一种利用丝素蛋白对dna保存的方法及试剂盒的制作方法

一种利用丝素蛋白对dna保存的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及DNA保存技术，尤其涉及一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒；本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，包括以下步骤：S1、将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理得到丝素蛋白涂层基底；S2、将待保存的目标DNA制成DNA溶液，添加至丝素蛋白涂层基底中，然后干燥处理得到样本基底；S3、向样本基底中加入抽提液，抽提后得到目标DNA；本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，包括丝素蛋白溶液、多孔基底以及抽提液；本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒，可快速保存DNA样品，使其在高温以及紫外线照射条件下保持分子结构和功能的完整，并快速抽提DNA用于检测，解决了目前DNA产品的保存只能在低温及避光保存的难题。
【专利说明】
-种利用竺素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及DNA保存技术，尤其设及一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 脱氧核糖核酸(DNA)是一种双链结构的分子，在生物细胞内，DNA可与蛋白质组成 染色体，构成生物体遗传密码，指导生物体内蛋白质的合成W及生命体的运作。DNA被广泛 应用于物种研究、身份鉴别、医学开发等领域。但DNA极易受紫外、溫度、氧化剂、福射等的破 坏，使得DNA的保存和运输受到了很大的限制，进而导致有关DNA研究和应用上的不便。
[0003] 为了避免功能损伤，核酸样品通常储存在-80°C冰箱或液氮里(-196°C)。比如生物 学家通常用乙醇从生物样本中抽提DNA，溶解在碱性(P册.5)缓冲液中并保存在低溫下，运 是由于碱性环境可W抑制酸性依赖的DNA降解过程。但是，低溫保存DNA样品给长距离运输 带来不便，并大大增加了运输和储藏的成本。据美国相关部口的统计，全美国每年大约有3 亿份人类核酸样品需要储藏保存，光购买用于样品储存的冰箱就需要约1.2亿美元的成本， 运还不算日常的场地和耗电费用。之前研究人员采用喷雾干燥、喷雾冷冻、冷冻干燥等方法 处理DNA样品，用于常溫下长时间运输和储藏DNA。虽然运些方法都达到了一定的效果，但很 多研究同时指出对于长链DNA分子而言，处理过程中采用的高剪切力会对DNA的天然螺旋结 构产生破坏，导致DNA功能损伤。
[0004] 目前市面上现有的一些DNA存储产品，FTATM card是一种W纤维素为基质的滤纸， 在运种纤维素基质滤纸上添加了可W使细胞裂解W及使蛋白质变性的化合物，通过运些化 合物，该产品可W将细胞样品中的细胞裂解，使DNA溢出W便保存。经过FTATM card的保存， DNA可被长途运输W及室溫下长时间保存。但是，将DNA从运种FTATM card中重新抽提出来 的步骤比较麻烦，需要用到一种特殊的DM抽提液才能将DM从滤纸中抽提出来。 Bioma化ica公司所生产的SampleMa化ix的主要作用成分则是能在极端环境中生存的节肢 动物、邮等体内提取的物质，运些极端生物能够在干燥环境中存活长达120年之久，基于从 运些生物中提取的物质的保护，SampleMatrix可W在高溫W及紫外破坏条件下保存DNA。但 是使用运种产品前，DNA需经过干燥处理，运不利于运种产品的大范围使用。GenVault公司 所生产的GenTegra DNA保存产品则是一种内置抗氧化保护和抗菌成分的惰性化学基质。对 于GenTegra和SampleMa化ix运两种产品来说，DNA均需要存储在一种特质的试管中，并且运 两种产品的主要作用成分均不易提取且价格昂贵，运两种产品每管存储DNA的量有限 (30ug)。
[0005] 丝素蛋白是从天然蚕丝纤维中提取出来的天然蛋白质，是由丝氨酸、丙氨酸、甘氨 酸等十八种氨基酸组成的。具有独特的理化性能及良好的生物相容性。丝素蛋白广泛应用 于生物医疗、组织工程等领域。现已有人用丝素蛋白材料作为阿霉素、辣根过氧化氨酶、膜 岛素等等药物的保存载体，但尚未有用丝素蛋白材料对核酸类物质进行保存的研究。丝素 蛋白来源丰富，价格低廉，且丝素蛋白材料可被加工成多元化的材料W及具有可调控的二 级结构，利用丝素蛋白材料保存DM使得DM在不同领域的应用具有了更广阔的可能性。

【发明内容】

[0006] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种物料来源丰富、价格低廉、常溫下 即可实现、可快速保存DNA样品并使其在高溫W及紫外线照射条件下保持分子结构和功能 的完整性的利用丝素蛋白对DNA保存的方法及试剂盒。
[0007] 本发明第一方面提供一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法，包括W下步骤：
[000引S1、将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理得到丝素蛋白涂层基底；
