一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法
【专利摘要】本发明涉及一种茶黄素双没食子酸酯(TF3)的酶法制备方法。该方法包括：以黄冠梨为原料，分离纯化得到多酚氧化酶(PPO)；通过两步法结合Triton X?100反相油包水微乳系统制备得到磁性Fe3O4?CS纳米载体；以戊二醛为交联剂将PPO固定在磁性Fe3O4?CS纳米粒子的表面；以EGCG和ECG为反应物，利用固定化PPO催化合成得到TF3。
【专利说明】
-种酶法制备茶黄素双没食子酸醋的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种W固定化多酪氧化酶催化合成茶黄素双没食子酸醋的方法。
【背景技术】
[0002] 茶黄素双没食子酸醋(TF3)是红茶中茶黄素类的一种主要单体，也是红茶茶汤的 色泽及风味的主要指标。近年来，TF3的医药保健功能受到了极大的关注，但是红茶中TF3的 含量极低，而且其纯化步骤繁琐耗时。
[0003] 黄冠梨中多酪氧化酶(PP0)具有较强的催化合成TF3的能力。磁性纳米颗粒具有高 的比表面积、超顺磁性、生物相容性、低毒W及高的回收率等特性，因此在食品加工、检测、 药物给药W及生物分离等多种领域具有广泛的应用前景。然而，磁性纳米颗粒在水溶液中 易发生凝聚沉降从而限制了其的实际应用。壳聚糖(CS)改性磁性纳米颗粒被广泛应用在生 物医药、酶的固定化、生物分离、食品检验、废水处理和环境监测等邻域。W戊二醒为交联 剂，将PK)固定在磁性壳聚糖纳米载体上具有重要的研究应用价值。
[0004] 目前关于应用固定化的梨pro催化合成TF3的方法尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明目的旨在提供一种快速、高效的制备茶黄素双没食子酸醋的方法，实现本 发明的具体方案如下：
[0006] (1)选用黄冠梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)为原料，进行多酪 氧化酶(PP0)的分离纯化。匀浆法提取粗酶液，经不同饱和度硫酸锭溶液盐析，透析后上 DEAE S邱harose Fast Flow层析柱，化C1溶液梯度洗脱，收集具有酶活的洗脱组分，脱盐浓 缩，纯化得到一种多酪氧化酶的同工酶。
[0007] (2)通过两步法结合化iton X-100反相油包水微乳系统制备得到磁性化3〇4-CS纳 米载体。
[000引（3似戊二醒为交联剂将步骤(1)中的PK)固定在磁性化3化-CS纳米粒子的表面。
[0009] (4)WEGCG和ECG为反应物，利用步骤(3)中固定化酶催化合成得到TF3。催化反应 的最佳时间约为化，TF3产率为39.31%。重复利用性实验表明，固定化酶循环使用8次依然 可W达到催化效率的90% W上。
[0010] (5)将步骤(4)制得的TF3粗液，经半制备高效液相色谱进行纯化。色谱柱为￥1(：- Pack 0DS-A(250X20mm，5mm)，应用乙腊-乙酸乙醋（26:74，v/v)溶液洗脱色谱柱，检测波长 28化m。分离后的样品自动分部收集，合并TF3溶液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到TF3单体， 纯度大于98 %。
【附图说明】
[OCm]图1多酪氧化酶NaCl梯度洗脱曲线
[001^ 图2差示扫描量热分析图：（a)Fe304和（b)Fe304-CS
[0013] 图3固定化pro催化合成茶黄素双没食子酸醋HPLC色谱图
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
[001引实施例1:
[0016] (1)称取500g梨(黄冠梨)切成碎块(冷冻-20°C)，放入组织捣碎机，加入适量PVPP， 再加入250血预冷的憐酸盐缓冲液（10mM，pH 6.9)。捣碎5min(3min+2min分两次进行，中间 停5min)，四层纱布过滤，压挤法挤出滤液，滤渣放入研鉢中，加入适量石英砂，250mL缓冲液 冰浴中研磨（匀浆5min)，四层纱布过滤，挤压法挤出滤液，合并两次滤液，4°C条件下 800化pm离屯、15min，取上清即为粗酶液。
