一种固定化菌及其制备κ?卡拉胶寡糖的方法
【专利摘要】本发明涉及一种固定化菌及其制备κ?卡拉胶寡糖的方法，属于固定化细胞技术领域。选择人工沸石，通过静电吸附作用，将κ?卡拉胶降解菌Thalassospira sp. Fjfst?332附着于沸石表面，制备成菌体高浓度富集的微球，将固定好的菌株无菌条件下发酵降解κ?卡拉胶，制备κ?卡拉胶低聚糖。该固定化菌制备工艺简单，成本低，机械强度好，固定菌与发酵酶液易分离，降解κ?卡拉胶的效果好，可较好的应用于工厂批量生产κ?卡拉胶低聚糖。
【专利说明】
一种固定化菌及其制备K-卡拉胶寡糖的方法
技术领域
[0001]本发明属于固定化细胞技术领域，涉及一种固定化菌及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法。
【背景技术】
[0002]固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。与游离细胞相比，固定化细胞稳定性增强，具有细胞密度高，微生物流失少及产物分离容易等优点，由于固定化细胞保持了细胞的生命活动能力，它不但比游离细胞的发酵更具有优越性，而且比固定化酶有更多的优点，因为固定化细胞省去了制备酶或含酶细胞处理过程所需要的完整酶系，并能不断产生新酶及其所需的辅助因子，且固定化方法较简单，可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。
[0003]沸石是一种以硅铝氧四面体为基本结构单元，具有开旷硅氧格架的分子筛。硅氧四面体通过处于四面体顶点的氧原子相互连接，形成首尾衔接、中空环状结构的硅铝氧四面体群，成为沸石的骨架。这种空旷的硅铝氧骨架结构，，具有许多排列整齐的晶穴、晶孔和孔道，使得沸石具有较强的阳离子交换性能和吸附性能。
[0004]沸石具有较大的比表面积，其表面还具有很大的色散力和静电力，故其具有较强的吸附力类似于一般多孔性材料。沸石的孔穴和孔道大小均勾，直径在0.3?Inm之间，也就是说，小于这个直径的物质能被吸附，而大于这个直径的物质则被排除在外不被吸附，这种现象被称为“分子筛”作用，所以说沸石具有选择吸附的特性。
[0005]目前报道中，沸石多用于吸附处理氨氮废水，将沸石吸附与生物法相结合，去除富营养水体中的氨氮，是目前研究的热点。沸石在吸附氨氮的同时，可作为微生物生长的载体，氨氮一部分被沸石吸附，然后被硝化、反硝化等脱氮菌进一步转化另一部分被微生物作为氮源合成新细胞。在此过程中，沸石不仅为生物硝化和反硝化作用提供了营养源，同时还为微生物的生长提供了附着表面，经过一定时间后，沸石表面会形成生物膜。
[0006]目前卡拉胶低聚糖制备方法主要有:物理降解法、化学降解法及酶解法。其中，化学法是制备卡拉胶低聚糖主要方法，但化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等瓶颈问题，制约了其在工业生产中的应用。而酶解法能弥补化学降解法的不足，不但对生产工艺要求简单，反应条件温和、产物活性高，而且产物专一，从而成为制备卡拉胶低聚糖的热点。κ-卡拉胶酶能水解κ-卡拉胶的β-1，4糖苷键产生低聚糖，可用于红藻细胞壁结构的分析和原生质体的制备。而海洋微生物产酶量低、酶活性普遍不高，成为了酶解法制备卡拉胶低聚糖的技术瓶颈。
[0007]已有报道中，尚未见到采用固定化细胞技术发酵制备卡拉胶低聚糖，也未见采用沸石做载体固定化细胞或酶生产制备K-卡拉胶低聚糖。其中，集美大学肖安风以公开了一种固定化κ -卡拉胶酶及其制备κ -卡拉胶寡糖的方法。但由于酶固定化技术中存在的问题如:酶活力的损失、酶纯化等，本发明以实验组自主筛选的K-卡拉胶降解菌为材料，制备固定化菌株降解K-卡拉胶，进一步应用于K-卡拉胶低聚糖的制备工艺中。为实现工业发酵生产K-卡拉胶寡糖提供理论依据。
【发明内容】
[0008]本发明的目的提供一种固定化菌株及其制备K-卡拉胶低聚糖的方法，通过固定菌微球的制备，固定化菌株的最佳发酵条件及重复使用率的研究，为固定化菌生产K-卡拉胶低聚糖提供理论依据。
[0009]本发明的技术方案:
一种固定化菌及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法，固定化菌株制备步骤如下:配置发酵培养基，加入0.3?Ig沸石(40?60目)于30ml培养基中，灭菌后接种细胞湿重0.5?1.5g菌泥，在250C，13(^/11^11的恒温摇床培养16~24 h。将固定化细胞与培养基分离，用0.9的%生理盐水清洗固定化细胞，洗去残留液，4 °C保存固定化细胞。
