专利名称：一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸生产香草醛的方法
技术领域：
本发明涉及一株拟无枝酸菌(Amycolatopsissp. ) zhp06,即 CCTCC NO M2011265 的固定化，及其转化阿魏酸制备香草醛的生物转化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)又名香兰素，香茅醛，相对分子质量152. 15，白色至微黄色针状或粉末状结晶，是香荚兰的主要成分，主要应用于食品、饮料、香料、医药、 皮革、电镀和药物等行业中。
香草醛的生产方法主要是化学合成法，其主要来源是由石油化工产品愈创木酚、 木质素等的化学合成，这种方法合成的香草醛不仅香型单一，而且合成过程中环境污染较严重，人们对安全性的担忧日益增加；香草醛的另一种生产方法是植物提取法，每年从香草兰豆荚中提取的天然香草醛只有4ot，这远远不能够满足人们的的需求(每年ieooot);因此，微生物香草醛的研究应运而生。微生物香草醛生产过程是环境友好型，已经得到欧洲立法的承认(EEC Nol334/2008)。
在微生物合成香草醛中前体物质有很多，如香草醇、香草胺、松柏醇、藜芦醇、阿魏酸、香草酸、丁香酚和异丁香酚等，其中阿魏酸为前体合成香草醛最受关注，并安全性受到认可。法国的Lesage-Meessen等人最先采用两步法,即利用黑曲霉先将阿魏酸转化为香草酸，再由朱红密孔菌进一步转化成香草醛，其香草醛的浓度为O. 237g/L ;周庆礼等人筛选的链霉菌一步转化阿魏酸生产香草醛，流加两次底物，产量为7. 12g/L ;许平等人利用链霉菌通过发酵过程添加树脂，使转化的产量最高达到19. 2g/L，摩尔转化率54. 45% ;意大利的 Diana DiGioia等利用假单胞菌转化阿魏酸到香草醛最高产量为1. 27g/L，意大利同一研究团队还研究了大肠杆菌工程菌生产香草醛，产量达到2. 52g/L。但是这些转化过程周期长， 生产效率低；对原料阿魏酸的转化率不高(摩尔转化率20%-70%)，生产成本较高。发明内容
本发明的目的是提供一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸生产香草醛的方法， 在筛选到一株可转化阿魏酸为香草醒的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp. ) zhp06即CCTCC NO M2011265 (中国专利CN102321563A已公开)的基础上，提供一种拟无枝酸菌固定化及其固定化细胞转化阿魏酸制备香草醛的方法。通过固定化细胞重复利用，提高转化效率，降低培养微生物的成本，同时使得产物香草醛容易提取。
本发明的技术方案一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸制备香草醛的方法， 其步骤包括
(I)种子培养将实验室保藏的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp. )zhp06,即CCTCC NO :M2011265，斜面菌种接种到种子培养基中，放置到28-45°C，100_300r/min的恒温摇床中培养10 36h。
(2)菌体准备将步骤(I)所得种子接种到菌体扩大培养基中，放置到28_45°C，100-300r/min的恒温摇床中培养10 36h。
所述种子培养和种子扩大培养使用的液体培养基配方为葡萄糖I 10g，酵母膏 5 20g，Na2HPO4 · 12H201 lOg，KH2PO4O.1 2g，NaClO. 05 O. 5g, MgSO4 · 7H200. 05 O.5g, CaCl2 ·2Η200. 05 O.1g ;用自来水定容到 1L，调 pH 至 7. 2 7. 4，121°C灭菌 20min ； 接种量为1%-10%。
(3)固定化细胞制备将用清水洗净的木屑或甘蔗渣等纤维质材料粉碎成粒径为 20目到120目，用清水清洗净后灭菌，按60-300g/L用量加入到培养好菌体的步骤(2)所得培养液中，常温搅拌吸附l_24h，过滤得到固定化细胞。
(4)转化阿魏酸为香草醛以步骤(3)中得到的固定化细胞为催化剂，与底物阿魏酸溶液混合，在35-40°C下进行转化反应。
底物阿魏酸溶液组成K2HP033 6g/L，KH2PO3O.1 lg/L，底物(阿魏酸)5_50g/L， 初始PH为7. 0-9. 0，在摇瓶或发酵罐中进行反应。
摇瓶转化装液量30-100mL/250-500mL三角瓶，转速 100_300r/min，转化 10_48h。
或发酵罐中转化在发酵罐中反应，发酵罐通气量100_400L/h，转速100_300r/ min，连续转化 140-200h。
本发明的固定化细胞可以重复利用10次以上，转化完成后，将固定化细胞过滤出来，再加入缓冲液和底物，按照上述摇瓶转化或发酵罐中转化方法进行转化。
