以表示5-7-元杂环，包括选自下组的一个或多个杂原子O，S和N，所述杂环任选地用选自C1-4烷基，OH，F和Cl的一个或多个取代基取代；和R5和R6各自独立地为H或OH，或其可以药用的衍生物。
3.如权利要求1的化合物，其中，R4表示选自下组的结构片段如权利要求1中限定的A，B，C，E和F，其中，R7表示H，OH或Ome，和R8表示H，OH，OMe，Cl或F。
4.如权利要求3的化合物，其中，R4表示选自下组的结构片段A(i)，C(i)，E(i)和F(i) 其中，R7表示H或OH，而R8表示H，OH或OMe。
5.根据前述权利要求中任意一项的化合物，其中当R5表示OH时，R6表示H，而当R6表示OH时，R5表示H。
6.根据前述权利要求中任意一项的化合物，其中x表示直接键或CH2。
7.根据前述权利要求中任意一项的化合物，其中x表示CH2。
8.根据前述权利要求中任意一项的化合物，其中R2表示OH。
9.根据前述权利要求中任意一项的化合物，其中R1表示(H，H)，R2表示OH，R3表示H，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7和R8都表示OH，而x表示CH2。
10.根据权利要求2的化合物，其中R1表示(H，H)，R2表示OH，R3表示H，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，而x表示CH2。
11.根据权利要求2的化合物，其中R1表示(H，H)或＝O，R2表示OH或OMe，R3表示OH或OMe，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，OH或OMe，而x表示CH2。
12.根据权利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH或OMe，R3表示H，OH或OMe，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示F或Cl，而x表示CH2。
13.根据权利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH，R3表示OMe，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，而x表示CH2。
14.根据权利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH，R3表示OH，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示H，而x表示CH2。
15.根据权利要求2的化合物，其中R1表示＝O，R2表示OH，R3表示OMe，R4表示如权利要求4中限定的结构片段C(i)，所不同的是R7表示OH，而R8表示OMe，而x表示CH2。
16.如权利要求1-15中任意一项限定的化合物在医药中的用途。
17.根据权利要求1-15中任意一项的化合物在制备用于诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病和血管疾病的药品中的用途。
18.药物组合物，其包含根据权利要求1-15中任意一项的化合物或其可以药用的盐和可以药用的载体。
19.用于产生根据权利要求1或2所述的17-去甲基雷帕霉素或其类似物的方法，所述方法包括(a)用丙二酰-CoA-特异性AT结构域取代雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域，(b)在合适的宿主细胞中表达工程改造的雷帕霉素PKS，(c)在产生17-去甲基雷帕霉素或其类似物的条件下培养所述宿主细胞，包括任选地提供外源前体，(d)任选地分离由此产生的化合物。
20.用于制备包括编码工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇的重组菌株的方法，其中，模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代。
21.根据权利要求19或20的方法，其中所述模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域被来自下列簇中的一种的丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代雷帕霉素，莫能菌素，FK506，红霉素，FK520，两性霉素，安哥拉霉素，泰乐菌素，′hyg′，FK523，meridamycin，antascomicin，FK525和tsukubamycin。
22.根据权利要求21的方法，其中所述丙二酰-CoA特异性AT结构域选自下列簇中的一种雷帕霉素，莫能菌素和FK506。
23.根据权利要求22的方法，其中所述AT结构域选自下组来自雷帕霉素模块2的AT结构域，来自莫能菌素模块3的AT结构域，来自莫能菌素模块6的AT结构域，来自莫能菌素模块8的AT结构域，来自FK506模块3的AT结构域和来自FK506模块7的AT结构域。
24.根据权利要求23的方法，其中所述丙二酰-CoA特异性AT结构域来自雷帕霉素的模块2。
25.根据权利要求19-24中任意一项的方法，其中所述方法包括以下附加步骤(a)分离作为具有合适的侧翼限制位点的单一DNA片段要导入的AT，(b)利用合适的限制位点扩增并且分离与目标AT的侧翼序列同源的DNA序列的区域，(c)将步骤(a)和(b)所述三种DNA片段连接在一起，以得到LHS同源性，随后是供体AT结构域，随后是RHS同源性的框内序列，(d)将来自步骤(c)的完整序列导入用于导入宿主菌株的载体，以得到最终质粒，所述质粒包括i)用于接合的oriT，ii)一种或多种抗性标记，iii)温度敏感型复制起点，从而可通过在37℃培养来选择整合体，和iv)大肠杆菌复制起点，(e)使用上面(d)中所述的最终质粒通过接合来转化所述宿主菌株，(f)通过对相关抗生素的抗性选择转化体，(g)通过在37℃培养，用抗生素选择来产生初级整合体，(h)同样在37℃，通过在不进行抗生素选择的条件下的生长来筛选次级重组体，(i)通过产生目标产物的能力鉴定需要的菌株，和(j)通过标准方法任选地验证所述菌株的遗传学。
26.制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)根据权利要求20制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，和；(b)在适合聚酮化合物产生的条件下将非天然启动酸供给所述重组菌株。
27.制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)根据权利要求20制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)另外，将选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，和(c)培养由此获得的菌株，如果需要的话，任选地在存在外源前体的条件下培养，以产生17-去甲基雷帕霉素类似物。
28.制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)根据权利要求20制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)另外将选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)沿反式方向重新导入所述雷帕霉素辅助基因的全部或亚组，以补充或部分补充所述缺失，和(d)培养由此获得的菌株，如果需要的话，任选地在存在外源前体的条件下培养，以产生17-去甲基雷帕霉素类似物。
29.制备17-去甲基雷帕霉素类似物的方法，所述方法包括(a)根据权利要求20制备重组菌株，其中所述雷帕霉素PKS的模块10的甲基丙二酰-CoA特异性AT结构域已经被丙二酰-CoA特异性AT结构域所取代，(b)另外将选自rapI，rapJ，rapK，rapL，rapM，rapN，rapO和rapQ中的一个或多个雷帕霉素辅助基因缺失或失活，(c)任选地沿反式方向重新导入所述雷帕霉素辅助基因的全部或亚组，从而补充或部分补充所述缺失，和，(d)在适合聚酮化合物生产的条件下将非天然启动酸供给所述重组菌株。
全文摘要
本发明涉及聚酮化合物和其他天然产物的生产，并且涉及化合物文库和单个的新型化合物。因此，一方面，本发明提供了17－去甲基雷帕霉素及其类似物，它们的生产方法，包括重组菌株，以及本发明的化合物的分离和用途。另一方面，本发明提供了17－去甲基雷帕霉素及其类似物在诱导或维持免疫抑制，刺激神经元再生或治疗癌症、B－细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维变性疾病，和调控伤口愈合中的用途。
文档编号C07D273/00GK101056880SQ200580034633
公开日2007年10月17日 申请日期2005年8月11日 优先权日2004年8月11日
发明者马修·A·格雷戈里, 克里斯蒂娜·J·马丁 申请人:比奥蒂卡科技有限公司