[0010]菌株sp.Fjfst-332，为实验室自主筛选获得，保藏号为CCTCC M2013706，经检测可有效酶解κ-卡拉胶获得κ-卡拉胶低聚糖的野生菌。
[0011 ] 菌泥为菌株TiaJassosjDira sp.Fjfst-332经液体发酵培养后，采用0.9wt%生理盐水清洗2?3次，10000r/min离心20min获得。
[0012]固定化海旋菌TiaJassosjDirasp.Fjfst-332制备κ-卡拉胶寡糖的方法，制备包括如下步骤:
1)取固定化菌株无菌状态下加入30mL发酵培养基中，25°C，130r/min恒温摇床中发酵培养24 h后，分离载体与发酵液，发酵液8000r/min离心20min取上清酶液；
2)上清酶液经1kDa超滤膜浓缩后，按1:20(v/v)的比例加入到0.5wt% κ-卡拉胶水溶液中，酶解24 h;
3)酶解液加热5min停止反应，10000r/min离心30min去除未降解的κ-卡拉胶片段，取上清液分别过1kDa及3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，经旋蒸后真空冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖。
[0013]发酵培养基的成分为:氯化钠15g/L，低聚果糖I g/L，K-卡拉胶3 g/L，酵母膏Ig/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4.7H20 0.5g/L,K2HPO4 I g/L,CaCl2 0.1 g/L，余量为去离子水，pH7.5±0.1ο
[0014]本发明的效益在于:该菌株固定化制备工艺简单、成本低并可大量生产，固定化菌酶解κ-卡拉胶效果好，效率高，且重复使用率高，产物易分离，对于实现卡拉胶低聚糖产业化生产有重要的应用价值。以一定配比的固定菌与κ-卡拉胶发酵液混合生产κ-卡拉胶低聚糖，酶解时间与游离菌株发酵相比，缩短了 4倍。
【附图说明】
[0015]图1沸石固定菌原理图。
[0016]图2沸石电镜扫描图。
[0017]图3沸石固定化菌株的电镜扫描图。
[0018]图4傅里叶红外光谱图分析。
[0019]图5沸石固定化菌株发酵生产K-卡拉胶低聚糖的稳定性。
[0020]图6沸石固定化菌株发酵生产κ-卡拉胶酶的产酶曲线。
[0021]图7固定化菌株制备κ-卡拉胶低聚糖的TLC图。
【具体实施方式】
[0022]以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此:
实施例1
固定化海旋菌TiaJassosjDira sp.Fjfst-332制备κ-卡拉胶寡糖的方法:
固定化菌株制备步骤如下:配置发酵培养基，加入0.3g沸石40目于30ml培养基中，灭菌后接种细胞湿重Ig菌泥，在25°C，130r/min的恒温摇床培养16 h。将固定化细胞与培养基分离，用0.9wt%生理盐水清洗固定化细胞，洗去残留液，4 °C保存固定化细胞。
[0023]所述菌株Tia^assosjoira sp.Fjfst-332，为实验室自主筛选获得，经检测可有效酶解κ-卡拉胶获得κ-卡拉胶低聚糖的野生菌。
[0024]所述菌悬液为菌株77?a2ass0sj0irasp.F jf st-332经液体发酵培养后，采用0.9wt%生理盐水清洗3次，10000r/min离心20min获得。
[0025]固定化海旋菌TiaJassosjDirasp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法，制备包括如下步骤:
1)取固定化菌株无菌状态下加入30mL发酵培养基中，25°C，130r/min恒温摇床中发酵培养24 h后，分离载体与发酵液，发酵液8000r/min离心20min取上清酶液；
2)上清酶液经1kDa超滤膜浓缩后，按1:20(v/v)的比例加入到0.5wt% κ-卡拉胶水溶液中，酶解24 h;
3)酶解液加热5min停止反应，10000r/min离心30min去除未降解的κ-卡拉胶片段，取上清液分别过1kDa及3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，经旋蒸后真空冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖。
