一种固定的微生物体系及其制备方法和水体毒性的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种固定的微生物体系，包括：微生物载体，所述微生物载体由植物组织碳化制备得到；附着于所述微生物载体表面的微生物。本发明还提供了一种固定的微生物体系的制备方法以及一种水体毒性的检测方法。本发明采用植物碳化组织一步法制备得到固定的微生物体系，制备方法简单；而且本发明提供的固定的微生物体系采用附着法将微生物固定，使微生物自然沉积于载体材料孔隙的表面，无需进行交联固化过程；另外，本发明采用的微生物载体为三维空间网状结构，具有较好的传质性能。因此，本发明提供的固定的微生物体系检测水体毒性过程中活性较好，可以重复应用于水体毒性检测，检测效果较好。
【专利说明】
-种固定的微生物体系及其制备方法和水体毒性的检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及水体检测技术领域，尤其设及一种固定的微生物体系及其制备方法和 水体毒性的检测方法。
【背景技术】
[0002] 伴随着社会的进步，人类在自我提高的同时也在不断加深对周围环境的影响，而 因此造成的环境污染又反作用于人类，成为了制约人类社会发展的障碍。目前，加强环境保 护、预防及治理已被污染的环境等问题已经成为科研工作者和环境专家首要关屯、的问题， 也是全人类需要共同面临的巨大挑战。在环境保护领域中，环境监测作为研究、分析、评价 及把握环境质量状况，检测、预测、判断环境污染发展趋势的重要技术，已经成为推动许多 学科和研究方向发展的必须助力，也是为各级政府、管理部口和民众提供环境信息的主要 手段。
[0003] 毒性作为一个相对的概念，无论其结果是通过实际检测还是建立数学模型的方法 获得都会受到受试生物体个体因素的影响。Madinez等人的研究表明，热带鱼Prochi lodus 1 ineatus对草甘麟类除草剂的灵敏度远高于Oncorhynchus mykiss和Salmo salar。化地in 等人针对硫丹的研究表明，当毒物的浓度不变时，受试的娃鱼幼鱼的体型越大其存活率越 高;而随接触时间的增加，鱼类对外源化学物的耐受量显著减小。Pablo和B1組a分别W贝类 及蛙类的幼体为受试对象的毒性测试结果也证明了生物的未成年幼体对外界刺激的抵抗 能力相对较弱，而灵敏度更高。因此，在进行实验前还需充分考虑监测对象的特点及考察的 侧重点，从实际出发选择合适的受试体种类及状态。
[0004] 面对日益复杂化的环境问题，简单的环境监测和纯粹的理论分析已经不能适应所 有任务的需要，还要求科研工作者在掌握环境分析化学的基本知识的同时，按照现代分析 化学的结构，对环境监测中的具体项目做针对性的研究。鱼类是最早应用的生物学环境污 染监测受试体，但是其生长周期较长，不能及时反映水质毒性污染状况。一般来说，越是低 等的生物在自然界中存在的数量越是庞大、种类越多，其有望成为快速毒性检测的受试体。 所W，将微生物作为受试体具有普遍意义。
[0005] 利用微生物为受试体的水体毒性检测方法中，所使用的微生物为悬浮状态，即分 散在水溶液中的微生物。使用悬浮状态的微生物的缺点为每次实验前要先进行微生物的培 养工作，增加了工作量、提高了检测成本。但是固定的微生物是难于应用于水体毒性的检测 的，由于固定的微生物与毒性物质反应后会出现两种情况，一种是毒性物质会对微生物造 成损伤，从而使微生物失活;另一种是微生物对毒性物质产生耐受，从而再次遇见毒性物质 不能体现抑制。申请号为CN201410020376的中国专利，提供了一种用于毒性检测生物传感 器的生物膜的制备方法，包括W下步骤:取活性污泥在培养基上接种，得到菌液;将聚乙締 醇和海藻酸钢加入到蒸馈水中，水浴加热，随后冷却至常溫，得到聚乙締醇凝胶;将菌液离 屯、后，倒掉上清液，取得到的沉淀物与聚乙締醇凝胶混合，再利用表面皿将混合物均匀涂成 膜状;将膜状混合物进行干燥，使其成膜后，将膜放入预先配制好的交联固化溶液中，交联 固化后，取出固化完成的膜，即得到用于毒性检测生物传感器的生物膜。
[0006] 现有技术提供的运种用于毒性检测生物传感器的生物膜采用包埋的方法制备得 到，制备方法复杂;而且运种方法制备过程中的交联固化会影响微生物的活性;另外，运种 方法在微生物外面包裹的材料阻碍了水溶液中物质的渗透传质。因此。现有技术提供的运 种固定的生物传感器生物膜用于水体毒性检测时活性较低、检测效果较差。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种固定的微生物体系及其制备方法和水体毒 性的检测方法，采用本发明提供的固定的微生物体系检测水体毒性时，微生物的活性较高， 检测效果较好。
[000引本发明提供了一种固定的微生物体系，包括：
[0009] 微生物载体，所述微生物载体由植物组织碳化制备得到；
[0010] 附着于所述微生物载体表面的微生物。
[0011] 优选的，所述植物组织包括丝瓜飄、葱白或洋葱。