在发酵罐中进行转化时，还可将耦联吸附树脂(如附图1所示)，连续运行 14(Tl50h，转化液中的香草醛吸附到树脂中，有利于产物的提取。
产物的提取和产物分析方法详见中国专利申请号201110325488.1巳公开，中国专利CN102321563A已公开。
本发明的有益效果本发明所使用的固定化材料都是工农业生产中的废弃物，材料来源广，成本低，制作简单。用固定化生长细胞合成香草醛，具有反应条件温和，固定化材料廉价易得，环保无污染，能够重复利用，降低生产成本，有利于连续化生产。并且，转化与吸附树脂偶联可实现香草醛转化与分离提取同步进行，降低转化液中香草醛的含量，减小甚至消除产物抑制，缩短香草醛整个生产过程的时间，对环境无污染。
生物材料样品保藏拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp. ) zhp06,已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏日期2011年7月26日，保藏编号为 CCTCC NO M2011265o
图1发酵罐与树脂耦联示意图。
具体实施方式
实施例1-4，不同处理方式的木屑制备固定化细胞产香草醛情况
木屑分别进行以 下处理用清水浸泡冲洗干净，H2O2处理；Na0H水浴；Na0H煮沸。 从保藏斜面上取一环菌苔，接种到种子培养基中，种子培养基的组成葡萄糖5g ;酵母膏 5g ；Na2HP04 · 12H204g ；KH2PO4Ig ；NaC10. 2g ；MgS04 · 7H200. 2g ；CaCl2 · 2H200. 05g ;用自来水定容到1L，调pH7. 2，装液量30mL/250mL三角瓶。在30°C，200r/min的恒温摇床中培养24h ；以8%接种量将种子接种到菌体扩大培养基中(扩大培养基组成同种子培养基，装液量50mL/500mL三角瓶)，37°C，200r/min下扩大培养24h，加入处理好的木屑10g，继续培养 IOh,过滤，与12g/L底物阿魏酸溶液混合，置于37°C，200r/min的恒温摇床中进行转化，转化24h。结果如表I。取水洗处理即可。
表I木屑不同处理方式对固定细胞转化生产香草醛的比较
权利要求
1.一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸生产香草醛的方法，其步骤包括(1)种子培养将拟无枝酸菌sp.)zhp06，即 CCTCC N0 M 2011265，斜面菌种接种到种子培养基中，放置到28-45°C，100-300 r/min的恒温摇床中培养1(T36 h ；(2)菌体准备将步骤(I)所得种子接种到菌体扩大培养基中，放置到28-45°C， 100-300 r/min的恒温摇床中培养10 36 h ；所述种子培养基和种子扩大培养基配方为葡萄糖I 10 g，酵母膏5 20 g, Na2HP04 12H20 I 10 g, KH2P04 0.1 2 g, NaCl 0. 05 0. 5 g, MgS04 7H20 0. 05 0. 5 g, CaCl2 2H20 0. 05 0.1 g ;用自来水定容到 I L，调 pH 至 7. 2 7. 4，121°C灭菌 20 min ； 接种量为1%_10% ；(3)固定化细胞制备将用清水洗净的木屑或甘蔗渣纤维质材料粉碎成粒径为20目到 120目，清水清洗干净后灭菌，用量为60-300 g/L加入到培养好菌体的步骤(2)所得培养液中，常温搅拌吸附1-24 h，过滤得到固定化细胞；(4)转化阿魏酸为香草醛以步骤(3)中得到的固定化细胞为催化剂，加入底物阿魏酸溶液，在35-40°C下进行转化反应；底物阿魏酸溶液组成=K2HP03 3 6 g/L, KH2P03 0.1 I g/L，底物阿魏酸5-50 g/L, 初始PH为7. 0-9. 0，在摇瓶或发酵罐中进行反应；摇瓶转化装液量30-100 mL/ 250-500 mL三角瓶，转速100-300 r/min，转化10-48h ；或发酵罐中转化在发酵罐中反应，发酵罐通气量100-400 L/h，转速100-300 r/min, 连续转化140-200 h0
全文摘要
一种利用固定化拟无枝酸菌转化阿魏酸生产香草醛的方法，属于生物工程技术领域。本发明以木屑、甘蔗渣等纤维素材料为载体，以吸附方式固定拟无枝酸菌细胞。固定化细胞能重复利用10次，转化阿魏酸为香草醛的摩尔转化率保持在50%以上。在转化体系中耦联吸附树脂，香草醛产量达到19.65g/L，生产强度0.131g/L·h。本发明转化反应条件温和，对环境污染小，生产周期短，成本低，转化产物易分离纯化，具有良好的应用前景。
文档编号C12N11/12GK103060392SQ20131002318
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者郑璞, 王兴林 申请人:江南大学