专利名称：一种植物胚特异性表达启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物乳特异性表达启动子及其应用。
背景技术：
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺性状的改良(如提高作物产量， 增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等)，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器(Daniell et al. , Trends Plant Sci 2001,6 :219-226 ；Giddings et al.， NatureBiotech 2000,18 :1151-1156 ；Hood and Jilka, Curr Opin Biotechnol 1999,10 382-386 ；Hood and ffoodard, Plants as Factories for Protein Production 2002, pp. 119-135. Netherlands =Kluwer Academic)。对于绝大多数禾本科作物，由于其产量高、 生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积(Goto et al.，Nature Biotech. 1999,17 :282-286 ；Katsube et al.，Plant Physiol. 1999,120 :1063-1073 ；Qu et al.，Planta 2005,222 :225-233 ；Takagi et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. 2005,102 :17525-17530 ；Ye et al.，Science 2000，287 :303-305 ； Zheng et al.，PlantPhysiol. 1995，109 :777-786)。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用(外源基因的理想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等)的限制因子。植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。 基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。目前广泛应用的启动子(包括CaMV35S、ubiquitinl、ACtinl)尽管其表达效率高， 然而由于其表达不受时空限制，它在几乎所有组织中都能使外源基因表达，在进行种子中外源基因过量表达过程中，会驱动基因在种子外的其它组织中表达，既消耗生物能源，同时会导致一些可能对生物生长发育产生不利影响的代谢产物的合成。且上述启动子的表达强度尚无法满足转基因产业化的需要。若选择胚特异性高强度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。植物种子的发育包括两个重要的过程胚胎发生和种子成熟。随着胚的逐步成熟， 大量贮藏产物，如蛋白质、脂肪、碳水化合物开始合成和积累，种子逐步成熟。胚胎发育的形态发生阶段决定了植物个体的发育程序与整体结构模式。目前对于种子的形态学和生理学研究已取得了一定的进展，但由于克隆种子胚特异性基因在技术上存在困难，例如，种子储藏蛋白基因的高水平表达很容易掩盖一些低丰度基因的信息(Goldberg et al. ,cell1989,56:149-160)；缺少胚胎发育过程中的一些特殊分子或细胞标记等原因，目前在分子生物学水平上对种子胚胎发育的了解还很少。因而，分离、获得种子胚特异性表达启动子，既有助于更细致地理解植物胚胎发育中形态发生与细胞分化的分子机理，又能广泛应用于植物基因工程研究中，使外源目的基因能在特定的组织中高效表达，以实现对外源基因表达的定时、定点定量三维精确调控，在改良作物品质的同时又可减少对植物的不利影响。脂类是植物种子储藏能量最有效的形式，几乎所有植物中的脂类物质主要以三酰甘油酯(triacylglycerols，AG)的形式贮藏。与白色脂肪组织中的TAG不同，植物种子的TAG分子之间不是彼此聚合的，而是分散成许多小的相对稳定的亚细胞微滴，这些小的亚细胞微滴称为油体。油体外围由单层磷酸脂膜和油体蛋白(oleosin)所组成的半单位膜所覆盖。根据油体蛋白的两性N末端和C末端在长度及序列上的不同，可将其分为低分子量(L)和高分子量(H)两类(Hsieh K, Huang AHC. Plant Physiol. 2004,136 3427-34)。水稻种子胚中含有的18KDa和16KDa油体蛋白分别属于H型和L型(Tzen et al.,Plant Physiol. 1998,94 :1282-1289 ；Wu et al. ,J. Biochem. 1998,123(3) :386-391)。 Junko 等(Transgenic Res. 2006,15 :95-100)利用水稻胚特异性表达启动子 01el8 (Qu and Takaiwa, Plant Biotech. J. ,2004,2 :113-125)驱动亚油酸异构酶基因在转基因水稻中表达，不但提高了水稻种子中的亚油酸含量，并且增强了稻米的防癌和抗动脉硬化功能，体现了水稻胚特异性表达启动子极大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物胚特异性表达启动子及其应用。本发明所提供的植物胚特异性表达启动子，来源于水稻16 kDa oleosin基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚特异性表达启动子功能的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件可为在0. IX SSPE (或0. IX SSC)，0. SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。