[0012] 优选的，所述微生物为B0化eed混合菌培养后得到的微生物。
[0013] 本发明提供了 一种固定的微生物体系的制备方法，包括：
[0014] 将微生物附着于微生物载体表面，得到固定的微生物体系;或
[0015] 在微生物载体表面原位培养微生物，得到固定的微生物体系；
[0016] 所述微生物载体由植物组织碳化制备得到。
[0017] 优选的，所述碳化的溫度为150°C~250°C;
[001引所述碳化的时间为3小时~9小时。
[0019] 优选的，所述原位培养微生物的溫度为20°C~55°C;
[0020] 所述原位培养微生物的时间《200小时。
[0021 ]本发明采用植物碳化组织一步法制备得到固定的微生物体系，制备方法简单；而 且本发明提供的固定的微生物体系采用附着法将微生物固定，使微生物自然沉积于载体材 料孔隙的表面，无需进行交联固化过程；另外，本发明中的微生物载体为=维空间网状结 构，具有较好的渗透传质能力。因此，本发明提供的固定的微生物体系检测水体毒性过程中 活性较好，可W重复应用于水体毒性的检测，检测效果较好。
[0022] 本发明提供了一种水体毒性的检测方法，其特征在于，采用固定的微生物体系进 行水体毒性检测；
[0023] 所述固定的微生物体系为上述技术方案所述的固定的微生物体系。
[0024] 优选的，所述水体毒性的检测方法具体为：
[0025] 将背景溶液、营养液和毒性溶液依次循环通入固定的微生物体系，所述背景溶液 的通入时间大于营养液的通入时间，所述营养液的通入时间和毒性溶液的通入时间相同；
[0026] 采用电化学方法测试背景溶液、营养液和毒性溶液分别通入固定的微生物体系 后，固定的微生物体系产生的电化学信号，分别记为背景溶液电化学信号、营养液电化学信 号和毒性溶液电化学信号；
[0027] 根据营养液电化学信号和毒性溶液电化学信号之间的差值得到毒性溶液的毒性；
[0028] 所述背景溶液用于稳定和恢复固定的微生物体系中微生物的活性；
[0029] 所述营养液为固定的微生物体系中的微生物提供营养物质；
[0030] 所述毒性溶液为含有毒性物质的营养液。
[0031] 优选的，所述背景溶液的通入时间为1分钟~200分钟；
[0032 ]所述营养液和毒性溶液的通入时间为1分钟~30分钟。
[0033] 优选的，所述毒性溶液中的毒性物质为有毒重金属离子。
[0034] 本发明提供的水体毒性的检测方法采用上述技术方案所述的固定的微生物体系 进行检测，无需进行微生物培养即可进行检测，检测方法简单;而且检测过程中微生物的活 性较高，可重复进行检测，检测效果好。
【附图说明】
[0035] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据 提供的附图获得其他的附图。
[0036] 图1为本发明实施例1制备得到的微生物载体的SEM图；
[0037] 图2为本发明实施例2制备得到的微生物载体的SEM图；
[0038] 图3为本发明实施例3制备得到的微生物载体的沈M图；
[0039] 图4为本发明实施例4制备得到的微生物载体的化SM检测图；
[0040] 图5为本发明实施例5制备得到的微生物载体的化SM检测图；
[0041] 图6为本发明实施例6制备得到的微生物载体的化SM检测图；
[0042] 图7为本发明实施例8循环测定水体毒性的电信号记录图；
[0043] 图8为本发明实施例8检测水体毒性一个测量周期的放大信号图；
[0044] 图9为测量化连续6个周期的抑制率；
[0045] 图10为化抑制率与浓度图；
[0046] 图11为测量不同浓度化连续1个月的抑制率；
[0047] 图12为测量化连续5个周期的抑制率；
[004引图13为化抑制率与浓度图；
[0049]图14为测量不同浓度化连续1个月的抑制率；
[00加]图15为B i 、Cd2\化、Pb2+的浓度与抑制率图；
[0051 ]图16为DCP的浓度与抑制率图。
【具体实施方式】
[0052]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员经改进或润饰的所有其它实例，都属于本发明保护的范围。
[0053 ]本发明提供了一种固定的微生物体系，包括：
[0054] 微生物载体，所述微生物载体由植物组织碳化制备得到；
[0055] 附着于所述微生物载体表面的微生物。
[0056] 本发明提供的固定的微生物体系包括微生物载体，所述微生物载体由植物组织碳 化制备得到。在本发明中，所述植物组织优选为丝瓜飄、葱白或洋葱。在本发明中，所述微生 物载体的制备方法优选为：
[0057]将植物组织进行碳化制备得到微生物载体。
[005引在本发明中，所述碳化的溫度优选为150°C~250°C，更优选为160°C~220°C，最优 选为180°C~220°C。在本发明中，所述碳化的时间优选为3小时~9小时，更优选为5小时~8 小时，最优选为6小时~7小时。本发明优选将植物组织在反应蓋中进行碳化。在本发明中， 所述植物组织与上述技术方案所述植物组织一致，在此不再寶述。
