一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明是一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白，也是一种低抗原性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：选取主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞作为原料，经碱处理去除杂蛋白和脂肪，酸处理去除鱼鳞的钙盐后，添加弱酸溶液作为提取剂，同时加入胃蛋白酶进行低温搅拌浸提，浸提后冷冻离心得酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液；然后将酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液通过膜分离技术纯化，再用冷冻干燥，即得纯度不低于90％，保持三螺旋结构的酶溶性Ⅰ型胶原蛋白。运用本发明方法所制备的胶原蛋白产品抗原性低，构型明确，三螺旋结构完整，通过HPLC检测，为纯度≥90％的Ⅰ型胶原蛋白，通过MALDI-TOF-MS检测，质谱图无杂峰，其分子量为288kDa。
【专利说明】一种酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到一种具有三螺旋结构的酶溶性高纯I型胶原蛋白的制备工艺，同时 也是一种低抗原性高纯I型胶原蛋白的制备工艺，属于生物提取【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是动物支持结构中最主要也是最重要的一类蛋白质，在人体的皮肤、血 管、骨骼、软骨以及结缔组织中广泛分布。它具有特殊的三螺旋结构，也称为超螺旋结构，即 由三条左手螺旋α链通过右手螺旋的方式互相缠绕而成。同时，胶原蛋白的甘氨酸含量几 乎占了 1/3,脯氨酸和羟脯氨酸的含量为各种蛋白质中含量最高，胶原蛋白还拥有其它蛋白 质不存在的羟基赖氨酸。胶原蛋白特有的空间结构和化学组成，使其具备很强的生物活性 和独特的生物功能，在食品、保健品、化妆品、生物医药等众多领域中都有十分广泛的应用。
[0003] 特别是在高端的生物医药领域，高纯超螺旋结构胶原蛋白是细胞外基质（EMC)的 主要化合物，具有其他材料所不具备的低毒性、低免疫抗原性、高生物相容性、可生物降解 性等优势，它能参与细胞的迁移、分化和增殖，并使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强 度，可作为生物材料，具有巨大的市场价值。据统计，全球市场每年要销售超过40亿美元的 以胶原蛋白为原料的生物医用材料。
[0004] 由于从不同组织中分离纯化得到的胶原蛋白在肽链、氨基酸组成、理化性质和胶 原蛋白构型方面有显著的差异，因此本发明选择生物体内含量最为丰富和市场潜力最为巨 大的I型胶原蛋白作为目标产品，同时，针对近年来由于疯牛病、口蹄疫等疾病在全球范围 内肆虐，而导致人们逐渐对原来以猪、牛等陆生哺乳动物的皮、腱等为原料提取的胶原蛋白 的安全性产生置疑的不利趋势，以及由于特定宗教原因，在信仰伊斯兰教地区的人民对源 自牲畜的胶原蛋白存在固有排斥的不利情况，本发明挑选主要含有I型胶原蛋白的鱼鳞作 为制备原料。
[0005] 生物制品的抗原性将大大限制其在食品、化妆品、药品等领域的应用。相关文献显 示以鱼鳞或鱼皮为原料制备胶原蛋白，如果采取酸溶提取或因处理不当而导致胶原蛋白变 性成为明胶，均有可能使制品的抗原性增大。而酶溶提取可以去除胶原蛋白的主要抗原决 定基团一位于非螺旋部分的端肽，这样既可以保持胶原蛋白的三螺旋结构，又可以有效 降低胶原蛋白制品的抗原性，保证胶原蛋白在食品、保健品、化妆品、生物医药领域的广泛 应用。正因如此，它被大量中外文献推崇使用。
[0006] 目前，现有技术中胶原蛋白的提取分离工艺基本都是先将原料经过氢氧化钠脱除 杂蛋白，再在低温条件下，采用单纯的醋酸溶剂或一定量的胃蛋白酶配合醋酸溶剂长时间 浸泡提取粗酸溶性胶原蛋白或粗酶溶性胶原蛋白，在此基础上，加入大量的盐（氯化钠或 是硫酸铵）进行盐析沉淀，或是调解pH至中碱性条件凝絮成蛋白质凝胶，再将蛋白沉淀或 凝胶用酸溶解，然后装入透析袋中，使用蒸馏水或〇. 02M磷酸氢二钠进行长时间的反复透 析，透析后得到的胶原蛋白液体通过冷冻干燥得到最终的酸溶性胶原蛋白或酶溶性胶原蛋 白。这些制备工艺的缺陷在于：工艺设计没有关注酸溶和酶溶两种提取方法对胶原蛋白产 品抗原性的影响，流程繁琐复杂，分离纯化周期冗长，制备成本高，工艺很难放大并实施规 模化生产；而且制备的酶溶性胶原蛋白构型不明确，三螺旋结构是否完整不清楚，分子量的 数值不确切，产品的纯度有限--最多只能达到SDS-PAGE电泳级别，产品的得率也不高。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种工艺更为简便，成 本更为低廉，周期更为紧凑，后续放大规模化生产更为容易，同时保证产品的纯度、得率、低 抗原性和特有的三螺旋结构的酶溶性高纯I型胶原蛋白的制备工艺，为大宗鱼类水产下脚 料--鱼鳞突破制约高值开发的技术瓶颈，在食品、保健品、化妆品和药品，特别在高端生 物材料领域的高值开发利用开拓新的途径。