[0009] S2、将待保存的目标DNA制成DNA溶液，添加至丝素蛋白涂层基底中，然后干燥处理 得到样本基底；
[0010] S3、向样本基底中加入抽提液，抽提后得到目标DNA。
[0011] 应当说明的是，本发明中所指的"目标DNA"，指的是从目的生物中提取出的欲进行 保存的DNA样品。"DNA"又称去氧核糖核酸，是一种双链结构分子，由脱氧核糖核巧酸组成， 其可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。应当说明的是，本发明中的"DNA"应包 括但不限于单链DNA、闭环DNA、连接DNA、双链DNA、互补DNA，其中，双链DNA为通俗意义中的 真核生物的遗传物质，应当包括动物、植物、真菌等的染色体DNA，W及线粒体、叶绿体等细 胞器中的DNA。
[0012] 另外，单链DNA(single-stranded DNA)大部分DNAW双螺旋结构存在，但一经热 或碱处理就会变为单链状态。某些隧菌体粒子内含有单链环状的DNA，运样的隧菌体DNA在 细胞内增殖时则形成双链DNA。
[0013] 闭环DNA(closed circular DNA)没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA。由 于具有螺旋结构的双链各自闭合，结果使整个DNA分子进一步旋曲而形成=级结构。另外如 果一条或二条链的不同部位上产生一个断口，就会成为无旋曲的开环DNA分子。从细胞中提 取出来的质粒或病毒DNA都含有闭环和开环运二种分子。
[0014] 连接DNA化i址er DNA)，为核小体中除147bp核屯、DNA外的所有DNA。
[0015] 互补DNA(cDNA，complementary DNA):构成基因的双链DNA分子用一条单链作为模 板，转录产生与其序列互补的信使RNA分子，然后在反转录酶的作用下，WmRNA分子为模板， 合成一条与mRNA序列互补的单链DNA，最后再W单链DNA为模板合成另一条与其互补的单链 DNA，两条互补的单链DNA分子组成一个双链cDNA分子.因此，双链cDNA分子的序列同转录产 生的mRNA分子的基因是相同的.所W-个cDNA分子就代表一个基因.但是cDNA仍不同于基 因，因为基因在转录产生mRNA时，一些不编码的序列即内含子被删除了，保留的只是编码序 列，即外显子.所WcDNA序列都比基因序列要短得多，因为cDNA中不包括基因的非编码序 列---内含子。
[0016] 应当说明的是，本发明所指的多孔基底，因具有较高比表面积，其作用在于，通过 多孔结构，支撑和吸附丝素蛋白溶液中的有效成分W及DNA溶液中的有效成分，而加入抽提 液之后，又可实现纤维表面涂层的有效成分的快速分离。其种类应当包括但不限于多孔膜、 多孔非织造网、多孔纤维、发泡件等。多孔基底可包含一种或多种聚合物材料或天然纤维。
[0017] 所述聚合物材料可包括(但不限于)聚締控、聚(异戊二締）、聚(下二締）、氣化聚合 物、氯化聚合物、聚醋、聚酷胺、聚酷亚胺、聚酸、聚（酸讽）、聚讽、聚苯酸、聚（乙酸乙締醋）、 乙酸乙締醋的共聚物、聚憐腊、聚（乙締基醋）、聚（乙締基酸）、聚（乙締醇）w及聚(碳酸醋）。
[0018] 所述天然纤维包括植物纤维、动物纤维、人造纤维、无机纤维等。其中，植物纤维主 要组成物质是纤维素，是由植物上种巧、果实、茎、叶等处获得的纤维;动物纤维主要组成物 质是蛋白质，分为毛和腺分泌物两类;人造纤维为用纤维素、蛋白质等天然高分子物质为原 料，经化学加工、纺丝、后处理而制得的纺织纤维;无机纤维是W矿物质为原料制成的纤维， 如玻璃纤维、金属纤维等。
[0019] 合适的多孔基底可能具有各种形状和大小，如膜状、纸张、发泡件等。
[0020] 滤纸大多由棉质纤维组成，其表面有无数小孔可供液体粒子通过，而体积较大的 固体粒子则不能通过，滤纸具有较好的固体粒子过滤、大分子吸附等功能，且生产成本较 低、获取较为便捷。由于多孔基底所设及的材质众多，而滤纸具有前述优势，本发明中所述 的多孔基底优选为滤纸，作为较为适宜的实施方式，并在本发明后续内容中做进一步说明， 其它材质的多孔基底不再寶述。然而应当说明的是，凡是能够实现上述功能的多孔基底，均 应落入本发明的保护范围。
[0021] 进一步的，所述步骤S2中的DNA溶液，与丝素蛋白溶液混合后再添加至丝素蛋白涂 层基底中。
[0022] 具体的，所述步骤S1和S2中的丝素蛋白溶液浓度范围为1-30%。应当说明的是，丝 素蛋白溶液制备完成后，通常浓度为7-8%，经浓缩后可达30%，由于丝素蛋白溶液的浓度 在较大范围内，均体现出对DNA的保护效果，因此本发明中所述丝素蛋白溶液浓度范围为1- 30%。
[0023] 具体的，所述丝素蛋白溶液的浓度范围为3-6%。
[0024] 具体的，所述步骤S1中丝素蛋白溶液的浓度与步骤S2中丝素蛋白的浓度相等。
[0025] 进一步的，所述步骤S2中的DNA溶液，与丝素蛋白溶液和T邸缓冲液混合后再添加 至丝素蛋白涂层基底中。T邸是一种凝胶电泳缓冲液。它具有良好的导电性并且有利于DNA 分子迁移。T肥是由抓TA、TrisW及棚酸所组成。实验表明T肥能够帮助丝素蛋白材料更好的 保存DNA。