[0059] 在本发明中，所述微生物载体的生物相容性好，在固定微生物的同时无需对载体 表面进行修饰、刻蚀等前处理，操作简单，有利于快速监测水体;而且微生物载体为疏松的 网状结构，负载微生物后具有很好的传质能力，固定的微生物具有较高的活性，而且能够负 载较多的微生物，用于水体监测时得到的检测结果较为准确。
[0060] 在本发明中，将植物组织进行碳化之前优选将植物组织洗净后裁切成所需尺寸。 在本发明中，所述碳化完成后优选将得到的碳化产物去除有机物后洗涂、干燥，得到微生物 载体。在本发明中，去除有机物所用的试剂优选为醇类化合物，更优选为碳原子数为1~5的 醇类化合，最优选为乙醇。在本发明中，所述洗涂的试剂优选为水，更优选为二次水。在本发 明中，所述干燥的方法优选为冻干。
[0061] 在本发明中，所述微生物为培养B0化eed混合菌获得的微生物。在本发明中，所述 微生物为混合菌培养得到的，可用于不同种类环境水样的监测，具有普适性。BODseed混合 菌在环境监测中的具有代表性，由屯种菌组成，详细见表1所示，表1为BODseed混合菌的组 成，运些菌种在环境检测中具有代表性：
[0062] 表1 BODseed混合菌的组成
[0063]
[0064] 本发明提供了 一种固定的微生物体系的制备方法，包括：
[0065] 将微生物附着于微生物载体表面，得到固定的微生物体系;或
[0066] 在微生物载体表面原位培养微生物，得到固定的微生物体系；
[0067] 所述微生物载体由植物组织碳化制备得到。
[0068] 在本发明中，所述微生物和微生物载体与上述技术方案所述微生物和微生物载体 一致，在此不再寶述。
[0069] 本发明对将微生物附着在微生物载体表面的方法没有特殊的限制，本领域技术人 员可根据实际操作条件将微生物转移至微生物载体表面即可。
[0070] 在本发明中，所述原位培养微生物的溫度优选为20°C~55 °C，更优选为25°C~50 °C，最优选为30°C~40°C。在本发明中，所述原位培养微生物的时间优选《200小时，更优选 为1小时~150小时，更优选为10小时~100小时，最优选为30小时~60小时。在本发明中，所 述原位微生物培养的方法优选为：
[0071 ]将微生物载体投入微生物培养液中进行震荡培养。
[0072] 在本发明中，所述微生物培养液包括菌体和培养液。在本发明中，所述菌体优选为 BODseed混合菌。在本发明中，所述培养液优选为Luria-Bertani (LB)培养液(蛋白腺lOg，酵 母膏5g，蒸馈水lOOOmL，pH 7.0)、牛肉膏蛋白腺培养基（培养细菌用）（牛肉膏3g，蛋白腺 lOg，化C1 5g，水1000血，pH7.0-7.2)或YEPD培养液(牛肉膏3g，酵母提取物3g，膜化蛋白腺 3邑，葡萄糖lOg，水lOOOmUp册.5)。若需要固体培养基进行微生物培养在配制上述培养液过 程中添加1.5%~2.0%的琼脂即可。培养液和培养基在配制当天灭菌，灭菌条件为i2rc， 20min。
[0073] 本发明提供了一种水体毒性的检测方法，采用固定的微生物体系进行水体毒性检 测;所述固定的微生物体系为上述技术方案所述的固定的微生物体系。
[0074] 在本发明中，所述水体毒性的检测方法具体为：
[0075] 将背景溶液、营养液和毒性溶液依次循环通入固定的微生物体系，所述背景溶液 的通入时间大于营养液的通入时间，所述营养液的通入时间和毒性溶液的通入时间相同；
[0076] 采用电化学方法测试背景溶液、营养液和毒性溶液分别通入固定的微生物体系 后，固定的微生物体系产生的电化学信号，分别记为背景溶液电化学信号、营养液电化学信 号和毒性溶液电化学信号；
[0077] 根据营养液电化学信号和毒性溶液电化学信号之间的差值得到毒性溶液的毒性；
[0078] 所述背景溶液用于稳定和恢复固定的微生物体系中微生物的活性；
[0079] 所述营养液为固定的微生物体系中的微生物提供营养物质；
[0080] 所述毒性溶液为含有毒性物质的营养液。
[0081] 本发明基于微生物可对水体中毒性物质做出快速响应的原理，通过电化学方法检 测信号并建立信号的量化方法，从而监测水体生物毒性物质污染。本发明提供的水体毒性 检测方法能够克服传统毒性分析方法耗时、昂贵、应用范围窄等缺陷，适用于长期在线的水 体毒性监测。
[0082] 本发明将背景溶液、营养液和毒性溶液依次循环通入固定的微生物体系。在本发 明中，所述背景溶液用于稳定和恢复固定的微生物体系中微生物的活性，优选为PBS缓冲 液。在本发明中，所述PBS缓冲液的pH值优选为6.5~7.5，更优选为7。在本发明中，所述营养 液为固定的微生物体系中的微生物提供营养物质，优选为葡萄糖-谷氨酸(GGA)溶液。在本 发明中，所述GGA溶液的浓度优选为15mg/L~25mg/L，更优选为20mg/L。在本发明中，所述毒 性溶液为含有毒性物质的营养液。在本发明中，所述毒性物质优选为有毒重金属离子，如 化6+。