[0008] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种酶溶 性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备工艺，所述的"高纯"为色谱纯度90%以上，方法包 括以下步骤： (1) 原料预处理 将鱼鳞投入反应荃中，加入鱼鳞重量2?10倍的碱溶液，搅拌1?12小时，除掉鱼鳞 的脂肪和杂蛋白等杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2?10倍的酸溶液，搅拌1?12小时，再 用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1?4%，酸溶液的质量体积浓度为3?8%，预处 理温度控制在0?25°C之间； (2) I型胶原蛋白提取 向处理后的原料中添加0. 05?10m〇l/L的弱酸作为提取液，浸提温度为0?10°C，原 料与提取剂的重量比为1:10,同时加入原料重量〇. 05%?5%的胃蛋白酶进行2?72小时 的搅拌浸提，提取步骤可重复〇?5次，浸提液可混合汇总，再进行离心过滤5?120分钟， 所得的离心上清液为酶溶性I型胶原蛋白粗提液， (3) I型胶原蛋白分离纯化 膜分离工艺技术纯化酶溶性I型胶原蛋白粗提液。粗提液用孔径为〇. 2?0. 1 μ m或 相对分子量为300KD?200KD的超滤膜，超滤膜流速为0. 91?1. 82立方米/小时，膜压力 为0. 1?0. 4Mpa，温度为0?10°C，去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到 色谱纯度> 90%，具备三螺旋结构的高纯I型胶原蛋白溶液。 (4) I型胶原蛋白冷冻干燥 冷冻干燥热敏性的I型胶原蛋白溶液，得到酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白固体 成品。
[0009] 所述步骤（1)原料预处理所使用的鱼鳞可以是海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞。
[0010] 所述步骤⑴原料预处理所使用的碱为碳酸氢钠（钾）或氢氧化钠（钾）；酸为 盐酸或硝酸。
[0011] 所述步骤（2)所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。
[0012] 所述步骤（2)所使用的离心机为8000?15000rpm的大型高速冷冻离心机。
[0013] 所述步骤（3)所使用的孔径为0. 2?0. 1 μ m或相对分子量为300KD?200KD的 超滤膜流速为1. 20?L 50立方米/小时，膜压力为0· 2?0· 3Mpa，温度为0?10°C。
[0014] 所述步骤（2)中离心过滤和步骤（3)分离纯化的温度为0?10°C。
[0015] 所述步骤（4)所使用的冷冻干燥的隔板温度为-10?-20°c、真空度为13. 33Pa、 冻干时间为12?36小时。
[0016] 所述预处理步骤前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。
[0017] 与现有技术和产品相比，本发明具有以下优点：
[0018] 1.本发明选择主要含有I型胶原蛋白的鱼鳞作为原料，保证了提取的胶原蛋白是 具备明确单一构型的I型胶原蛋白。
[0019] 2.本发明的提取步骤中加入适当的胃蛋白酶，大大提高了酶溶性I型胶原蛋白的 得率。
[0020] 3.本发明的提取分离纯化步骤全程低温（0?10°C )控制并结合冷冻干燥技术， 保证提取的I型胶原蛋白特有的三螺旋结构的完整性。
[0021] 4.本发明摒弃了传统工艺中常用的Tris试剂和用于盐析步骤的大量中性盐，节 约了生产成本。
[0022] 5.本发明运用膜分离技术纯化I型胶原蛋白，快速去除残余的胃蛋白酶、小分子 杂质和无机盐，大大缩短了纯化时间和生产周期。
[0023] 6.本发明工艺流程简单合理，工艺得率高，适合规模化生产。
[0024] 7.本发明得到的超螺旋结构I型胶原蛋白为具有明确分子量的海洋源高纯I型 胶原蛋白，通过MALDI-T0F-MS检测，质谱图整体无杂峰，其分子量为288kDa ;通过HPLC检 测，其纯度彡90%。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本发明的工艺流程图。