[00%]进一步的，所述步骤S1中将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理之后， 还包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥处理的步骤，W得到丝素蛋白涂层基底。多元 醇是指分子中含有=个或=个W上径基的醇类，醇类的作用在于，诱导丝素蛋白的无规卷 曲（silk I)转变为0-折叠 （silk II)，运种转变能够减少材料的溶解性并能增加降解时间 和机械强度。由于甲醇的挥发性和蛋白变性能力较强，有利于浸泡后的干燥处理，在本发明 后续实施例中，优选采用甲醇。
[0027] 应当说明的是，本发明中所述的抽提液应包括浓盐法、阴离子去污剂发、苯酪抽提 法、水抽提法中所采用的各种试剂，例如各种缓冲液，如化is-HCl缓冲液、PBS缓冲液等，凡 是能够实现将DNA自多孔基底上抽提的抽提液，均应落入本发明的保护范围。由于本发明的 目的在于保护已获取的DNA样品，步骤S3的抽提过程为二次抽提，其中杂质成分较少，本发 明中优选的抽提液为超纯水、化is-HCl缓冲液、或PBS缓冲液。
[0028] 本发明第二方面提供一种利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，包括丝素蛋白制剂 和多孔基底，所述丝素蛋白制剂包括丝素蛋白冻干粉、丝素蛋白溶液中的一种或多种，所述 多孔基底为不包含丝素蛋白的多孔基底、或经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理制得的丝素 蛋白涂层基底。
[0029] 应当说明的是，本发明中所述的试剂盒，可W多种实现形式，1)丝素蛋白冻干粉+ 多孔基底，使用时将丝素蛋白冻干粉配制成丝素蛋白溶液，并将部分丝素蛋白溶液添加至 多孔基底然后干燥处理W备用；2)丝素蛋白溶液+多孔基底，使用时，将部分丝素蛋白溶液 添加至多孔基底然后干燥处理W备用；3)丝素蛋白溶液+丝素蛋白涂层基底，无需前期准备 工作，直接使用即可。
[0030] 进一步的，还包括甲醇、乙醇、丙醇或多元醇、或者所述多孔基底为经过添加丝素 蛋白溶液后干燥处理并经甲醇、乙醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥处理的丝素蛋白涂层基底。 本发明中所述的试剂盒，可W在使用时自行添加甲醇等醇类后干燥处理，也可将丝素蛋白 涂层基底经醇类浸泡后干燥处理后密封保存。
[0031] 进一步的，还包括T邸缓冲液。
[0032] 进一步的，所述丝素蛋白溶液浓度范围为1-30%。
[0033] 具体的，所述丝素蛋白溶液的浓度范围为3-6%。
[0034] 进一步的，所述多孔基底为滤纸。
[0035] 进一步的，还包括抽提液。本发明中所述试剂盒中的抽提液，应包括浓盐法、阴离 子去污剂法、苯酪抽提法、水抽提法中所采用的各种试剂，例如各种缓冲液，如化is-HCl缓 冲液、PBS缓冲液等，凡是能够实现将DNA自多孔基底上抽提的抽提液，均应落入本发明的保 护范围。由于本发明的目的在于保护已获取的DNA样品，抽提液的作用在于将多孔基底中的 DNA二次抽提出来，其中杂质成分较少。因此本发明中所述的试剂盒，可W不包含抽提液，使 用时直接采用超纯水，也可包含非超纯水的其它抽提液，如化is-HCl缓冲液、PBS缓冲液等。
[0036] 借由上述方案，本发明至少具有W下优点:本发明的利用丝素蛋白对DNA保存的方 法，可快速保存DNA样品，使其在高溫W及紫外线照射条件下保持分子结构和功能的完整， 解决了目前DNA产品的保存只能在低溫(-20°C W下)及避光保存的难题。
[0037] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0038] 图1是本发明第一实施例中丝素蛋白涂层滤纸对DNA保护效果的凝胶电泳图；
[0039] 图2是本发明第一实施例中丝素蛋白涂层滤纸对DNA保护效果的相对灰度值结果 图；
[0040] 图3是本发明第一实施例中DNA溶液直接滴加在甲醇处理后的丝素蛋白涂层滤纸 进行处理后的相对灰度值结果图；
[0041] 图4是本发明第一实施例中DNA与丝素蛋白混合溶液滴加在甲醇处理后的丝素蛋 白涂层滤纸进行处理后的凝胶电泳图；
[0042] 图5是本发明第一实施例中DNA与丝素蛋白混合溶液滴加在甲醇处理后的丝素蛋 白涂层滤纸进行处理后的相对灰度值结果图；
[0043] 图6是本发明第一实施例中S种溫度下加入TOE对DNA保存效果影响的凝胶电泳 图；
[0044] 图7是本发明第一实施例中室溫下加入TBE对DNA保存效果影响的相对灰度值结果 图；
[0045] 图8是本发明第一实施例中37°C下加入TBE对DM保存效果影响的相对灰度值结果 图；
[0046] 图9是本发明第一实施例中45°C下加入TBE对DNA保存效果影响的相对灰度值结果 图；
[0047] 图10是本发明第二实施例中不同溫度和时间条件下丝素蛋白对DNA保存效果的凝 胶电泳图；
[0048] 图11是本发明第二实施例中室溫在不同时间下丝素蛋白对DNA保存效果的相对灰 度值对比结果图；
[0049] 图12是本发明第二实施例中37°C在不同时间下丝素蛋白对DNA保存效果的相对灰 度值对比结果图；
[0050] 图13是本发明第二实施例中45°C在不同时间下丝素蛋白对DNA保存效果的相对灰 度值对比结果图；
[0051] 图14是本发明第二实施例中各样品经高溫破坏后的PCR反应的凝胶电泳图；
