用于检测mgmt基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法，属于生物【技术领域】。公开了MGMT基因甲基化和乙酰化引物，试剂盒和使用方法。本发明公开的引物是根据人类MGMT基因启动子序列设计的特异性引物，可使用相对应的试剂盒，通过RT-PCR快速、准确、高灵敏的检测MGMT基因启动子甲基化和乙酰化。
【专利说明】用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其 检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物【技术领域】，涉及基因检测的引物和试剂盒，尤其涉及一种用 于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的引物和试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 机体06-甲基鸟嘌呤转移酶（MGMT)是机体的特异性DNA损伤修复酶，能够将 06-MeG转移到自身145位半胱氨酸残基上，特异性修复烷化剂损伤，而自身不可逆性失活。 MGMT水平与肿瘤细胞DNA损伤修复相关。MGMT基因定位于10q26上，全长170kb，含5外 显子，4个内含子，其中第1个外显子中是启动子区，含有较多的CG序列，但缺乏TATA盒和 CAAT盒。MGMT基因启动子区甲基化和乙酰化是MGMT表达重要调控机制。MGMT基因甲基 化是MGMT蛋白表达缺失的重要原因。MGMT基因乙酰化能够通过甲基化结合蛋白影响细胞 染色质变化，与核转录因子相互作用，使蛋白表达增加。而MGMT基因去乙酰化能够使蛋白 表达降低，所以检测MGMT基因乙酰间接表现MGMT表达程度。MGMT基因甲基化在调控MGMT 表达为主导地位，乙酰化为其次地位。
【发明内容】
[0003] 本试剂盒包括：1)甲基化和乙酰化引物；2)甲基化处理试剂、乙酰化H3、H4分析 试剂、GoTaq? Green Master Mix、无核酶ddH20、空白对照；3)分隔并集中包装这些试剂。
[0004] 其中甲基化检测扩增用甲基化上游引物序列为： 5' -TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3' ；扩增用甲基化下游引物序列为： 5' -GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'。扩增用非甲基化上游引物序列为：5' -TTTGTGTTTTGATG TTTGTAGGTTTTTGT-3' ；扩增用非甲基化下游引物序列为：5' -AACTCCACACTCTTCCAA AAACAA AACA-3，。
[0005] 其中乙酰化检测扩增用上游引物序列为：5' -GCTCCAGGGAAGAGTGTCCTCTGCTCCCT-3 '；扩增用下游引物序列为：5' -GGCCTGTGGTGGGCGATGCCGTCCAG-3'。
[0006] 其中甲基化处理试剂包括：CT Conversion Reagent、M-Dilution Buffer、 Μ-Dissolving Buffer、M-Binding Buffer> M-ffash Buffer、M-Desulphonation Buffer> Μ-Elution Buffer>Zym〇-Spin? IC Columns、Collection Tubes。
[0007] 其中乙酰化 H3、H4 分析试剂包括：CP1 (Wash Buffer)、CP2 (Antibody Buffer)、 CP3A (Pre-Lysis Buffer), CP3B (Lysis Buffer), CP4 (ChIP Dilution Buffer), CP5 (DNA Release Buffer) > CP6 (Reverse Buffer) > CP7 (Binding Buffer) > CP8 (Elution Buffer) > Protease Inhibitor Cocktail(100X)、Normal Mouse IgG(lmg/ml)、Proteinase K(10mg/ ml)、Anti-Acetyl_Histone H3(lmg/ml)、Anti-Acetyl_Histone H4(lmg/ml)、8_Well Assay Strips (with Frame)>8-ffell Strip Caps、F_Spin Column、F-Collection Tube。
[0008] 其中GoTaq* Green Master Mix 含有Golaq?' DNA 聚合酶、2X 绿色 GoTaq* 反应缓 冲液（ρΗ8·5)、400μΜ dATP、400yM dGTP、400yM dCTP、400yM dTTP 和 3mM MgCl2。
[0009] 本发明的引物和试剂盒使用方法，包括以下：1)常规提取待测样本的基因组DNA， 对DNA进行亚硫酸盐修饰，按照权利要求2所述引物，进行扩增，检测基因甲基化。2)细胞 收集和甲醛交联，细胞裂解和超声破裂，蛋白质/DNA免疫沉淀，DNA交联逆转、富集的DNA片 段纯化，按照所述引物，进行扩增，检测基因乙酰化。
[0010] 本发明公开的引物是根据人类MGMT基因启动子序列设计的特异性引物，可使用 相对应的试剂盒，通过RT-PCR快速、准确、高灵敏的检测MGMT基因启动子甲基化和乙酰化。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1是本发明实施例的试剂盒检测细胞MGMT基因甲基化检测结果。
[0012] 图中，细胞检测后MGMT基因半甲基化，Μ表示甲基化，U表示非甲基化。
[0013] 图2是本发明实施例的试剂盒检测细胞MGMT基因乙酰化检测结果。
[0014] 图中，细胞检测后MGMT基因 H3、H4均出现乙酰化。
【具体实施方式】
[0015] 1.用于检测MGMT基因甲基化
[0016] (1)引物序列如权利要求1所述，其浓度为lOpmol/ul。
[0017] (2)甲基化处理试剂盒，其包括：CT Conversion Reagent、M-Dilution Buffer、 Μ-Dissolving Buffer、M-Binding Buffer> M-ffash Buffer、M-Desulphonation Buffer> Μ-Elution Buffer>Zym〇-Spin? IC Columns、Collection Tubes。