其中，序列表中序列1是由1438个脱氧核苷酸组成。上述自序列表中序列1的5'端第1295 1300位核苷酸为植物胚特异性表达启动子TATA盒核心区。将启动子除TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件改变。含有上述植物胚特异性表达启动子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。在所述表达盒中，所述植物胚特异性表达启动子的下游连接结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因，或调节基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者天然小RNA或人工合成的小 RNA的表达。
所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。上述植物胚特异性表达启动子可用于培育胚特异性表达外源基因的植物。利用该植物胚特异性表达启动子培育胚特异性表达外源基因的植物的方法也属于本发明的保护范围。所述培育胚特异性表达外源基因的植物的方法可为将所述外源基因连接于所述植物胚特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚中特异性表达所述外源基因的转基因植物。所述植物胚特异性表达启动子下游还可连接有调控基因表达的调控元件。所述调控基因表达的调控元件，该调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的元件，如增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。所述方法中，所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。所述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、大麦、高粱、燕麦等；所述双子叶植物是大豆、 油菜、向日葵等。本发明的植物胚特异性表达启动子是通过设计引物，以水稻基因组DNA为模板， 利用PCR方法从水稻中分离得到的油体蛋白基因16 kDa oleosin启动子。通过其在水稻中的表达特异性实验表明本发明的启动子使葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚中特异性表达。说明本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚中特异性的表达， 适用于任何种子具有胚的植物，即单子叶植物或双子叶植物。利用本发明的启动子可提高外源基因在植物胚中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的启动子及其应用为为揭示整个植物胚胎发育的过程和机理的研究，利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。
图1为从水稻基因组DNA中PCR扩增16 kDa oleosin启动子的电泳图谱。图2为16 kDa oleosin启动子融合GUS基因表达载体oleP-pGPTV-35S_HPT的结构示意图。图3为oleP-pGPTV-35S_HPT载体双酶切鉴定图谱。图4为转oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株嵌合引物PCR扩增电泳图谱。图5为转oleP-pGPTV-35S_HPT载体Ttl代水稻植株Southern杂交结果。
图6为转oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株根、茎、叶鞘和叶片⑶S染色结果。图7为转oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株在开花后7天，12天，17天种子的⑶S染色结果。图8为转oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株种子中的⑶S荧光活性测定结果。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、植物胚特异性表达启动子(16 kDa oleosin启动子)的获得根据水稻16 kDa oleosin 基因 cDNA 序列(GenBank 号为 L76464)，从 GenBank 中查找16 kDa oleosin基因的上游序列，设计引物扩增16 kDa oleosin启动子。为便于载体构建，在每对引物上依次添加两个酶切位点(下划线所示)。16kDa oleosin启动子的正向引物为 Fl ^y-ACCAAGCTT CGCTGATGTGGTATCATAG-3，(Hind III)和反向引物 Rl :5'ΑΑ6Τ CGACGGGGATCGAGCACACCTGCAG-3’ (Sal I)。CTAB法从水稻(野生型水稻台中65号，该品种为1936年我国台湾省育成；曲乐庆等，植物学报，2001,43 :1167-1171 ；中国科学院植物研究所保存)叶片中小量提取基因组DNA，以其为模板，以Fl和Rl为引物，进行PCR扩增16 kDa oleosin启动子序列。 反应体系为10μΜ正反向引物各1μ 1，2XGC Buffer 10μ1，基因组DNA 1 μ 1 (IOng)， LATaq(TAKARA)O. 5 unit，加超纯水至20 μ 1 ；反应程序为94°C预变性5min，然后94°C lmin，55°C lmin30sec, 72°C lmin30sec，30 个循环，最后 72°C，lOmin。PCR 扩增得到 1.5kb 的目的条带，如图1所示。图1中第1泳道为分子量标准，第2泳道为16 kDa oleosin启动子。回收扩增产物，直接连接到pT7Blue载体(购自Novagen公司)上进行测序。