[0052] 图15是本发明第=实施例中=种滤纸样品紫外照射不同时间后的凝胶电泳图；
[0053] 图16是本发明第=实施例中=种滤纸样品紫外照射不同时间后的相对灰度值对 比结果图；
[0054] 图17是本发明第S实施例中各样品经紫外破坏后的PCR反应的凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。W下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0化6] 实施例一
[0057]本发明一较佳实施例提供一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其所设及的实验 方法及实验对比结果具体如下：
[0化引1、实验方法
[0059] 1)再生丝素蛋白溶液的制备
[0060] 将30克家蚕生丝放入1化含有化20)3(2.12g/L)的沸水溶液中煮30分钟，期间需要 不断揽拌W提高脱胶率。随后用去离子水磋洗煮好后的脱胶丝W去除残余丝胶。将洗好后 的蚕丝蛋白纤维平铺于通风楓中通风干燥。取25克干燥过后的蚕丝纤维溶于lOOmL的Li化 溶液中（9.3M)，随后放入60°C烘箱中4小时，每小时用干净玻璃棒轻轻揽动溶液W确保蚕丝 纤维完全溶解。取出溶解后的溶液装入分子截留量为3500的透析袋中用夹子夹紧，随后将 透析袋放入不低于1:100比例的去离子水中透析36小时，去离子水每=小时换一次水。用高 速离屯、机W9000r/min的条件离屯、透析后的溶液20分钟，重复一次离屯、过程后，获得较干净 的丝素蛋白溶液。丝素蛋白溶液可置于4 °C冰箱中保存。
[0061] 丝素蛋白溶液的浓度可W利用蒸发称重法测定，具体操作如下：将干燥后的称量 皿标号后称重为Wo(g)，加入ImL丝素蛋白溶液在称量皿中，用电子天平称重为Wi(g)，将称量 皿放入60°C烘箱干燥6小时候后每隔20min称重一次直至称量皿重量不再改变时记录数据 为W2(g)，依据W下公式可得到丝素蛋白溶液的浓度。
[0062] 浓度（％ ) = [ (W2-Wo)/(W广Wo) ] X 100
[0063] 2) DM溶液的制备
[0064] 本发明所用总DM是从人成纤维细胞中提取而来，在提取DM前，需要将成纤维细 胞培养至=代W上W保证其细胞活力。细胞培养完成后需要用细胞计数器计算细胞数量， 估算出5xl06个细胞。依据DNA提取试剂盒使用手册（e.Z.N.A Tissue DNA Kit，0MEGA，中 国），用20化LPBS缓冲液(4°C，pH = 7.4)对细胞进行吹打重悬，随后向细胞悬液中加入25化 的细胞裂解酶使细胞裂解，用移液枪将细胞悬液吹打数次后置于65°C水浴锅中解育五分钟 W使细胞完全裂解。随后向裂解后的混合液中加入22化L的化缓冲液并幹旋均匀后放入70 °(：的水浴锅中解育十分钟。待混合液冷却到室溫后继续加入22化L无水乙醇并W最大的速 度满旋均匀，随后将混合液移至DNA收集柱中（收集柱已经与2mL收集管组合）。用8000巧m/ min的速度对收集柱进行一分钟离屯、。离屯、完成后丢弃下层收集管，向收集柱中继续加入 500化洗脱缓冲液后W8000rpm/min离屯、一分钟。随后将收集柱转移到一个新的2mL离屯、管 中并滴加70化L DNA清洗缓冲液后继续离屯、一分钟。重复运一过程后将收集柱转移到一个 新的2mL离屯、管中，Wl2000xg/min的速度高速离屯、两分钟使得收集柱内的乙醇完全挥发。 最后，在收集柱内加入10化L经过70°C预热后的DNA洗脱液，用lOOOOxg/min的速度对收集柱 进行离屯、，离屯、管中得到的溶液即为抽提出来的DNA，DNA溶液可放置于-20°C冰箱内保存。
[0065] 3)从细胞中抽提DNA浓度W及质量的确定
[0066] 从细胞中抽提出的DNA的浓度是由酶标仪(Synergy H1，BioTek，美国）。测取260nm 和280皿的吸光度通过公式计算得来。DNA浓度主要由W下公式确定:c(ngAiL) =A260 X 50 X稀释倍数。根据A260/A280的比值可W得到抽提DNA的纯度，当比值为1.7-1.9时，可认为 DNA的纯度在85%-95%范围内。0論的质量主要是用基于目标基因（2肥750)的？〔3^及 ZNF750基因测序两个手段进行评估。
[0067] 4)丝素蛋白涂层滤纸的制作及抽提
[0068] 首先将化学分析试纸(新星，杭州，中国）按照二十四孔板中孔径尺寸剪成大小一 致的滤纸小圆片（直径14mm)后，分别将运些滤纸小圆片放入二十四孔细胞培养板中 (Corning cos化r，中国）。将丝素蛋白溶液分别稀释成浓度为l%-30%(w/v)的工作浓度。 为了制作丝素蛋白涂层滤纸，需将10化1 1-30% (w/v)丝素蛋白溶液加入在二十四孔板中 的滤纸。随后将所有样品放入通风楓中通风干燥，待二十四孔板中滤纸干燥完全后每孔分 别加入10化1超纯水并于常溫下解育5分钟，用綴子挤压二十四孔板中滤纸W抽提丝素蛋白 溶液。根据同等条件下获得的丝素蛋白浓度标准曲线，用酶标仪对含丝素蛋白的抽提溶液 进行浓度测定(280nm)。本发明中定义丝素蛋白抽提回收率为：
[0069]
[0070] 5) DNA从丝素蛋白涂层滤纸中的抽提
[0071 ] DNA分子将会通过两种方式嵌入丝素蛋白涂层滤纸:直接在丝素蛋白涂层滤纸中 加入DNAW及将丝素蛋白涂层滤纸进行后处理后加入DNA。