[0083] 在本发明中，所述背景溶液的通入时间大于营养液的通入时间，所述营养液的通 入时间和毒性溶液的通入时间相同。在本发明中，所述背景溶液的通入时间优选为1分钟~ 200分钟，更优选为10分钟~150分钟，最优选为400分钟~100分钟。在本发明中，所述营养 液和毒性溶液的通入时间优选为1分钟~30分钟，更优选为5分钟~20分钟，最优选为10分 钟~15分钟。
[0084] 在本发明中，所述背景溶液、营养液和毒性溶液依次循环通入固定的微生物体系， 即背景溶液通入固定的微生物体系背景溶液时间后，营养液通入固定的微生物体系营养液 时间，然后毒性溶液再通入固定的微生物体系与营养液相同的时间，然后背景溶液再次通 入固定的微生物体系背景溶液时间，依次类推，按照运样的方式将背景溶液、营养液和毒性 溶液循环通入固定的微生物体系。本发明可W采用定时控制器和恒流累组成进样系统，用 于输送背景溶液、营养液和毒性溶液进入到固定的微生物体系。在本发明中，所述背景溶 液、营养液和毒性溶液的进样速度优选为ImL/min~4mL/min，更优选为2mL/min~3mL/min。 本发明可W采用微生物反应器和恒溫培养箱组成反应器，在37°C的恒溫培养箱中，采用微 生物反应器装放固定的微生物体系。
[0085] 在本发明中，采用电化学的方法测试背景溶液、营养液和毒性溶液分别通入固定 的微生物体系后，固定的微生物体系产生的电化学信号，分别记为背景溶液电化学信号、营 养液电化学信号和毒性溶液电化学信号。在本发明中，可采用电极和电化学工作站作为数 据采集系统记录固定的微生物体系产生的电化学信号，用电极对通入不同液体后的固定的 微生物体系进行测试，通过电化学工作站的电化学分析仪测出电流信号值。
[0086] 本发明根据营养液电化学信号和毒性溶液电化学信号之间的差值得到毒性溶液 的毒性。本发明通过检测活性微生物代谢功能的变化检测有毒物质的含量或性质。在本发 明中，有毒物质会抑制固定的微生物体系中微生物的活性，本发明优选W不同性质的溶液 通入固定的微生物体系后发生反应产生的电流衡量微生物的呼吸能力，反应中被微生物还 原的量可W通过电化学方法中的计时电流法进行测量，营养液通入固定的微生物体系产生 的电流与毒性溶液通入固定的微生物体系产生的电流的差值即为有毒物质对微生物呼吸 作用的影响。
[0087] 在本发明中，通过式I可W将电流值转化为毒性物质对微生物呼吸作用的抑制百 分率，即代表毒性：
[008引
[0089] 式I中，I代表毒性物质对受试微生物呼吸作用的抑制率，W百分数表示，代表毒性 的大小；isDntrDl代表营养液通入固定的微生物体系后得到的电流值，isample代表毒性溶液通 入固定的微生物体系后得到的电流值。本申请抑制生物体呼吸作用的程度"为"毒性"的 生物学指标，根据微生物中毒时，其呼吸链的电子传递速率受到直接影响，通过计算抑制率 来表征不同毒性物质的毒性强弱，建立了固定微生物为受试体检测毒性的生物学方法。
[0090] 本发明提供的水体毒性检测方法检测水体之前无需进行微生物的培养工作，而且 在检测过程中能够保持微生物的生理活性，本发明提供的水体毒性的检测方法能够准确和 长期反复使用，该方法具有操作简单、使用方便、成本低廉的优点。
[0091] 本发明W下实施例所用的化学试剂除非另作说明，分析时均使用符合国家标准的 分析纯化学试剂，用水为均为Mi 11 ipore Ml 1 i-Q纯化过的超纯水。
[0092] 憐酸盐缓冲液的制备：
[0093] 憐酸盐缓冲溶液（PBS，0.12mol/L 化抽P〇4/0.08mol/L K出P〇4/0.1mol/L KCl，pH 7.0):将10.8872g憐酸二氨钟化出P〇4)，42.976g憐酸氨二钢(Na2HP〇4 ? 12出0)，用二次水稀 释至化。此溶液抑值7.0。
[0094] GGA标准溶液按照APHA方法配制：
[00巧]称取葡萄糖(C6出2〇6)和谷氨酸(C5曲N04)各150mg，用二次水溶解，在lOOmL容量瓶 中稀释至标线(此溶液的B0化值约为2000mg 0 [1，为区分记为GGA2000)。储存在冰箱中，根 据实验要求其他浓度的B0D标准溶液均由GGA2000稀释得到。
[0096] 有毒金属离子化溶液：由重铭酸钟化2吐2化，M = 294.18)制备，取0.735g K2化2〇7 溶解于5mL二次水，浓度为0.5mol L-1。计算得到4mg 1/1吐6%取化L SOOmmol 1/1吐6%溶于 50mL PBS溶液即可，根据要求再计算配置不同浓度的化溶液。
[0097] 有毒金属离子Cu2+溶液：由Cu(N〇3)2溶液配制得到Ig/L的Cu2+，根据要求再计算配 置不同浓度的化溶液。
[0098] BODseed混合菌为Cole F*a;rme;r的BODseed混合菌。
[0099] 异硫氯酸巧光素 (Fluorescein isothiocyanate，FITC)溶液：用二次水配制为Img rnL 〇
[0100] 恒溫振荡培养箱:ZHWY-2102C型，上海智城分析仪器制造有限公司，上海，中国。
