一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用，步骤：A.利用人工瘤胃体外培养系统，添加不同浓度的Candida utilis CICC No.1314对粗饲料进行体外培养；B.不同浓度为0.1-0.75×107cfu；C.人工瘤胃体外培养系统通过瘘管采集奶牛瘤胃液，过滤后的奶牛瘤胃液与厌氧缓冲液混合为发酵培养液；D.混合好的培养液在发酵前迅速通入二氧化碳，置于水浴摇床上等待培养，加入不同浓度梯度的酵母菌培养液和体外发酵培养液，通入二氧化碳，加上瓶塞盖子后用针头放气将气压调节，随后放置恒温培养箱中开始体外发酵；E.在粗饲料中加入Candida utilis CICC No.1314不同添加浓度梯度。方法简单，生长速度快，不易变异，可以用作酵母提高粗饲料利用效率的模式菌株，直接用于提高粗饲料的利用效率。
【专利说明】
一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及动物营养与饲料技术领域，更具体涉及一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用。【背景技术】
[0002]由于抗生素饲料添加剂在动物生产中的长期使用以及一些不合理应用，极易引发细菌耐药性、在动物产品和环境中残留等诸多问题。因此，研究和开发绿色饲料添加剂产品已称为世界性的研究课题，目前已得到公认的绿色饲料添加剂品种有植物提取物、酶制剂、 益生素等。酵母菌是一种单细胞真菌类微生物，具有单细胞细菌生长快、易于操作等特点。 目前其在动物营养与饲料科学领域的应用包括刺激反刍动物瘤胃微生物生长繁殖、增强瘤胃微生物活性、改变瘤胃发酵模式等方面。然而，它在营养物质消化率和饲料利用效率方面的应用还非常有限，其中的一个重要原因是缺乏确实能有效提高饲料利用效率的酵母菌株。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是在于提供了一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用，本发明的酵母菌株CICC N0.1314是一株具有极高活力，对粗饲料利用效率提高能力极强的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以用作酵母提高粗饲料利用效率的模式菌株，更重要的是可以直接用于提高粗饲料的利用效率。
[0004]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用，其步骤是:A、利用人工瘤胃体外培养系统(FYL-YS-100L)，通过添加不同浓度的y CICC N0.1314对粗饲料(水稻秸杆和玉米秸杆)进行体外培养。所述的粗饲料(水稻秸杆和玉米秸杆)分别经80-110目孔径筛粉碎。
[0005]B、所述的CICC N0.1314 不同浓度为 0? 1-0.75X 107cfu。
[0006]C、人工瘤胃体外培养系统在早晨饲喂前通过痿管采集奶牛瘤胃液，用四层纱布过滤后的奶牛瘤胃液与厌氧缓冲液以1:9的比例充分混合为发酵培养液。
[0007]D、混合好的发酵培养液在发酵前迅速通入二氧化碳2-4分钟后，置于39°C的水浴摇床(ZHSY-50)上等待培养。于体外发酵前22-26h预先在各厌氧发酵瓶中称取0.4-0.6克经80-110目孔径筛粉碎的粗饲料(水稻秸杆和玉米秸杆)，随即先后加入不同浓度梯度的酵母菌培养液和40-60ml体外发酵培养液，并再次持续通入二氧化碳2 — 4min，加上瓶塞盖子后迅速使用针头放气将气压调节成〇,此即〇h点的气压值。随后立即放置于39°C恒温培养箱中开始体外发酵46-50小时。