[0072] 方法一:直接在丝素蛋白涂层滤纸中加入DNA溶液。将丝素蛋白溶液用超纯水分别 稀释成1、3、6 %，用超纯水将从细胞中抽提出的DNA原始溶液稀释成96ngAiL。将40化不同浓 度的丝素蛋白溶液与40化DNA溶液混合均匀后，将混合液加入到对应的分别经 不同浓度（1%-30%)丝素蛋白涂层的滤纸小圆片中。随后将二十四孔板放入通风楓中通风 干燥，待二十四孔板中滤纸全部干燥完全后，每个样品加入80化的超纯水对DNA进行抽提。 此种方法简称为S i化/DNA+f i 11 er。
[0073] 方法二：用甲醇对经丝素蛋白涂层的滤纸进行后处理。向二十四孔板中的滤纸中 每孔加入1(K)化的不同浓度丝素蛋白溶液（1%-30%)，随后将二十四孔板放入通风楓通风 干燥，待滤纸全部干燥完全后，每个样品加入ImL甲醇浸泡两小时后，继续将二十四孔板放 入通风楓通风干燥。将DNA溶液(96ngAiL，4化L)分别注入上述经过甲醇处理的丝素蛋白涂 层滤纸中。继续将二十四孔板放入通风楓中干燥，待所有样品均干燥完全后，每个样品中加 入80化超纯水对DNA进行抽提，对抽提液进行后续凝胶电泳测试。本发明中简称此种方法为 DNA+PT-mter。将DNA溶液（96ngAiL，40化）分别与不同浓度（1%-30%)的丝素蛋白溶液 (4化L)混合均匀，混合液分别注入经上述甲醇处理过的对应浓度丝素蛋白涂层滤纸中，待 所有样品干燥后，每个样品加入80化超纯水对样品中的DNA进行抽提。本发明中简称此种方 法为 S i 化/DNA+PT-f i 1 ter。
[0074] 6)利用TBE对DM保存进行优化
[0075] T邸是一种凝胶电泳缓冲液。它具有良好的导电性并且有利于DNA分子迁移。T邸是 由抓TA、TrisW及棚酸所组成。抓TA具有馨合儀离子的能力，能够在DNA凝胶电泳过程中抑 审化魁酶的活性。化13常用于配制生物缓冲液。将1义化13-6〇阿*6-抓14(1'肥）（抑=8.3)，丝 素蛋白溶液（3 %或6 % )和DNA溶液（96ng/化）按照体积比1:1:1混合均匀。将12化L 3 % si化/DNA/T邸混合液直接加入在滤纸中（简称为3%silk/DNA/T邸+filter);将120化6% S i Ik/DNA/T肥混合液加入在经甲醇处理过的6 %丝素蛋白涂层滤纸中（简称为6 % si Ik/ DNA/T邸+PT-filter)。待所有样品制作完毕，将所有样品放入通风楓中通风干燥直至所有 样品完全干燥。每个样品中加入80化超纯水后解育五分钟，用綴子对每个样品反复挤压抽 提。收集每个样品的抽提液后进行后续实验。
[0076] 7)凝胶电泳及基于凝胶电泳的定量分析
[0077] 用电子天平称取0.8g的琼脂糖溶于lOOmL的0.5xlYis-borate-抓TA(T邸）缓冲液 中，将溶液至于微波炉中高火加热两分钟直至琼脂糖全部融化于T邸缓冲液中，向加热后的 TBE缓冲液中加入10化Gel RED(BIOTIUM)染色剂并摇晃均匀，将染色后的琼脂糖缓冲液缓 缓倒入已经调水平并插入制胶梳的制胶板中静止1个小时待琼脂糖溶液完全凝固后拔出制 胶梳，将制好的琼脂糖胶板放入电泳仪器中。为了避免实验过程中造成的人为误差，在每板 跑胶时均设置了一个控制组DNA样品（96ngAiL，-80°C)。制胶完成后，每个胶孔上样量为扣 L，所有样品在上样前应与DNA loading buffer染色液按体积比为1:5混合均匀。凝胶电泳 时间为1.5小时，电压为100V。待凝胶电泳完成后，轻轻的取出琼脂糖胶板，将胶板置于暗室 中放在245nm的紫外灯下进行拍照。得到凝胶电泳图片后，用Image J软件对照片进行处理， 通过软件的处理，可W得到每个条带的灰度值，定义样品相对灰度值W及样品DNA抽提率如 下：
[007引
[0079] 2、实验对比结果
[0080] 1 )DNA从丝素蛋白滤纸中的抽提
[0081 ] 将40化DNA分别与40化不同浓度的丝素蛋白溶液（1、3、6% )混合均匀后，将S种 混合液分别滴加在二十四孔板中相对应浓度（1、3、6%)的丝素蛋白涂层滤纸中，将二十四 孔板放置通风楓于室溫下通风干燥。待所有滤纸样品均干燥完毕后，在每个样品中加入80y L超纯水并解育5分钟，随后用綴子对运些滤纸样品进行挤压抽提。用凝胶电泳的方法对抽 提液中的DNA进行质量W及半定量的分析评估。凝胶电泳结果如图1所示，条带1和2采用对 照组标准DNA(96ng/iiL);条带3和4采用总DNA;条带5和6采用l%silk/DNA;条带7和8采用 3%si化/DNA;条带9和10采用6%si化/DNA;其中，条带3、5、7、9的样品为经滤纸处理抽提后 的样品凝胶电泳结果;条带4、6、8、10为溶液样品直接凝胶电泳结果。条带灰度值对比结果 如图2所示，图中SF为silk简称，W下各实施例相同，相对灰度值的计算为经滤纸处理抽提 后的样品灰度与溶液样品灰度的比值。从图1和图2可知，含有1、3、6%丝素蛋白的滤纸样品 抽提液经凝胶电泳后可看到清晰无降解的条带，而不含丝素蛋白的DNA滤纸样品的条带则 明显弱于含丝素蛋白的DNA滤纸样品。3%silk/DNA+filter和6%si化/DNA+filter样品抽 提液的相对灰度值分别为0.9和0.7，显著高于(p<0.05)DNA+f ilter样品抽提率的灰度值。 W上结果表明丝素蛋白能够在样品制备W及抽提步骤中对DNA分子有保护作用。
[0082] 2)甲醇处理丝素蛋白涂层滤纸法保存DNA