[0101] 真空干燥箱:DZF-6020型，上海精宏实验设备有限公司，上海，中国。
[0102] 恒溫培养箱:泰斯特D肥500A型，天津，中国。
[0103] 冷冻干燥机:化rist实验室冷冻干燥机ALPHA 1-2LD plus,德国。
[0104] 溶解氧测量使用商业的松宝通氧累(SB-648)。
[0105] 恒流累为保定兰格蠕动累BT100-1J(保定，中国）。
[0106] 电化学测量使用上海辰华生产的CHI 830B电化学分析仪（CHI Co.，Shanghai， 化ina)，使用恒电位模式检测。电极为S电极系统，包括金工作电极，销对电极和Ag/AgCl参 比电极，电解液为0.1mol/L的KC1。
[0107] 扫描电子电镜（scanning electron microscope，SEM) :)(L30ESEM扫描电子显微 镜。
[0108] 激光诱导巧光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope,化SM):莱 卡TCS SP2(莱卡显微系统化ide化erg Gm地，曼海姆，德国）附带氣离子激光器(457/488/ 514nm)。
[0109] 实施例1
[0110] 将丝瓜飄洗净，裁切成需要尺寸。装入反应蓋，180°C条件下进行化碳化，将得到的 碳化产物放入乙醇中，去除有机残留物;然后用二次水冲洗后在0.0 Smpar条件下冻干备用， 得到微生物载体。
[0111] 对实施例1制备得到的微生物载体进行表征，检测结果如图1所示，图1为本发 明实施例1制备得到的微生物载体的SEM图。
[0112] 实施例2
[0113] 按照实施例1所述的方法制备微生物载体，与实施例1不同的是采用葱白代替丝瓜 飄。
[0114] 对实施例2制备得到的微生物载体进行表征，检测结果如图2所示，图2为本发 明实施例2制备得到的微生物载体的SEM图。
[011引实施例3
[0116] 按照实施例1所述的方法制备微生物载体，与实施例1不同的是采用洋葱代替丝瓜 飄。
[0117] 对本发明实施例3制备得到的微生物载体进行沈M表征，检测结果如图3所示，图3 为本发明实施例3制备得到的微生物载体的SEM图。
[0118] 从图1~图3可W看出，本发明实施例制备的微生物载体保留了原生物组织的物理 结构，具有很好的孔隙传质特性好；同时，多孔结构使微生物载体有很高的比表面积，有利 于大量负载微生物。
[0119] 实施例4
[0120] 将本发明实施例1制备得到的微生物载体投入微生物培养液中，于37°C恒溫震荡 培养48小时，注意减少震荡频率，W免附着于微生物载体表面的微生物被震荡脱落，得到固 定的微生物体系；
[0121] 所述微生物培养液包括B0化eed混合菌和LB培养液(蛋白腺lOg，酵母膏5g，蒸馈水 lOOOmL，抑 7.0)。
[0122] 将实施例4制备得到的固定的微生物体系用PBS冲洗去除多余的微生物载体，用异 硫氯酸巧光素溶液进行30min染色，用PBS彻底冲洗去除未附着的染料，在激发波长为488nm 下进行化SM检测。
[0123] 化SM检测结果如图4所示，图4为本发明实施例4制备得到的微生物载体的化SM的 检测图。
[0124] 实施例5
[0125] 按照实施例4所述的方法制备固定的微生物体系，与实施例4不同的是采用实施例 2制备得到的微生物载体代替实施例1制备得到的微生物载体。
[0126] 按照实施例4所述的方法对实施例5制备得到的固定的微生物体系进行化SM表征， 检测结果如图5所示，图5为本发明实施例5制备得到的微生物载体的化SM检测图。
[0127] 实施例6
[0128] 按照实施例4所述的方法制备固定的微生物体系，与实施例4不同的是采用实施例 3制备得到的微生物载体代替实施例1制备得到的微生物载体。
[0129] 按照实施例4所述的方法对实施例6制备得到的固定的微生物体系进行化SM表征， 检测结果如图6所示，图6为本发明实施例6制备得到的微生物载体的化SM检测图。
[0130] 由图4~图6可知，微生物在微生物载体表面附着均匀，负载量大。本发明提供的微 生物载体可W用于微生物固定。而且W葱白为原料制备得到的微生物载体具有更好的微生 物固定性能。
[0131] 本发明提供的微生物载体在保持微生物的长期活性方面表现出很好的生物相容 性，通过SEM图和CLAM图的表征，微生物载体的空间网络结构特点使固定的微生物体系形成 一个=维空间的"微生物细胞集合"，能很好的传质、负载微生物;而且运种微生物载体具有 很强的生物降解能力，对抑不敏感，具有较强的适应能力。
[0132] 实施例7
[0133] 本发明实施例提供的用于水体毒性检测的系统，包括：
[0134] -个定时控制器（TPC8-8TD型号，北京，中国）和一个恒流累（保定兰格蠕动累 BT100-1J，保定，中国）组成的进样系统;一个微生物反应器和恒溫培养箱(泰斯特DH2500A 型，天津，中国）组成的反应器；W及电极和电化学工作站(上海辰华CHI 830B，上海，中国） 组成的数据采集系统。