[0026]所述发酵培养基的成分为:氯化钠15g/L，低聚果糖I g/L，K-卡拉胶3 g/L，酵母膏I g/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4-7H20 0.5g/L,K2HPO4 I g/L,CaCl2 0.1 g/L，余量为去离子水，pH 7.5±0.1。
[0027]图1为沸石固定化菌体的原理图，沸石以硅(铝)氧四面体为基础结构单元，硅氧四面体通过处于四面体定点的氧原子相互连接，形成中空环装结构的硅(铝)氧四面体群。这种空旷的骨架结构，具有许多排列整齐的晶穴、晶孔和孔道，使得沸石具有较强的阳离子交换性能和吸附性能。同时，沸石表面积较大，具有很大的静电力，因此，该固定菌以沸石为载体，通过静电作用力及吸附性能，把菌体牢牢吸附于沸石表面，形成坚固的沸石固定菌微球。
[0028]将沸石和本实施例的沸石固定化菌株做电镜扫描图，结果如图2和图3所示。由图2可知，未吸附菌体前的沸石颗粒，粒径分布较大，表面光滑，形状规则。图3显示，吸附菌体的沸石表面呈现凹坑孔道，此大孔载体的孔道内布满了微生物，表明菌体吸附后生长分散于此，菌体多为短杆状及球状菌。
[0029]图4为本实施例的沸石和沸石固定化菌株的傅里叶红外光谱图分析。由图4可知，沸石的基本骨架吸收峰在(400?1200cm—结合水振动吸收带为1600?3700 cm—S S1-O或Al-O的弯曲振动峰为400?500 cm工。由图4分析可知，453.12 cm 1N444.95 cm 1处分别存在硅氧四面体S1-O-Si的振动峰;3436.10 cm_\3464.70 cm—1和1646.31 cm—1处分别有沸石结合水的吸收峰;而1008.85 cm—1处的强吸收峰为沸石的骨架振动。其中，固定化前后，沸石原有的1380.70 cm—\1458.34 cm—1吸收峰消失，1465-1340 cm—1为C-H弯曲振动，可能由于菌体与沸石的结合，使该振动峰消失。
[0030]图5为本实施例沸石固定化菌株发酵生产K-卡拉胶低聚糖的稳定性图，由图5可知，该沸石固定菌的稳定性及重复使用率较高，使用第5次时，降解能力仍然保留65%。图6为本实施例沸石固定化菌株发酵生产K-卡拉胶酶的产酶曲线，由图6可知，固定菌由于菌体大量富集，形成高浓度的菌体微球，其降解底物效率较游离菌高，由原来的36 h缩短至8 h，效率提高了4倍。图7为本实施例固定化菌株制备K-卡拉胶低聚糖的TLC图，由图7薄层层析图可知，固定化前后，菌体产物K-卡拉胶低聚糖组分不变，说明菌体吸附于沸石上，并没有变性，具有较好的遗传稳定性和功能性。
[0031]实施例2
固定化海旋菌TiaJassosjDira sp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法:
固定化菌株制备步骤如下:配置发酵培养基，加入0.5g沸石50目于30ml培养基中，灭菌后接种细胞湿重Ig菌泥，在25°C，130r/min的恒温摇床培养18 h。将固定化细胞与培养基分离，用0.9wt%生理盐水清洗固定化细胞，洗去残留液，4 °C保存固定化细胞。
[0032]所述菌株Tia^assosjoira sp.Fjfst-332，为实验室自主筛选获得，经检测可有效酶解K-卡拉胶获得K-卡拉胶低聚糖的野生菌。
[0033]所述菌悬液为菌株77?a2ass0sj0irasp.F jf st_332经液体发酵培养后，采用
0.9wt%生理盐水清洗2次，10000r/min离心20min获得。
[0034]固定化海旋菌TiaJassosjDirasp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法，制备包括如下步骤:
1)取固定化菌株无菌状态下加入30mL发酵培养基中，25°C，130r/min恒温摇床中发酵培养24 h后，分离载体与发酵液，发酵液8000r/min离心20min取上清酶液；
2)上清酶液经1kDa超滤膜浓缩后，按1:20(v/v)的比例加入到0.5wt% κ-卡拉胶水溶液中，酶解24 h;