[0018] (3) GoTaq? Green Master Mix,其含有GoTaq? DNA 聚合酶、2X 绿色GoTaq? 反应缓 冲液（ρΗ8·5)、400μΜ dATP、400yM dGTP、400yM dCTP、400yM dTTP 和 3mM MgCl2。
[0019] (4)无核酶 ddH2〇。
[0020] (5)空白对照。
[0021] (6)分隔并集中包装这些试剂。试剂盒的使用方法：
[0022] 1)提取细胞基因组DNA，每次制备的DNA范围在500pg到2yg之间，最佳量为 200-500ng〇
[0023] 2)DNA亚硫酸盐修饰：在PCR管中添加130 μ 1的CT Conversion Reagent到每 20μ 1 DNA样品中，将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作：98°C放置10分钟，64°C放 置2. 5小时，4°C下存储（最多20小时）或直接进行下面步骤。添加600 μ 1的M-Binding Buffer到Zymo-Spin IC Column中，并将柱放如试剂盒所提供的Collection Tube中。将 循环之后的样品加入到到Zymo-Spin? IC Columns含有M-Binding Buffer,盖上盖将柱颠 倒数次来混合样品。全速（>l〇,〇〇〇x g)离心30秒，去除流出液。添加200μ1的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒。添加200μ 1的M-Desulphonation Buffer到柱中并且在 室温（20°C -30°C )下放置15-20分钟，在培养后，全速离心30秒。添加200 μ 1的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒,再添加200 μ 1的Μ-Wash Buffer并且离心30秒。直接添加 10μ 1的Μ-Elution Buffer到柱基质中，将柱放置在1. 5ml的管中，全速离心来洗脱DNA。 DNA可立刻进行分析或储存在低于-20°C下以备以后使用。
[0024] 3)PCR扩增：以亚硫酸盐修饰后的DNA为模板，按照权利要求2的引物进行扩增， 反应体系为：
[0025]
【权利要求】
1. 一种用于检测MGMT基因的引物，其特征是：包括甲基化引物和乙酰化引物； 所述用于检测MGMT基因甲基化引物，其扩增用甲基化上游引物序列 为：5' -TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3' ；扩增用甲基化下游引物序列为： 5' -GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3' ；扩增用非甲基化上游引物序列为：5' -TTTGTGTTTTGATG TTTGTAGGTTTTTGT-3' ；扩增用非甲基化下游引物序列为：5' -AACTCCACACTCTTCCAA AAACAA AACA-3,； 所述用于检测MGMT基因乙酰化的引物，其扩增用上游引物序列为：5 ' -GCTCCAGGGAAGA GTGTCCTCTGCTCCCT-3' ；扩增用下游引物序列为：5' -GGCCTGTGGTGGGCGATGCCGTCCAG-3。
2. 根据权利要求1所述的用于检测MGMT基因的引物，其特征是：所述引物浓度为 10pmol/ul。
3. -种用于检测MGMT基因甲基化和乙酰化的试剂盒，其特征是：该试剂盒包括：1)权 利要求1所述的甲基化和乙酰化引物；2)甲基化处理试剂、乙酰化H3、H4分析试剂、GoTaq? Green Master Mix、无核酶ddH20、空白对照；3)分隔并集中包装这些试剂。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：甲基化处理试剂包括：CT Conversion Reagent、M_Dilution BufTer、M_Dissolving BufTer、M_Binding BufTer、M_Wash Buffer、 M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer、Zym〇-Spin? IC Columns、Collection Tubes。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述的乙酰化H3、H4分析试剂包括： CPl(ffash Buff er) > CP2 (Antibody Buffer) > CP3A (Pre-Lysis Buffer) > CP3B (Lysis Buffer)>CP4(ChIP Dilution Buffer)>CP5(DNA Release Buffer)>CP6(Reverse Buffer)> CP7 (Binding Buffer) > CP8 (Elution Buffer) > Protease Inhibitor Cocktail (100X) > Normal Mouse IgG(lmg/ml)、Proteinase K(lOmg/ml)、Anti-Acetyl_Histone H3 (lmg/ml)> Anti-Acetyl-Histone H4(lmg/ml)、8_Well Assay Strips(with Frame)、8_Well Strip Caps、F-Spin Column、F-Collection Tube。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是：GoT+aq? Green Master Mix从Promega公 司购买得到，其含有GoTaq? DNA聚合酶、2X绿色GoTaq?反应缓冲液（pH8. 5)、400 μ M dATP、 400μΜ dGTP、400yM dCTP、400yM dTTP 和 3mM MgCl2。
7. -种利用权利要求3-6所述的试剂盒检测MGMT基因启动子甲基化和乙酰化的方法， 其特征是： (1) 常规提取待测样本的基因组DNA，对DNA进行亚硫酸盐修饰，按照权利要求1所述 甲基化引物进行扩增，检测基因甲基化； (2) 细胞收集和甲醛交联，细胞裂解和超声破裂，蛋白质/DNA免疫沉淀，DNA交联逆转、 富集的DNA片段纯化，按照权利要求1所述乙酰化的引物，进行扩增，检测基因乙酰化。
【文档编号】C12Q1/68GK104195252SQ201410454206
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】蒋冠, 陈亚平, 韩正祥, 刘彦群, 冯守信, 辛勇 申请人:蒋冠