[0026] 图2是本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白与市场上购买的高纯I 型胶原蛋白对照品的SDS-PAGE电泳图。图中：marker :SDS-PAGE蛋白质高分子量标准蛋白； 1 :鼠尾I型胶原蛋白，Sigma化学试剂公司（St. Louis，M0, USA) ;2 :三文鱼鱼皮I型胶原蛋 白，Wako化学试剂公司（Tokyo, Japan) ;3:酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白，本发明实 施例1制得。
[0027] 图3是本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白与市场上购买的高纯I 型胶原蛋白对照品的凝胶色谱图。图中：(a)酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白，本发明 实施例1制得；(b)三文鱼鱼皮I型胶原蛋白，Wako化学试剂公司（Tokyo, Japan) ; (c)鼠 尾I型胶原蛋白，Sigma化学试剂公司（St. Louis, M0, USA)。
[0028] 图4是本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白与市场上购买的高纯I 型胶原蛋白对照品的高效液相色谱图。图中：(a)酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白，本 发明实施例1制得；(b)三文鱼鱼皮I型胶原蛋白，Wako化学试剂公司（Tokyo, Japan) ;(c) 鼠尾I型胶原蛋白，Sigma化学试剂公司（St. Louis，M0, USA)。
[0029] 图5是本发明实施例1得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的傅里叶红外 光谱图。
[0030] 图6是本发明实施例1得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的基质辅助激 光解吸电离飞行时间质谱图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
[0032] 实施例1 :
[0033] -种酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备工艺，步骤如下： (1) 原料预处理 洗净的鱼鳞2kg，先粉碎，再投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌12小时， 用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌12小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积 浓度为3%，酸溶液的质量体积浓度为5%，预处理温度为25°C ; (2) I型胶原蛋白提取 向处理后的原料中添加0. lmol/L的醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸作为提取液，浸提温 度为4°C，原料与提取剂的重量比为1:10,同时加入原料重量0. 5 %的胃蛋白酶进行24小时 的搅拌浸提，提取步骤可重复3次，浸提液混合汇总，再进行离心过滤，离心机转速设定为 lOOOOrpm，离心时间15分钟，离心温度4°C。所得的离心上清液为酶溶性I型胶原蛋白粗 提液， (3) I型胶原蛋白分离纯化 用孔径为0. 2 μ m的超滤膜截留酶溶性I型胶原蛋白粗提液，超滤膜流速为0. 5立方米 /小时，膜压力为〇. 4Mpa，温度为4°C。浓缩得到色谱纯度为93. 62%，具备三螺旋结构的高 纯I型胶原蛋白溶液。 (4) I型胶原蛋白冷冻干燥 冷冻干燥I型胶原蛋白溶液，设定隔板温度为-l〇°C、真空度为13. 33Pa、冻干时间为24 小时。即得高纯超螺旋结构I型胶原蛋白固体成品。
[0034] 实施例2 :
[0035] -种酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备工艺，步骤如下： (1) 原料预处理 将洗净的鱼鳞5kg投入反应釜中，加入鱼鳞重量8倍的碱溶液，搅拌10小时，用水洗 净，加入鱼鳞重量8倍的酸溶液，搅拌10小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为 2%，酸溶液的质量体积浓度为6%，预处理温度为20°C ; (2) I型胶原蛋白提取 向处理后的原料中添加0. 25mol/L的醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸作为提取液，浸提温 度为4°C，原料与提取剂的重量比为1:10,同时加入原料重量1%的胃蛋白酶进行12小时 的搅拌浸提，提取步骤可重复3次，浸提液混合汇总，再进行离心过滤，离心机转速设定为 SOOOrpm，离心时间25分钟，离心温度6°C。