[0017] (2化步骤（1)制得粗酶液中，缓慢加入硫酸锭粉至70%饱和度，操作在冰浴中进 行。4°C冰箱过夜，10000巧m离屯、lOmin，收集盐析蛋白。
[001引（3)将步骤(2)中得到的盐析蛋白装入孔径为8000-14000kDa的透析袋中，扎紧袋 口浸没于lOmM憐酸盐缓冲液(pH 6.9)中透析脱盐，每隔化换次水，置于4°C冰箱中过夜后， 聚乙二醇20000适当浓缩得粗酶液，4°C下保存备用。
[0019] (4)S氯化铁与硫酸亚铁W摩尔比为2:1溶解于纯水中（纯水预先通入氮气20min 排除其中溶解的化）。在25°C揽拌转速为lOOOr/min条件下向反应体系中逐滴加入浓氨水溶 液至反应液pH值在8-10之间化学沉淀被进行。沉淀在80°C水浴条件下加热30min陈化后，纯 水洗涂=次。最后将磁性纳米颗粒湿法保存在-20°C条件下，避免磁性聚集体的生成和利于 后续工作的使用。
[0020] (5)将2.0g壳聚糖(CS)粉末溶解在200mL 2%的醋酸溶液中。环己烧、正己烧和CS 溶液按体积比为11:6:4进行混合后加入步骤(4)制得的适量Fe3〇4悬浊液(F63化干重约为 2邑），逐渐加入化iton X-100并不断揽拌至溶液呈亮色。在反应体系中加入40mL 5M的化0H 溶液后，60°C水浴反应化制备得到壳聚糖纳米颗粒。将得到的磁性化3化-CS纳米颗粒用强力 磁铁分离，先后用乙醇和纯水漂洗S次。最后将磁性Fe3〇4-CS纳米颗粒湿法保存在4°C冰箱 待用。
[00別](6)将步骤(5)磁性化3〇4-CS纳米颗粒(约1 OOmg)被分散在60血浓度为4 %的戊二醒 溶液中，常溫条件下于摇床中W12化/min的转速震荡交联地。强力磁铁收集纳米颗粒，用纯 水将未交联上的戊二醒冲洗干净。将步骤(3)50mL梨多酪氧化酶液(25mg)加入到经戊二醒 交联好的磁性壳聚糖纳米颗粒中，常溫条件下于摇床中W12化/min的转速固定化化。强力 磁铁收集固定化酶。
[0022] (7)称取茶多酪粉末100mg溶解于200mL巧樣酸-憐酸盐缓冲液(50mM，pH5.8)中， 加入步骤(6)固定化酶，加入ImL过氧化氨溶液，常溫条件下于摇床中W12化/min的转速震 荡反应化，得到富含TF3粗品。
[0023] (8)将步骤(7)富含TF3粗品，经半制备高效液相色谱进行纯化。色谱柱为YMC-化ck 0DS-A( 250 X 20mm，5mm)，应用乙腊-乙酸乙醋（26:74，v/v)溶液洗脱色谱柱，流速为1.5mL/ min，检测波长28化m。分离后的样品自动分部收集，每管收集3mL，合并TF3溶液，旋转蒸发浓 缩，冷冻干燥，得到TF3单体，纯度大于98 %。
[0024] 实施例2:
[0025] (1)称取500g梨(黄冠梨)切成碎块(冷冻-20°C)，放入组织捣碎机，加入适量PVPP， 再加入500血预冷的憐酸盐缓冲液(50mM，pH 6.8)。捣碎5min(3min+2min分两次进行，中间 停5min)，四层纱布过滤，压挤法挤出滤液，滤渣放入研鉢中，加入适量石英砂，250mL缓冲液 冰浴中研磨（匀浆5min)，四层纱布过滤，挤压法挤出滤液，合并两次滤液，4°C条件下 800化pm离屯、15min，取上清即为粗酶液。
[0026] (2)在步骤（1)制得粗酶液中，缓慢加入硫酸锭粉至70%饱和度，操作在冰浴中进 行。4°C冰箱过夜，10000巧m离屯、lOmin，收集盐析蛋白。
[0027] (3)将步骤(2)中得到的盐析蛋白装入孔径为8000-14000kDa的透析袋中，扎紧袋 口浸没于lOmM憐酸盐缓冲液(pH 6.9)中透析脱盐，每隔化换次水，置于4°C冰箱中过夜后， 聚乙二醇20000适当浓缩得粗酶液，4°C下保存备用。