结果表明，扩增得到的16 kDa oleosin启动子序列大小为1438bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将测序检测表明含有16 kDa oleosin启动子片段的重组载体命名为pT7-oleP。实施例2、植物胚特异性表达启动子(16 kDa oleosin启动子)表达载体构建与遗传转化l、16KDa oleosin启动子融合⑶S基因的植物表达载体构建pGPTV-35S-HPT 参照文献(Qu and Takaiwa, Plant Biotech J 2004，2 :113-125) 所述的方法构建，中国科学院植物研究所保存。用Hind III和Ml I双酶切pT7-oleP质粒和双元表达载体PGPTV-35S-HPT。回收含有1438bp的16 kDa oleosin启动子的酶切片段，将该片段连接到PGPTV-35S-HPT的Hind III和Ml I酶识别位点之间。将得到的重组质粒在PCR鉴定的基础上利用Hind III和Ml I进行双酶切鉴定，得到1. 4kb的16 kDa oleosin启动子的片段。将酶切鉴定表明含有16 kDa oleosin启动子的重组质粒命名为 oelP-pGPTV-35S-HPT (其结构示意图如图2所示)。其中，oelP-pGPTV-35S_HPT的双酶切鉴定图谱，如图3所示。图3中泳道1为DNA分子量标记，泳道2和3为oelP-pGPTV-35S-HPT Hind III和Ml I双酶切获得的片段。2、转 oleP-pGPTV-35S_HPT 水稻的获得用冻融法将oelP-pGPTV-35S_HPT 导入农杆菌 EHA105(Hood et al.，TransgenResl993, 2 =208-218 ；中国科学院植物研究所保存)中，然后转化野生型水稻Kitaake。利用潮霉素筛选方法(按照文献Hiei et al.，Plant J 1994，6 :271-282所述方法进行)，获得9株Ttl代转oelP-pGPTV-35S-HPT水稻植株。利用PCR方法对上述筛选得到的转oelP-pGPTV-35S-HPT水稻进行PCR分子检测， PCR引物为16 kDa oleosin启动子序列和⑶S基因序列的嵌合引物，S卩16 kDaoleosin启动子序列内部正向引物Pl:5’ -gatgaacttgttccttcagttacacg-3，，和⑶S序列内部的反向引物 p2 :5，-cgtgacatcggcttcaaatggcgta-3，。PCR 反应体系为10 μ M 正反向引物各 1 μ 1， IOXEx Buffer 2 μ 1，基因组 DNA 1 μ 1, ExTaq(TAKARA)O. 5 unit，加超纯水至 20 μ 1 ；反应程序为:94°C预变性 5min，然后 94°C lmin，55°C lmin30sec, 72°C lmin30sec，30 个循环，最后72°C，IOmin0 PCR扩增得到0. Skb的目的条带即为检测阳性，结果表明得到9株PCR检测阳性的转oelP-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株(如图4所示)。图4中第1泳道为分子量标准，第2泳道以质粒为模板的阳性对照，第3泳道为以未转化株系作为模板的阴性对照， 第4 11泳道分别为转oelP-pGPTV-35S-HPT植物表达载体的Ttl代植株。T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。实施例3、转基因水稻植株的Southern杂交检测用CTAB法提取PCR鉴定呈阳性的Ttl代水稻转基因植株叶片的基因组DNA，约40 μ g DNA加入50单位EcoR I充分酶切后，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分离后，用0. 4N的NaOH将 DNA转移到带正电核的尼龙膜(购自Amersham pharmacia公司)上。转移后的膜在含有 7% (ff/V) SDS的0. 5M磷酸钠缓冲液中65°C预杂交5小时，用〔α -32Ρ) dCTP随机引物法进行探针标记(购自中国福瑞公司)。所使用的杂交探针是位于GUS内部的441bp DNA片段(序列为自GENBANK号为S69414. 1的第1344-1784位核苷酸序列，以pGPTV_35S_HPT 质粒为模版，5，-CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’ 和 5’ -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3，为引物的PCR扩增产物)为探针。65°C杂交20小时后，在含有0. 1%SDS的2XSSC中于65°C 洗膜两次，每次15分钟，再在0. SDS的IXSSC中于65°C洗膜一次，15分钟。压X光片M 48小时后，放射性自显影。Southern杂交结果显示，各个转基因株系中都能检测出杂交条带，并且在不同的株系中，杂交条带的数目和出现的位置不完全相同(如图5所示)，这表明oelP-pGPTV-35S-HPT表达结构已经成功整合到水稻基因组中，并且各个转基因株系间是相互独立的转化个体。图5中，第1泳道为非转基因植株对照，2 10泳道为转 oelP-pGPTV-35S-HPT 植株。实施例4、植物胚特异性表达启动子(16 kDa oleosin启动子)的功能验证对转oleP-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株进行组织化学染色。具体步骤将转 oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株及对照野生型水稻(Kitaake)植株的部分叶片、 根、茎杆组织切成小块；将开花后7天、12天、17天的灌浆期种子，用解剖刀从中部纵切开。 将处理好的样品浸泡于GUS反应液(0. IM NaPO4缓冲液，pH 7. 0，IOmMEDTA, pH7. 