所得的离心上清液为酶溶性I型胶原蛋白粗提 液， (3) I型胶原蛋白分离纯化 用孔径为〇. 1 μ m的超滤膜截留酶溶性I型胶原蛋白粗提液，超滤膜流速为0. 25立方 米/小时，膜压力为〇. 3Mpa，温度为7°C。浓缩得到色谱纯度为93. 57%，具备三螺旋结构的 高纯I型胶原蛋白溶液。 (4) I型胶原蛋白冷冻干燥 冷冻干燥I型胶原蛋白溶液，设定隔板温度为-15°C、真空度为13. 33Pa、冻干时间为 18小时。即得1?纯超螺旋结构I型I父原蛋白固体成品。
[0036] 实施例3 :
[0037] -种酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备工艺，步骤如下： (1) 原料预处理 将洗净的鱼鳞〇. 5kg投入反应釜中，加入鱼鳞重量6倍的碱溶液，搅拌4小时，用水洗 净，加入鱼鳞重量6倍的酸溶液，搅拌12小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为 1 %，酸溶液的质量体积浓度为8%，预处理温度为15°C ; (2) I型胶原蛋白提取 向处理后的原料中添加 lmol/L的醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸作为提取液，浸提温度 为8°C，原料与提取剂的重量比为1:10,同时加入原料重量2%的胃蛋白酶进行12小时 的搅拌浸提，提取步骤可重复2次，浸提液混合汇总，再进行离心过滤，离心机转速设定为 12000rpm，离心时间5分钟，离心温度8°C。所得的离心上清液为酶溶性I型胶原蛋白粗提 液， (3) I型胶原蛋白分离纯化 用相对分子量为300KD的超滤膜截留酶溶性I型胶原蛋白粗提液，超滤膜流速为0. 15 立方米/小时，膜压力为〇. 2Mpa，温度为3°C。浓缩得到色谱纯度为92. 88%，具备三螺旋结 构的高纯I型胶原蛋白溶液。 (4) I型胶原蛋白冷冻干燥 冷冻干燥I型胶原蛋白溶液，设定隔板温度为_20°C、真空度为13. 33Pa、冻干时间为24 小时。即得高纯超螺旋结构I型胶原蛋白固体成品。
[0038] 实施例4 :
[0039] -种酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备工艺，步骤如下： (1) 原料预处理 洗净的鱼鳞l〇kg先粉碎，再投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌8小时， 用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌8小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积 浓度为4%，酸溶液的质量体积浓度为6%，预处理温度为10°C ; (2) I型胶原蛋白提取 向处理后的原料中添加2mol/L的醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸作为提取液，浸提温度 为2°C，原料与提取剂的重量比为1:10,同时加入原料重量4%的胃蛋白酶进行36小时的搅 拌浸提，提取步骤可重复〇次，浸提液进行离心过滤，离心机转速设定为15000rpm，离心时 间35分钟，离心温度:TC。所得的离心上清液为酶溶性I型胶原蛋白粗提液， (3) I型胶原蛋白分离纯化 用相对分子量为200KD的超滤膜截留酶溶性I型胶原蛋白粗提液，超滤膜流速为0. 5 立方米/小时，膜压力为〇. IMpa，温度为5°C。浓缩得到色谱纯度为92. 80%，具备三螺旋结 构的高纯I型胶原蛋白溶液。 (4) I型胶原蛋白冷冻干燥 冷冻干燥I型胶原蛋白溶液，设定隔板温度为_15°C、真空度为13. 33Pa、冻干时间为36 小时。即得高纯超螺旋结构I型胶原蛋白固体成品。
[0040] 将本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检 测，发现其构型明确：是典型的I型胶原蛋白一包含两组不同的α链（α?链、α2链） 和两者的二聚体（β链）；同时与市场上购买到的两种高纯I型胶原蛋白对照品--美国 Sigma公司制备的鼠尾I型胶原蛋白和日本Wako公司制备的三文鱼鱼皮I型胶原蛋白对 t匕，本发明制备的酶溶性高纯I型胶原蛋白在电泳级别上的纯度虽与鼠尾I型胶原蛋白相 仿，但优于三文鱼鱼皮I型胶原蛋白。结果参照图2。电泳方法可参见文章：陈思谨，易瑞 灶，洪碧红，陈晖，陈俊德，乐卿清，高效液相色谱法测定鱼鳞中的I型胶原蛋白的含量.中 国海洋药物（2013, Vol. 32, No. 3)，54-58。