3)酶解液加热5min停止反应，10000r/min离心30min去除未降解的κ-卡拉胶片段，取上清液分别过1kDa及3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，经旋蒸后真空冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖。
[0035]所述发酵培养基的成分为:氯化钠15g/L，低聚果糖I g/L，K-卡拉胶3 g/L，酵母膏I g/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4-7H20 0.5g/L,K2HPO4 I g/L,CaCl2 0.1 g/L，余量为去离子水，pH 7.5±0.1。
[0036]实施例3
固定化海旋菌Tia^assosjoira sp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法:
固定化菌株制备步骤如下:配置发酵培养基，加入Ig沸石60目于30ml培养基中，灭菌后接种细胞湿重1.5g菌泥，在25°C，130r/min的恒温摇床培养20 h。将固定化细胞与培养基分离，用0.9wt%生理盐水清洗固定化细胞，洗去残留液，4 °C保存固定化细胞。
[0037]所述菌株Tia^assosjoira sp.Fjfst-332，为实验室自主筛选获得，经检测可有效酶解κ-卡拉胶获得K-卡拉胶低聚糖的野生菌。
[0038]所述菌悬液为菌株77?a2ass0sj0irasp.F jf st_332经液体发酵培养后，采用0.9wt%生理盐水清洗2次，10000r/min离心20min获得。
[0039]固定化海旋菌TiaJassosjDirasp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法，制备包括如下步骤:
1)取固定化菌株无菌状态下加入30mL发酵培养基中，25°C，130r/min恒温摇床中发酵培养24 h后，分离载体与发酵液，发酵液8000r/min离心20min取上清酶液；
2)上清酶液经1kDa超滤膜浓缩后，按1:20(v/v)的比例加入到0.5wt% κ-卡拉胶水溶液中，酶解24 h;
3)酶解液加热5min停止反应，10000r/min离心30min去除未降解的κ-卡拉胶片段，取上清液分别过1kDa及3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，经旋蒸后真空冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖。
[0040]所述发酵培养基的成分为:氯化钠15g/L，低聚果糖I g/L，K-卡拉胶3 g/L，酵母膏I g/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4-7H20 0.5g/L,K2HPO4 I g/L,CaCl2 0.1 g/L，余量为去离子水，pH 7.5±0.1。
[0041 ] 实施例4
固定化海旋菌Tia^assosjoira sp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法:
固定化菌株制备步骤如下:配置发酵培养基，加入Ig沸石40目于30ml培养基中，灭菌后接种细胞湿重Ig菌泥，在25°C，130r/min的恒温摇床培养24h。将固定化细胞与培养基分离，用0.9wt%生理盐水清洗固定化细胞，洗去残留液，4 °C保存固定化细胞。
[0042]所述菌株Tia^assosjoira sp.Fjfst_332，为实验室自主筛选获得，经检测可有效酶解κ-卡拉胶获得κ-卡拉胶低聚糖的野生菌。
[0043]所述菌悬液为菌株77?a2ass0sj0irasp.F jf st_332经液体发酵培养后，采用0.9wt%生理盐水清洗3次，10000r/min离心20min获得。
[0044]固定化海旋菌TiaJassosjDirasp.Fjfst_332制备κ-卡拉胶寡糖的方法，制备包括如下步骤:
1)取固定化菌株无菌状态下加入30mL发酵培养基中，25°C，130r/min恒温摇床中发酵培养24 h后，分离载体与发酵液，发酵液8000r/min离心20min取上清酶液；
2)上清酶液经1kDa超滤膜浓缩后，按1:20(v/v)的比例加入到0.5wt% κ-卡拉胶水溶液中，酶解24 h;