[0083] 甲醇处理丝素蛋白能够诱导丝素蛋白的无规卷曲（silk I)转变为0-折叠 （silk II)，运种转变能够减少材料的溶解性并能增加降解时间和机械强度。本实施例分别将DNA 和DNA/si化混合液滴加在经过甲醇处理过的丝素蛋白涂层滤纸中（用1毫升的甲醇浸泡1、 3、6%丝素蛋白涂层滤纸2小时W诱导0-折叠的形成），做进一步测试。
[0084] 将DNA溶液(96ng/山）不与丝素蛋白溶液混合，直接滴加在甲醇处理后的丝素蛋白 涂层滤纸（1、3、6%丝素蛋白处理）中，相对灰度值如图3所示，可见随着处理滤纸的丝素蛋 白浓度的提高，丝素蛋白对DNA的保护效果得到一定程度的提高，但是差异并不显著。
[0085] 将DNA溶液(96ng Ail)与1、3、6 %丝素蛋白溶液混合，分别滴加在相应浓度的经甲 醇处理过的丝素蛋白涂层滤纸（1、3、6%丝素蛋白处理）中后，凝胶电泳结果和条带灰度值 对比结果分别如图4和图5所示，图4中，条带1和2采用对照组标准DNA(96ngAiL);条带3和4 采用总DNA;条带5和6采用l%silk/DNA;条带7和8采用3%silk/DNA;条带9和10采用6% silk/DNA;其中，条带3、5、7、9的样品为经滤纸处理抽提后的样品凝胶电泳结果;条带4、6、 8、10为溶液样品直接凝胶电泳结果。图5中，相对灰度值的计算为经滤纸处理抽提后的样品 灰度与溶液样品灰度的比值。从图4和图5可知，3%31化/0魁+?1'寸1116'和6%31化/0麻+ PT-f i 1 ter样品抽提液与DNA+f i 1 ter样品抽提液相比具有明显更高的相对灰度值(0.8)。
[0086] 比较图3和图5,将丝素蛋白与DNA的混合液加入到经甲醇处理过的丝素蛋白涂层 滤纸中，相比于直接将DNA滴加到经甲醇处理的丝素蛋白涂层滤纸中，更加有利于DNA的保 存。
[0087] 基于W上抽提实验中，我们选择了 W下两种滤纸样品制备方法来进行后续的稳定 性研究：（1) 3 % S i 化/DNA+f ilter;(2)6%si 化/DNA+PT-f i 11 er。
[0088] 3)T邸对DNA保存的影响
[0089] 本发明评估了在丝素蛋白/DM混合液中加入T肥对DNA保存的影响。所有样品分别 放置于不同溫度中保存二十四小时后再进行检测。凝胶电泳结果如图6所示，其中，条带1和 5采用标准样DNA(96ng/iiL)，条带巧日6为DNA+filter，条带3和7为3%31化/0臟+門11日'，条 带4和8为6%silk/DNA+PT-filter，所有的滤纸样品均用IxT邸缓冲液进行抽提。在S种不 同存储溫度下，含有T肥的样品条带明显较不含TBE的样品条带更加清晰明亮。S种不同存 储溫度(室溫、37°C、45°C)下条带灰度值对比结果分别如图7至9所示，例如，存储在45°C中 的3 % S i化/DNA/T邸+f i 11 er样品的相对灰度值达到了 0.7，而3 % S i化/DNA+f i 1 ter仅仅只 有0.1 (p<0.05)。综合上述实验，TBE能够帮助丝素蛋白材料更好的保存DM。
[0090] 实施例二
[0091] 本发明提供实施例一中利用丝素蛋白对DNA保存的方法，在不同溫度下对DNA稳定 性的影响结果，其所设及的实验方法及实验对比结果具体如下：
[0092] 1、实验方法
[0093] 1)两种DNA丝素蛋白滤纸膜的制备
[0094] W实施例一中的方法分别制作3%silk/DNA+filter样品W及6%silk/DNA+PT- mter样品。待所有滤纸样品制作完毕后用真空封口机对所有样品进行真空封口。最后将 各样品分别保存于室溫、37°C、W及45°C中。
[0095] 2)丝素蛋白DNA冻干粉的制备
[0096] 取40化DNA溶液分别与40化浓度为0、3、6 %的丝素蛋白溶液混合均匀，将S种溶 液放入液氮中冷冻。待所有样品冷冻完成后，将样品放入冻干机中进行冻干。两天后，待所 有样品冻干完成后，取出所有样品。
[0097] 3)PCR 反应
[009 引上游引物：5'-4414机616(：(：1'(：此4666141'-3'（569 10^:1);下游引物：5'- GTACTTACCAGAGGTGGGCAGTG-3'（SEQIDN0:2);每个反应包含W下体系：5化10xPCR Buffer、化L lOmM dNTPs、lU Taq酶、400nM上游引物、400nM下游引物、5化模板DNA、d地20。 每个反应体系总体积为SOwLdPCR反应主要如下表所示：
[0099] 表1 PCR反应条件
[0100]
[0101] 4)切胶纯化W及基因测序
[0102] 待PCR反应产物凝胶电泳完成后，在紫外灯下小屯、地用小刀将含有条带的凝胶切 下之后放入2mL离屯、管中。根据切出的凝胶重量，向离屯、管中加入3倍体积的溶胶缓冲液。将 离屯、管置于50°C水浴锅中解育10分钟直至凝胶全部溶解。随后将离屯、管中的溶液转移至切 胶纯化试剂盒提供的吸附柱中，用缓冲液反复冲洗吸附柱W去除杂质。待杂质去除完全之 后用50化洗脱液抽提DNA。将抽提纯化后的DNA送至测序公司测序检测(金维智，苏州）。待测 序检测完毕后，用NCBI基因库比对测序结果与ZNF750基因。
[0103] 2、实验对比结果
[0104] 1)基于凝胶电泳分析的DNA稳定性分析