[0135] 定时控制器为北京多维精控计算机技术开发中屯、研制的TPC8-8定时程序控制器 (北京，中国）。主要技术参数如下:供电电源为直流24V/2A开关稳压电源，控制器端子EG为 地线，端子24V为正极;输出方式为NPN型晶体管集电极开路输出，输出有效:对地导通，输出 无效:开路;输出电压为连接负载情况下，输出有效时:接近0V;输出无效时：24V;每路输出 为电流小于300mA，功率小于7W，电阻大于80 Q ;输入电压为0-24V范围内的开关量信号；输 入信号为电平信号;传感器为电源15~24V，低电平有效的NPN型开关量传感器。WUSB接口 连接电脑驱动。
[0136] 蠕动累配套使用为直径2.5mm的硅胶管。在11.5巧m(~3mL mirTi)流速下，按所设 定好的程序进样，PBS作为背景溶液，维持微生物的稳定性。在37。直溫箱中，把实施例5审。 备得到的固定的微生物系统装入微生物反应器后，用电极对毒性物质的反应进行测试，通 过电化学分析仪测出电流信号值。
[0137] 选择金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，销丝为对电极，运种电极使所 建立的仪器拥有较高的灵敏度。采用计时电流方法测定电化学信号，电压设定-700mV，使用 仪器为CHI830B型电化学工作站。
[013引实施例8
[0139] 采用实施例7提供的水体毒性检测系统进行水体毒性检测：
[0140] PBS缓冲溶液为背景溶液；
[0141] 用移液枪取GGA标准溶液lOmL，用PBS稀释至lOOOmL，取500mL置于锥形瓶中，作为 营养液；
[0142] 取化6+2化1(通过计算吐6+即是20mg 1/1吐6+)和上述另外500mL营养液混合， 作为毒性溶液；
[0143] 在进样前需要通氧仪器通空气氧20分钟至氧气饱和。
[0144] 对用于水体毒性检测的系统进行程序设置，累的流速为3mL mirTi，背景溶液进样 40分钟，营养液进样10分钟，毒性溶液进样10分钟，背景溶液再次进样40分钟依次类推循环 进样，每个循环周期为100分钟。
[0145] 测试结束后得到的检测结果如图7和图8所示，图7为本发明实施例8循环测定水体 毒性的电信号记录图，图8为本发明实施例8检测水体毒性一个测量周期的放大信号图。从 图7和图8可W看出，PBS缓冲溶液产生的信号值可W达到53化A左右，通入GGA标准溶液，微 生物在营养液中进行了呼吸作用，水中氧含量减少，信号随之降低，为37化A左右。而在微生 物的信号达到稳定时，加入20mg [1化与20mg 1/iGGA的混合溶液(毒性溶液），信号值降低 的幅度明显变小，为420nA左右。重金属离子灯6+对微生物的呼吸作用有抑制，呼吸强度变 弱，消耗的氧气减少，电流值减小幅度变小，本发明提供的方法可W测定水体中的有毒重金 属离子。
[0146] 实施例9
[0147] 按照实施例8的水体毒性检测方法对Cr6+毒性溶液连续进行6个周期的毒性检测， 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，结果如图9所示，图9为测量化连续6 个周期的抑制率，由图9可知，多组的重复性实验，得到的数据图基本一致，本发明提供的水 体毒性检测方法具有较好的重现性。
[014引实施例10
[0149] 取GGA2000溶液5mL用PBS稀释至500mL，取300mL作为营养液(GGA20溶液）；
[0150] 将剩余的GGA溶液分为四份，每份50mL，分别向每份中添加化L、化L、10化、2化L的 Img 1/1化6+，得到吐6+浓度为Img L-i、5mg L-i、10mg L-i、20mg [1 的毒性溶液。
[0151] 按照实施例8所述的方法对毒性溶液进行检测，每个周期更换不同浓度的毒性溶 液。
[0152] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图10所示，图10 为Cr6+抑制率与浓度图，从图10中可W看出，四个周期的检测过程中加入Cr6+电流信号值降 低较小，随着Cr6+浓度的增大，电流值降低逐渐变小，抑制作用明显，在抑制率图中可W看出 抑制率与浓度呈一定线性关系，本发明提供的水体毒性检测方法能够检测不同浓度的重金 属离子。
[0153] 实施例11
[0154] 按照实施例10的水体毒性检测方法对不同浓度的Cr6+毒性溶液连续进行1个月的 毒性检测，根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，结果如图11所示，图11为 测量不同浓度Cr6+连续1个月的抑制率，由图11可知，检测过程中得到的信号值基本稳定，不 同浓度抑制作用不同，一定范围内随浓度的增加而增大。本发明提供的水体毒性检测方法 能够长期测定水体中金属离子，具有一定的稳定性和适用性。
[01对实施例12
[0156] 按照实施例9的方法检测水体毒性，采用5mg/L的化毒性溶液连续进行5个周期的 毒性检测。