[0008]上述的瘤胃体外发酵厌氧缓冲液组成包括常量元素溶液、微量元素溶液、还原剂溶液、刃天青溶液和缓冲溶液。其中常量元素溶液组成:每500毫升溶液中包括7.185 克十二水磷酸氢二钠(Na2HP04 ? 12H20)、3.1克磷酸二氢钾(KH2P04)和0.3克七水硫酸镁(MgS04 *7H20);微量元素溶液组成:每500毫升溶液中包括9.97克氯化钙(CaCl2)、8.0克六水氯化铁(FeCl3 *61120)、10.0 克四水氯化锰(MnCl2 *4H20)、5.9 克一水氯化锌(ZnCl2 *H20)、 1.〇克六水氯化钴(CoC12 ? 6H20)和1.25克二水氯化铜(CuC12 ? 2H20);还原剂溶液组成:每 100毫升溶液中包括25克九水硫化二钠(Na2S *9H20);刃天青溶液组成:每100毫升溶液中包括〇.1克刃天青；缓冲溶液组成:每1000毫升溶液中包括将4.0克碳酸氢铵(NH4HC03)和 35.0克碳酸氢钠(NaHC03)。
[0009]瘤胃体外发酵厌氧缓冲液的制备:在400毫升蒸馏水内依次加入以下溶液:0.5毫升微量兀素液、200晕升缓冲溶液、200晕升常量兀素液、1.0晕升刃天青溶液和1.6晕升还原液。
[0010]E、为了提高粗饲料利用效率，在粗饲料中加入所述CICC N0.1314不同添加浓度梯度为0? 1-0.75X 107cfu。[〇〇11]该菌株能提高粗饲料多种营养成分的利用效率，特别是对提高干物质(DM)、氮(N)、有机物(0M)、中性洗涤纤维(NDF)的利用效率尤其有效。
[0012]试验证明在48小时内，CICC N0.1314对粗饲料水稻秸杆DM、N、 0M、NDF体外降解率分别提高了 5%、7%、6%和10% ;对玉米秸杆DM、N、0M、NDF体外降解率分别提高了 6%、8%、9% 和 12%。
[0013]本发明所提供的提高粗饲料利用效率的酵母菌株是该菌种保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC N0.1314。该菌种可以到中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。
[0014]在显微镜下观察，该菌株的细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为(3.5?4.5) ymX (7?13) ym。液体培养不产醭，管底有菌体沉淀；在麦芽汁琼脂培养基上，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状；在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，形成原始假菌丝或不发达的假菌丝，或无假菌丝；能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不发酵麦芽糖、半乳糖、 乳糖和蜜二糖，不分解脂肪，能同化硝酸盐。
[0015]可按下述方法培养上述酵母菌株CICC N0.1314:用接种环挑取菌体接到斜面上，在25-32°C下，斜面培养基上生长1-3天，再挑取斜面菌种接入液体培养基，在25-32°C下，培养1-3天，经离心可获得该菌株的菌体。所述培养基按重量份数计算， 包含以下组分:葡萄糖2.0份、蛋白胨2.0份、酵母浸粉1.0份、琼脂2.0份(液体培养基不加琼脂)、自然pH，溶剂为蒸馏水。
[0016]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:本发明的酵母菌株仏CICC N0.1314是一株具有极高活力，对粗饲料利用效率提高能力极强的菌株，其培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以用作酵母提高粗饲料利用效率的模式菌株，更重要的是可以直接用于提高粗饲料的利用效率。该菌株具有在提高反刍动物粗饲料利用效率的工业化应用前景。体外发酵46-50h后，CICC N0.1314添加浓度为0.25-0.75X 107cfu时对粗饲料水稻秸杆和玉米秸杆降解率提升效果最为明显，其中粗饲料水稻秸杆DM、N、0M、NDF体外降解率分别提高5%、7%、6% 和10% ;对玉米秸杆DM、N、0M、NDF体外降解率分别提高6%、8%、9%和12%。【具体实施方式】