0，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，l.OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反应。染色后的组织在 70%乙醇中保存、观察，并在解剖显微镜下照相。结果表明，转oelP-pGPTV-35S-HPT载体水稻植株的根、叶片、叶鞘、茎杆均未观察到⑶S表达(如图6所示)；开花后7天的种子糊粉层、亚糊粉层变蓝，胚乳和胚未被染成蓝色；开花后12天的种子与开花后7天的种子相比，糊粉层、亚糊粉层蓝色更明显、胚变蓝，胚乳未被染成蓝色；开花后17天的种子糊粉层、亚糊粉层和整个胚的蓝色清晰可见，与开花后12天的种子相比，胚的蓝色更深；而对照野生型水稻(Kitaake)根、叶片、叶鞘、茎杆、以及开花后7天、12天、17天的灌浆期种子都未观察到⑶S表达(如图7所示)。结果表明16 kDa oleosin启动子使β -葡糖苷酸酶(⑶S) 报告基因只在水稻种子的胚和糊粉层中特异性表达。图6中，1、2、3分别为转基因植株根、 茎、叶鞘及叶片的染色结果。图7中，ck为对照野生型水稻(Kitaake)开花后17天的灌浆期种子染色结果；7d、12d、17d分别表示转oelP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株开花后 7天、12天、17天灌浆期种子的GUS染色结果。实施例5、转基因水稻的组织⑶S荧光活性测定对转oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株开花后17天的灌浆期种子进行⑶S 定量分析，方法按照Jefferson等的荧光检测方法(Jefferson，Plant Mol. Biol. Report, 1987,5 :387-405)进行。具体为取1粒种子，置于1. 5ml印pendorf管中，用玻璃棒将种子碾碎，加入 30 μ 1 抽提液(50mM NaPO4 (ρΗ7· 0)，IOmM β -Mercaptoethanol, IOmMNa2EDTA (ρΗ 8.0),0.1% SDS,0. 1% Triton X-100)，摇勻。4°C 15，OOOrpm 离心 lOmin，取 10 μ 1 上清于新管中，加入90 μ 1保温至37°C的反应液(ImM MUG)，37°C反应60分钟，加入900 μ 1终止液 (0. 2Μ Na2CO3)，室温终止反应。用F-4500 (日立)型荧光分光光度计在360nm激发波长和 460nm吸收波长下检测相对4MU含量。以牛血清蛋白为对照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit测定蛋白质含量。结果表明，16 KDa oleosin启动子驱动的⑶S在转基因水稻种子中表达的活性为7. 7士3. 5pmol 4MU/min/ μ g蛋白(如图8所示)。图8中，1_8分别为不同转oleP-pGPTV-35S-HPT载体Ttl代水稻植株种子中⑶S表达活性1为6. 4pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，2 为 11. 8pmol 4MU/min/μ g 蛋白，3 为 11. 7pmol 4MU/min/μ g 蛋白，4 为 4. 2pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，5 为 1. 7pmol4MU/min/ μ g 蛋白，6 为 7. 3pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，7 为 8. 8pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，8 为 9. 6pmol 4MU/min/ μ g 蛋白。
权利要求
1.一种植物胚特异性表达启动子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚特异性表达启动子功能的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的植物胚特异性表达启动子的表达盒。
3.含有权利要求1所述的植物胚特异性表达启动子的重组表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
4.权利要求1所述的植物胚特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用，所述转基因植物中的外源基因是在胚中特异性表达的。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述培育转基因植物，是将所述外源基因连接于所述植物胚特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚中特异性表达所述外源基因的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述胚特异性表达启动子下游还连接有调控基因表达的调控元件。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA 基因和/或反义RNA基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦；所述双子叶植物是大豆、油菜或向日葵。
全文摘要
本发明公开了一种植物胚特异性表达启动子及其应用。该启动子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有植物胚特异性表达启动子功能的DNA序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚中特异性的表达，适用于任何种子植物。
文档编号C12N5/10GK102250894SQ20101018425
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者代玲玲, 曲乐庆 申请人:中国科学院植物研究所