[0157] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，结果如图12所示，图12为测 量Cu2+连续5个周期的抑制率，由图12可知，多组的重复性实验，得到的数据图基本一致，本 发明提供的水体毒性检测方法具有较好的重现性。
[015引实施例13
[0159] 按照实施例10所述的方法检测水体毒性，采用Cu2+浓度为Img L-i、2mg L-i、5mg L -I'lOmg L_i的毒性溶液。
[0160] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图13所示，图13 为Cu2+抑制率与浓度图，从图13中可W看出，四个周期的检测过程中随着Cu2+浓度增加，抑 审IJ作用逐渐增强，但抑制率较低，抑制率与浓度呈良好的线性关系。本发明提供的水体毒性 检测方法能够检测不同浓度的重金属离子。
[0161] 实施例14
[0162] 按照实施例13的水体毒性检测方法对不同浓度的Cu2+毒性溶液连续进行1个月的 毒性检测。
[0163] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，结果如图14所示，图14为测 量不同浓度化连续1个月的抑制率，由图14可知，检测过程中得到的信号值基本稳定，不同 浓度抑制作用不同，一定范围内随浓度的增加而增大。本发明提供的水体毒性检测方法能 够长期测定水体中的金属离子，具有一定的稳定性和适用性。
[0164] 本发明通过对Cr6+与化进行重现性实验、浓度梯度实验W及长期稳定性实验，可 W看出，加入有毒离子，微生物的呼吸活性被抑制，加入PBS时，活性又会恢复，本发明提供 的固定的微生物体系的稳定性好，通过电流值的大小能很直观的表征检测物的有毒和无 毒，本发明提供的水体毒性的检测方法可W用来检测水体中的重金属离子。
[01化]实施例15
[0166] 制备Bi3+浓度为50mg/L的水溶液；
[0167] 取GGA2000溶液5mL用PBS稀释至500mL，取300mL作为营养液(GGA20溶液）；
[016引将剩余的GGA溶液分为四份，每份50mL，分别向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg L-iBi3+，得到Bi3+浓度为5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0169] 按照实施例10所述的方法对上述毒性溶液进行检测。
[0170] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图15所示，图15 为813+、〔(12+、2112+、口护的浓度与抑制率图。
[0171] 实施例16
[0172] 制备Cd2+浓度为50mg/L的水溶液；
[0173] 取GGA2000溶液5mL用PBS稀释至500mL，取300mL作为营养液(GGA20溶液）；
[0174] 将剩余的GGA溶液分为四份，每份50mL，分别向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg L-iCd2+，得到Cd2+浓度为5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0175] 按照实施例10所述的方法对上述毒性溶液进行检测。
[0176] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图15所示。
[0177] 实施例17
[017引制备化浓度为50mg/L的水溶液；
[01巧]取GGA2000溶液5mL用PBS稀释至500mL，取300mL作为营养液(GGA20溶液）；
[0180] 将剩余的GGA溶液分为四份，每份50mL，分别向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg 1/1化2+，得到Zn2+浓度为5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0181 ]按照实施例10所述的方法对上述毒性溶液进行检测。
[0182] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图15所示。
[0183] 实施例18
[0184] 制备化浓度为50mg/L的水溶液；
[01化]取GGA2000溶液5mL用PBS稀释至500mL，取300mL作为营养液(GGA20溶液）；
[0186] 将剩余的GGA溶液分为四份，每份50mL，分别向每份中添加扣L、10化、2化L、30化的 50mg L-1 饥2+，得到Pb2+浓度为5mg L-i、10mg L-i、20mg L-i、30mg L-1 的毒性溶液。
[0187] 按照实施例10所述的方法对上述毒性溶液进行检测。