[0041] 将本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白进行蛋白层析和高效液 相色谱检测，发现酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的纯度> 90%，在色谱级别上优 于美国Sigma公司制备的鼠尾I型胶原蛋白和日本Wako公司制备的三文鱼鱼皮I型胶 原蛋白。结果参照图3和图4。蛋白层析方法可参见GE公司说明书：GE Healthcare， Instructions71-5017-96AF，17-5175-01，Superdex20010/300GL。色谱方法可参见文章：陈 思谨，易瑞灶，洪碧红，陈晖，陈俊德，乐卿清，高效液相色谱法测定鱼鳞中的I型胶原蛋白 的含量·中国海洋药物（2013, Vol. 32, No. 3)，54-58。
[0042] 将本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白进行傅里叶红外光谱 (FTIR)测定，光谱图中1240cm-l和1454cm-l两处的吸收比例大约等于1. 0,由此判定酶溶 性高纯I型胶原蛋白的三螺旋结构完整。结果参照图5。光谱测定和三螺旋结构判定方法 可参见以下文章： 1) Plepis AMDG, Goissis G,Das-Gupta DK. (1996). Dielectric and pyroelectric characterization of anionic and native collagen. Polym Eng Sci36 (24),2932 -2938. 2) Lin Wang, Xinxin An, Fangmei Yang, Zhihong Xin, Liyan Zhao, Qiuhui Hu*. (2008) . Isolation and characterisation of collagens from the skin, scale and bone of deep-sea redfish (Sebastes mentella). Food Chemistryl08, 616-623. 3) L. WANG, X. AN, Z. XIN, L· ZHAO, AND Q. HU. (2007). Isolation and Characterization of Collagen from the Skin of Deep-Sea Redfish(Sebastes mentella). JOURNAL OF FOOD SCIENCE Vol. 72, NO. 8, 〇
[0043] 将本发明得到的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白进行基质辅助激光解吸电 离飞行时间质谱（MALDI-T0F-MS)测定，质谱图整体无杂峰，从中可以清楚地看见位于 96kDa的三倍电荷峰以及位于48kDa的两倍电荷峰，由此可得，本发明得到的酶溶性高纯超 螺旋结构I型胶原蛋白的分子量为288kDa，质谱测定和分子量判定方法可参见以下文章： 1) Kim, S. H. , Lee, J. H. , Yun, S. Y. , Yoo, J. S. , Jun, C. H. , Chung, K. Y. , &Suh, H. (2000). Reaction monitoring of succinylation of collagen with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Communication Mass Spectrometry, 14, 2125-2128. 2) Xiong, X. , Ghosh, R. , Hi ller, E. , Drepper, F. , Knapp, B. , Brunner, H. , &Rupp, S. (2009) . A new procedure for rapid, high yield purification of Type I collagen for tissue engineering. Process Biochemistry, 44, 1200 - 1212. 3) Kumar, R. , Sripriya, R. , Balaji, S. , Kumar, M. S. , &Sehgal, P. K. (2011). Physical characterization of succinylated type I collagen by Raman spectra and MALDI-TOF/MS and in vitro evaluation for biomedical applications. Journal of Molecular Structure，994, 117-124。
【权利要求】