[00%] (4)将步骤（3)得到的粗酶液加样于经过lOmM憐酸盐缓冲液(PH7.0平衡的DEAE S邱harose Fast Flow阴离子交换柱（4 20 XI. 5cm)，应用AKTA蛋白质纯化仪用平衡缓冲 液冲洗200血，然后进行加盐梯度洗脱。分别用含0、0.05、0.1、0.3、0.5M化C1，pH值7.0的憐 酸盐缓冲液进行梯度洗脱，洗脱速度为0.3mL/min，每个梯度洗脱3个柱体积，分部收集每管 3mL，紫外检测波长为280nm。检测有紫外吸收管中PP0活性，收集PP0活性峰。将所得酶活最 高的蛋白组分经lOkDa超滤离屯、管浓缩脱盐后备用。
[0029] (5)S氯化铁与氯化亚铁W摩尔比为2:1溶解于纯水中（纯水预先通入氮气20min 排除其中溶解的化）。在25°C揽拌转速为lOOOr/min条件下向反应体系中逐滴加入浓氨水溶 液至反应液pH值在8-10之间化学沉淀被进行。沉淀在80°C水浴条件下加热30min陈化后，纯 水洗涂=次。最后将磁性纳米颗粒湿法保存在-20°C条件下，避免磁性聚集体的生成和利于 后续工作的使用。
[0030] (6)将l.Og壳聚糖(CS)粉末溶解在lOOmL 2%的醋酸溶液中。环己烧、正己烧和CS 溶液按体积比为11:6:4进行混合后加入步骤（5)制得的适量Fe3〇4悬浊液(F63化干重约为 1邑），逐渐加入化iton X-100并不断揽拌至溶液呈亮色。在反应体系中加入20mL 5M的化0H 溶液后，60°C水浴反应化制备得到壳聚糖纳米颗粒。将得到的磁性化3化-CS纳米颗粒用强力 磁铁分离，先后用乙醇和纯水漂洗S次。最后将磁性Fe3〇4-CS纳米颗粒湿法保存在4°C冰箱 待用。
[00川 （7)将步骤(6)磁性Fe304-CS纳米颗粒(约lOmg)被分散在6血浓度为4 %的戊二醒溶 液中，常溫条件下于摇床中W12化/min的转速震荡交联地。强力磁铁收集纳米颗粒，用纯水 将未交联上的戊二醒冲洗干净。将步骤(4)5mL梨多酪氧化酶(2mg)液加入到经戊二醒交联 好的磁性壳聚糖纳米颗粒中，常溫条件下于摇床中W12化/min的转速固定化化。强力磁铁 收集固定化酶。
[0032] (8)分别称取EGCG和ECG各15mg溶解于60mL憐酸盐缓冲液(50mM，pH 6.0)中，加入 步骤(7)固定化酶，通入氧气(通入最大气流而不产生过量气泡），揽拌，恒溫水浴30°C反应 化，得到TF3粗品。
[0033] (9)将步骤（8)TF3粗品，经半制备高效液相色谱进行纯化。色谱柱为YMC-化ck 0DS-A( 250 X 20mm，5mm)，应用乙腊-乙酸乙醋（26:74，v/v)溶液洗脱色谱柱，流速为1.5mL/ min，检测波长28化m。分离后的样品自动分部收集，每管收集3mL，合并TF3溶液，旋转蒸发浓 缩，冷冻干燥，得到TF3单体，纯度大于98 %。
【主权项】
1. 一种磁性纳米颗粒固定化多酚氧化酶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤： (1) 选用黄冠梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)为原料，进行多酸氧化 酶(PPO)的分离纯化。 (2) 通过两步法结合Triton X-100反相油包水微乳系统制备得到磁性Fe3〇4_CS纳米载 体。 (3) 以戊二醛为交联剂将取步骤（1)中的PP0固定在磁性Fe3〇4_CS纳米粒子的表面制备 得到磁性纳米颗粒固定化PP0。2. -种茶黄素双没食子酸酯的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤： (1) 以EGCG和ECG为反应底物，利用磁性纳米颗粒固定化PP0催化合成得到TF3。 (2) 将步骤（1)制得的TF3粗液，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到TF3单体，纯度大 于 98 %。
【文档编号】C12P17/16GK106047851SQ201610435650
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】曾晓雄, 雷时成
【申请人】南京农业大学