[0188] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图15所示。
[0189] 由图15Bi3+、Cd2+、Zn2+、Pb2+四种金属离子的浓度与抑制率之间的关系曲线，可W得 到相应各个离子的毒性强弱，它们的大小顺序为Cd2+(20mg L-i)〉Pb2+(20mg L-i)〉Bi3+(20mg
[i)〉Zn2+(20mg 1/1)。本发明检测得到的结果与现有技术报道的金属离子在毒性趋势上是 一致的。本发明提供的水体毒性检测方法对重金属离子的毒性检测具有普适性。
[0190] 实施例19
[0191] 审恪3,5-二氯苯酪(DCP)浓度分别为5111旨1/1、1〇111旨1/1、15111旨1/1、2〇111旨1/1的毒性溶液 (将0.1 g DCP溶于lOOmL水中，得到lOOOmg/L的DCP母液;然后用水将母液稀释至所需的溶 度)；
[0192] 按照实施例10所述的方法对上述毒性溶液进行检测。
[0193] 根据记录得到的电信号图按照式I的公式计算抑制率，检测结果如图16所示，图16 为DCP的浓度与抑制率图。由图16可知，DCP不仅没有抑制微生物的呼吸作用，反而促进微生 物的呼吸作用，运是由于DCP本身对微生物的毒性很小，同时作为有机物，将其加入固定的 微生物系统中，增加了微生物新陈代谢作用的底物，从而增加了溶液中氧气的消耗，出现了 负抑制的结果。本发明提供的水体毒性检测方法还可对有机毒性污染物进行毒性检测。
[0194] 由W上实施例可知，本发明提供了一种固定的微生物体系，包括:微生物载体，所 述微生物载体由植物组织碳化制备得到；附着于所述微生物载体表面的微生物。本发明采 用植物碳化组织一步法制备得到固定的微生物体系，制备方法简单;而且本发明提供的固 定的微生物体系采用附着法将微生物固定，使微生物自然沉积于载体材料孔隙的表面，无 需进行交联固化过程;另外，本发明采用的微生物载体为=维空间网状结构，具有较好的传 质性能。因此，本发明提供的固定的微生物体系检测水体毒性过程中活性较好，可W重复应 用于水体毒性检测，检测效果较好。
[0195] W上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种固定的微生物体系，包括： 微生物载体，所述微生物载体由植物组织碳化制备得到； 附着于所述微生物载体表面的微生物。2. 根据权利要求1所述的固定的微生物体系，其特征在于，所述植物组织包括丝瓜瓤、 葱白或洋葱。3. 根据权利要求1所述的固定的微生物体系，其特征在于，所述微生物为BODseed混合 菌培养后得到的微生物。4. 一种固定的微生物体系的制备方法，包括： 将微生物附着于微生物载体表面，得到固定的微生物体系;或 在微生物载体表面原位培养微生物，得到固定的微生物体系； 所述微生物载体由植物组织碳化制备得到。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碳化的温度为150°C~250°C ; 所述碳化的时间为3小时~9小时。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述原位培养微生物的温度为20°C~55 °C； 所述原位培养微生物的时间< 200小时。7. -种水体毒性的检测方法，其特征在于，采用固定的微生物体系进行水体毒性检测； 所述固定的微生物体系为权利要求1~3中任意一项所述的固定的微生物体系。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述水体毒性的检测方法具体为： 将背景溶液、营养液和毒性溶液依次循环通入固定的微生物体系，所述背景溶液的通 入时间大于营养液的通入时间，所述营养液的通入时间和毒性溶液的通入时间相同； 采用电化学方法测试背景溶液、营养液和毒性溶液分别通入固定的微生物体系后，固 定的微生物体系产生的电化学信号，分别记为背景溶液电化学信号、营养液电化学信号和 毒性溶液电化学信号； 根据营养液电化学信号和毒性溶液电化学信号之间的差值得到毒性溶液的毒性； 所述背景溶液用于稳定和恢复固定的微生物体系中微生物的活性； 所述营养液为固定的微生物体系中的微生物提供营养物质； 所述毒性溶液为含有毒性物质的营养液。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述背景溶液的通入时间为1分钟~200分 钟； 所述营养液和毒性溶液的通入时间为1分钟~30分钟。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述毒性溶液中的毒性物质为有毒重金 属离子。
【文档编号】C12N11/14GK106047849SQ201610344913
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】翟俊锋, 刘玲, 余登斌, 董绍俊
【申请人】中国科学院长春应用化学研究所