1. 一种酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤如下： (1) 原料预处理 将鱼鳞投入反应荃中，加入鱼鳞重量2?10倍的碱溶液，搅拌1?12小时，除掉鱼鳞 包括脂肪和杂蛋白在内的杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2?10倍的酸溶液，搅拌1?12 小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1?4%，酸溶液的质量体积浓度为3? 8%，预处理温度控制在0?25°C之间； (2) I型胶原蛋白提取 向处理后的原料中添加0. 05?10m〇l/L的弱酸作为提取剂，浸提温度为0?10°C，原 料与提取剂的重量比为1:10,同时加入原料重量〇. 05%?5%的胃蛋白酶进行2?72小时 的搅拌浸提，提取步骤重复〇?5次，浸提液混合汇总，再进行冷冻离心过滤，所得的离心上 清液为酶溶性I型胶原蛋白粗提液， (3) I型胶原蛋白分离纯化 膜分离工艺技术纯化酶溶性I型胶原蛋白粗提液，粗提液用孔径为〇. 2?0. 1 μ m或相 对分子量为300KD?200KD的超滤膜，超滤膜流速为0. 91?1. 82立方米/小时，膜压力为 0. 1?0. 4Mpa，温度为0?10°C，去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到色谱 纯度> 90%，具备三螺旋结构的高纯I型胶原蛋白溶液； (4) I型胶原蛋白冷冻干燥 冷冻干燥热敏性的I型胶原蛋白溶液，得到酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白成品。
2. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)原料预处理所使用的鱼鳞为海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞。
3. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（1)原料预处理所使用的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾；酸 为盐酸或硝酸。
4. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2) I型胶原蛋白提取所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。
5. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2)中所使用的离心机为8000?15000rpm的大型高速冷冻离心机。
6. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（3)分离纯化使用孔径为0. 2?0. 1 μ m或相对分子量为300KD?200KD的超 滤膜时，流速为1.20?1.50立方米/小时，膜压力为0.2?0.3Mpa，温度为0?10°C。
7. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（2)中离心过滤和步骤（3)分离纯化的温度为0?10°C。
8. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征在 于：所述步骤（4)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为-10?_20°C、真空度为13. 33Pa、冻干 时间为12?36小时。
9. 根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法，其特征 在于：所述的酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白为低抗原性高纯超螺旋结构I型胶原 蛋白；通过HPLC检测，纯度> 90 %，通过MALDI-T0F-MS检测，质谱图无杂峰，分子量为 288kDa，具备三螺旋结构的高纯I型胶原蛋白。
10.根据权利要求1?9任一项所述酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白的制备方法， 其特征在于：所述步骤1)原料预处理之前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。
【文档编号】C12P21/06GK104152519SQ201410341024
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】陈思谨, 易瑞灶, 陈晖 , 洪碧红, 谢全灵 申请人:国家海洋局第三海洋研究所