[0105] 按照不同方法将DNA保持在丝素蛋白涂层滤纸中，在特定时间取出后每个样品加 入80化超纯水进行抽提，将抽提后的溶液进行凝胶电泳成像。如图10所示，图中条带1、4、7 为DNA滤纸样品；条带2、5、8为3 % si 化/DNA+f i 1 ter;条带3、6、9为6 % si 化/DNA+PT-f i 1 ter， 图11至图13为根据图10中各条带灰度计算出的不同溫度下（室溫、37°C、45°C)在不同时间 (3天、10天、40天）的相对灰度值结果，由图10-13可知，不含丝素蛋白的DNA对照样在滤纸中 降解迅速。在相同溫度、相同时间条件下，6 % S i化/DNA+PT-f i 1 ter组样品与3 % S i lk/DNA+ f iIter和对照组相比，具有更好的保存DNA的效果，例如，37°C时，6%silk/DNA+PT-f iIter 组样品依然有清晰条带，其相对灰度值为0.4，明显高于3 % si Ik/DNA+fi Iter (0.3)和对照 组(0.1)。
[0106] 2)经丝素蛋白保存的DM的PCR反应
[0107] Zinc finger protein 750(ZNF750)即锋指蛋白750基因，其通过抑制原始基因而 诱导分化基因来控制上皮内稳态，该基因的突变可能引起癌症或是牛皮癖。本发明对 ZNF750基因（53化p)PCR扩增反应W验证经丝素蛋白保存过的DNA的活性。
[0108] 如图14所示，各条带采用的样品为:条带1为DNA ladder,条带2为存储于-80°C的 控制组DNA(96ng/化）；条带3为DNA+filter;条带4为3%Silk/DNA+filter，条带5为6% Si化/DNA+PT-f i 1 ter，条带6为DNA冻干粉;条带7为3 % Si化/DNA冻干粉，条带8为6 % Si Ik/ DNA冻干粉。所有滤纸样品及冻干粉样品均在45°C条件下保存二十四小时后进行抽提，抽提 液进行ZNF750基因的PCR反应。由图可见，对照组DNA溶液在进行PCR扩增反应后在500bp左 右可见清晰明亮的条带。但是在经过45°C高溫作用二十四小时后，条带3的DNA滤纸样品条 带亮度明显下降。条带4和5的含有丝素蛋白的3%silk/DNA+filter和6%Silk/DNA+PT- filter样品均在5(K)bp处有清晰明亮条带，且条带强度明显高于DNA滤纸样品。同样的，将丝 素蛋白DNA混合液进行冻干后所得到的PCR反应条带在50化P处也有清晰明亮的条带并且条 带亮度均比DNA滤纸组样品条带高。基于W上结果，经由丝素蛋白保存的DNA在高溫破坏后 依然可W在PCR反应中当作模板DNA。
[0109] 本发明将上述PCR产物所得到的DNA进行测序得到的测序结果与NCBI中ZNF750基 因序列做比对可W得到基因一致性与差异结果。在溶液样品中，DNA样品W及3%silk/DNA 样品的基因一致性达到了 99%，运表明了图14中所获得的PCR产物正是ZNF750基因扩增产 物。并且丝素蛋白的存在不会影响PCR过程W及基因测序。3 % S i化/DNA和6 % S i化/DNA+PT- fi 1 ter滤纸样品在经过45 °C高溫破坏二十四小时后，仍然具有与ZNF750基因大于99 %的一 致性，运个结果表明了经由丝素蛋白保存的DNA即使是在高溫下也能够较好的保存DNA使其 能够作为PCR反应的模板。同时，S种冻干粉样品（DNA，3 % S i 1 k/DNA，6 % S i 1 k/DNA)作为对 照，其结果表明均与ZNF750基因有99%的一致性。与经丝素蛋白滤纸保存的DNA相比，冻干 虽然也能在一定程度上在高溫环境下保存DNA，但经冻干保存的DNA质量并没有明显高于丝 素蛋白滤纸法，且制作冻干粉需要用到特殊的设备(冻干机），制备时间也相对较长。
[0110] 表2各方法对DNA保存效果的PCR检测结果表
[0111]
[0112] 实施例S
[0113] 本发明提供实施例一中利用丝素蛋白对DNA保存的方法，在紫外光照射下对DNA稳 定性的影响结果，其所设及的实验方法及实验对比结果具体如下：
[0114] 1、实验方法
[0115] 本实施例所设及到的实验方法，如再生丝素蛋白溶液的制备、DNA溶液的制备、凝 胶电泳及基于凝胶电泳的定量分析、PCR反应、切胶纯化W及基因测序、W及丝素蛋白DNA冻 干粉的制备，与实施例一和二相同，不再寶述。本实施例设及两种DNA丝素蛋白滤纸膜的制 备，其方法如下：
[0116] 制作3%51化/0麻+門116'样品^及6%51化/0麻+?1'寸1116'样品。分别将0麻+ Fi 1 ter、3 % Si 化/DNA+f i 1 ter和6 % Si 化/DNA+PT-f i 1 ter样品放置于紫外灯(245nm)下分别 照射1、2、10小时。
[0117] 2、实验结果
[0118] 1)基于凝胶电泳成像的DNA稳定性分析