3)酶解液加热5min停止反应，10000r/min离心30min去除未降解的κ-卡拉胶片段，取上清液分别过1kDa及3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，经旋蒸后真空冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖。
[0045]所述发酵培养基的成分为:氯化钠15g/L，低聚果糖I g/L，K-卡拉胶3 g/L，酵母膏I g/L,NaNO3 2 g/L,MgSO4-7H20 0.5g/L,K2HPO4 I g/L,CaCl2 0.1 g/L，余量为去离子水，pH 7.5±0.1。
[0046]实施例中采用的检测方法:
κ-卡拉胶酶活力测定:取I mL酶液加入到盛有5 mL 0.2%卡拉胶底物的试管中，于32 °C恒温水浴反应60 min，对照组用I mL灭活酶液和5mL底物溶液混合。以反应液中还原糖的增加量作为检测酶活力的指标。还原糖的测定则采用DNS法(3，5_ 二硝基水杨酸)。取I mL反应液加I mL DNS溶液，沸水浴反应5 min后，冷却，定容至10 mL，于540 nm下测定吸光值。以半乳糖做标准曲线，根据反应组和对照组吸光值的差值计算还原糖的产生量。I个酶活力单位(U)定义为在32°C条件下，每分钟产生I Hg还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。
[0047]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种固定化菌株，其特征在于:固定化菌株制备步骤如下:配置发酵培养基，加入0.3?Ig 40?60目的沸石于30ml培养基中，灭菌后接种细胞湿重0.5?1.5g菌泥，在25°C，130r/min的恒温摇床培养16?24 h，将固定化细胞与培养基分离，用0.9wt%生理盐水清洗固定化细胞，洗去残留液，4°C保存固定化细胞。2.根据权利要求1所述的固定化菌株，其特征在于:所述的菌株rAaiassospirasp.Fjfst-332，保藏号为CCTCC M 2013706，经检测可有效酶解κ-卡拉胶获得κ-卡拉胶低聚糖的野生菌。3.根据权利要求1所述的固定化菌株，其特征在于:所述的菌泥为菌株TXaiassosjDirasp.Fjfst-332经液体发酵培养后，采用0.9wt%生理盐水清洗2~3次，10000r/min离心20min获得。4.一种如权利要求1所述的固定化菌制备κ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于:κ-卡拉胶低聚糖的制备包括如下步骤: 1)取固定化菌株无菌状态下加入30mL发酵培养基中，25°C，130r/min恒温摇床中发酵培养24 h后，分离载体与发酵液，发酵液8000r/min离心20min取上清酶液； 2)上清酶液经1kDa超滤膜浓缩后，按体积比1:20的比例加入到0.5wt% κ-卡拉胶水溶液中，酶解24 h; 3)酶解液加热5min停止反应，10000r/min离心30min去除未降解的κ-卡拉胶片段，取上清液分别过1kDa及3kDa超滤膜，收集分子量小于3kDa的酶解液，经旋蒸后真空冷冻干燥，得到不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖。5.根据权利要求1和4所述的一种固定化菌及其制备κ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于:发酵培养基的成分为:氯化钠15 g/L，低聚果糖I g/L，ic-卡拉胶3 g/L，酵母膏I g/L，NaNO3 2 g/L,MgSO4.7Η20 0.5g/L,K2HPO4 I g/L,CaCl2 0.1 g/L，余量为去离子水，pH =7.5±0.1 ο6.根据权利要求4所述的一种固定化菌制备κ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于:所述不同聚合度的κ-卡拉胶低聚糖分别为二糖、四糖、六糖、八糖。
【文档编号】C12N11/14GK106047855SQ201610692642
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月22日
【发明人】郭娟娟, 郑宝东, 黄志伟, 张怡, 张龙涛, 卢旭
【申请人】福建农林大学