[0017]实施例1:一种活性酵母菌在粗饲料利用效率中的应用，其步骤是:A、(Sknt/it/aCICC N0.1314 菌体的培养:用接种环挑取酵母菌株仏CICC N0.1314接到斜面培养基上，斜面培养基按重量份数计算，包含以下组分:葡萄糖2.0份、蛋白胨2.0份、酵母浸粉1.0份、琼脂2.0 份(液体培养基不加琼脂)，自然pH。在温度设置为30°C的培养箱里，培养1-3天，出现白色的菌体。然后，用接种环从斜面上挑取生长良好的菌体接到装有培养液的三角瓶中，培养液按重量份数计算，包含以下组分:葡萄糖2.0份、蛋白胨2.0份、酵母浸粉1.0份。在温度设置为30°C、转速为200rpm的摇床上培养1-3天，所得菌体离心(9000rpm) 10分钟，菌体用无菌生理盐水(0.8%)和无菌水洗涤，再离心，反复2-3次，即可获得白色无污染的仏/7办办 CICC N0.1314 酵母细胞。
[0018]B、人工瘤胃体外培养系统:在晨饲前通过痿管采集奶牛瘤胃液，用四层纱布过滤后与厌氧缓冲液以1:9的比例充分混合为发酵培养液。混合好的培养液在发酵前迅速通入二氧化碳2-3分钟后，置于39°C 的水浴摇床上等待培养。于体外发酵前24h预先在各厌氧发酵瓶中称取0.4或0.5或0.6 克经80或90或100或110目孔径筛粉碎后的粗饲料(水稻秸杆和玉米秸杆)，随即先后分别加入0.1-0.75X 107cfu浓度梯度的酵母菌培养液和50ml体外发酵培养液，并再次持续通入二氧化碳3分钟，加上瓶塞盖子后迅速使用针头放气将气压调节成0,此即Oh点的气压值。随后立即放置于39°C恒温培养箱中开始体外发酵48小时。
[0019]C、在粗饲料中加入ydVis CICC N0.1314提高了粗饲料利用效率:按照步骤2在各厌氧发酵瓶中称取0.4或0.5或0.6克经1mm孔径筛粉碎后的粗饲料 (水稻秸杆和玉米秸杆)，随即先后分别加入〇、〇.25X107cfu、0.50X107cfu和0.75X107cfu 浓度梯度的酵母菌株仏CICC N0.1314和50ml体外混合发酵培养液，并再次持续通入二氧化碳3分钟，加上瓶塞盖子后迅速使用针头放气将气压调节成0,此即Oh点的气压值。随后立即放置于39°C恒温培养箱中开始体外发酵48小时。体外发酵培养48小时后取出发酵瓶，发酵液过400目尼龙布后将残渣全部转移至石英坩埚中用热蒸馏水反复冲洗，随后置于l〇5°C烘箱中烘干8小时以DM，随后将测定过DM降解率后的残渣回收用样品袋密封保存，待测N、0M、NDF降解率。
[0020]所述的水稻秸杆和玉米秸杆分别进行粉碎80或90或100或110目。
[0021]体外发酵 48 小时后，CICC N0.1314 添加浓度为 0? 50X107cfu 时对粗饲料水稻秸杆和玉米秸杆降解率提升效果最为明显，其中粗饲料水稻秸杆DM、N、0M、 NDF体外降解率分别提高5%、7%、6%和10% ;对玉米秸杆DM、N、0M、NDF体外降解率分别提高 6%、8%、9%和 12%。
【主权项】
1.一种活性酵母菌在提高粗饲料利用效率中的应用，其步骤是:A、 利用人工瘤胃体外培养系统，通过添加不同浓度的CICC N0.1314 对粗饲料进行体外培养；B、所述的不同浓度为0.1-0.75X 107cfu ;C、人工瘤胃体外培养系统在早晨饲喂前通过痿管采集奶牛瘤胃液，用四层纱布过滤后 的奶牛瘤胃液与厌氧缓冲液以1:9的比例充分混合为发酵培养液；D、混合好的培养液在发酵前迅速通入二氧化碳2-4分钟后，置于39°C的水浴摇床上等 待培养，于体外发酵前22 — 26h预先在各厌氧发酵瓶中称取0.4 — 0.6克粗饲料，加入不 同浓度梯度的酵母菌培养液和40-60ml体外发酵培养液，再次持续通入二氧化碳2 — 4min， 加上瓶塞盖子后迅速使用针头放气将气压调节成0, Oh点的气压值，随后放置于39°C恒温 培养箱中开始体外发酵46 — 50小时；E、在粗饲料中加入CICC N0.1314不同添加浓度梯度为 0? 1-0.75X 107cfu。
【文档编号】C12R1/72GK105981915SQ201510055296
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月3日
【发明人】周传社, 刘海燕, 黄勇, 谭支良, 王祚, 汤少勋, 陈亮
【申请人】中国科学院亚热带农业生态研究所