[0119] 将 S 种滤纸样品（DNA+filter，3%Si 化/DNA+filter，6%Si化/DNA+PT-filter)放 置于紫外灯(245nm)下分别照射1、2、10小时，待照射完毕后取出所有滤纸样品用超纯水对 每个滤纸样品进行抽提。如图15所示，条带1、5、9为存储于-80°C的控制组DNA(96ngAiL)，条 带2、6、10为 DNA+filter，条带3、7、11为3%Si 化/DNA+filter，条带4、8、12为6%Silk/DNA+ PT-filter，由图可知，对照组DNA滤纸样品在紫外照射一小时后就已经完全降解，而3% Silk/DNA+filter和6%Silk/DNA+PT-filter即使是在两小时的紫外照射后依然有较清晰 的条带。6%Si化/DNA+PT-filter在经过10小时的紫外照射后依然有一定的条带。如图16所 示，根据凝胶电泳图所计算出的相对灰度值也说明了相同的趋势，6%Si化/DNA+PT-filter 相比较3 % Si Ik/DNA+fi 1 ter和DNA滤纸样品在所有的时间点都有更加高的相对灰度值。因 此，与高溫条件下DNA的稳定性实验一致，丝素蛋白能够更好的在紫外破坏下保存DNA。
[0120] 2)经丝素蛋白保存的DNA的PCR反应
[0121] 所有样品经紫外照射两小时后加超纯水进行抽提，对抽提液进行ZNF750基因 PCR 扩增反应。如图17所示，条带1-8分别为DNA ladder、存储于-80°C的控制组DNA(96ng/iiL)、 DNA+f i 1 ter、3 % Si 化/DNA+f i 1 ter、6 % Si 1 k/DNA+PT-f i 1 ter、DM冻干粉、3 % Si 1 k/DNA冻干 粉、W及6%Si化/DNA冻干粉。由图可知，控制组样品（未经紫外照射的DNA溶液）、6%Silk/ DNA+PT-f i Iter、DNA冻干粉、3 % Si化/DM冻干粉、6 % Si化/DM冻干粉在紫外破坏两小时后 均能在50化p左右处出现清晰明亮的条带，3%Silk/DNA+filter在紫外破坏两小时后具有 微弱的条带。运表明丝素蛋白W及冻干粉样品均能在紫外破坏下对DNA起到保护作用，经运 些样品保存的DNA能够用于PCR反应。
[0122] 将W上所有PCR扩增产物用胶纯化试剂盒进行纯化抽提后进行ZNF750基因测序。 待得到所有样品的测序结果后与NCBI数据库进行比对可得到基因一致率(identity)与基 因缺失数(gaps)。结果如表3所示，所有能从图17中看到清晰条带的样品的基因比对一致率 均在99% W上，基因缺失数为1或2。研究表明丝素蛋白因其含有丰富的络氨酸而具有吸收 紫外线的功能，能够在一定范围紫外破坏下保护DNA。
[0123] 表3紫外破坏下样品基因测序的一致性和基因缺失数
[0124]
[0125] W上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和 变型，运些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:包括以下步骤： 51、 将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理得到丝素蛋白涂层基底； 52、 将待保存的目标DNA制成DNA溶液，添加至丝素蛋白涂层基底中，然后干燥处理得到 样本基底； 53、 向样本基底中加入抽提液，抽提后得到目标DNA。2. 根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:所述步骤S2中 的DNA溶液，与丝素蛋白溶液混合后再添加至丝素蛋白涂层基底中。3. 根据权利要求2所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:所述步骤S1和 S2中的丝素蛋白溶液浓度范围为1 -30 %。4. 根据权利要求3所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:所述丝素蛋白 溶液的浓度范围为3-6 %。5. 根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:所述步骤S2中 的DNA溶液，与丝素蛋白溶液和TBE缓冲液混合后再添加至丝素蛋白涂层基底中。6. 根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:所述步骤S1中 将丝素蛋白溶液添加至多孔基底中，然后干燥处理之后，还包括甲醇浸泡后干燥处理的步 骤，以得到丝素蛋白涂层基底。7. 根据权利要求1所述的利用丝素蛋白对DNA保存的方法，其特征在于:所述抽提液为 超纯水、Tr is-HCl缓冲液、或PBS缓冲液。8. -种利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，其特征在于：包括丝素蛋白制剂和多孔基 底，所述丝素蛋白制剂包括丝素蛋白冻干粉、丝素蛋白溶液中的一种或多种，所述多孔基底 为不包含丝素蛋白的多孔基底、或经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理制得的丝素蛋白涂层 基底。9. 根据权利要求8所述的利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，其特征在于:还包括甲醇、 乙醇、丙醇或多元醇、或者所述多孔基底为经过添加丝素蛋白溶液后干燥处理并经甲醇、乙 醇、丙醇或多元醇浸泡后干燥处理的丝素蛋白涂层基底。10. 根据权利要求8所述的利用丝素蛋白对DNA保存的试剂盒，其特征在于:还包括TBE 缓冲液。
【文档编号】C12N15/10GK106047859SQ201610388202
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】王晓沁, 刘雅文
【申请人】苏州大学