专利名称：一种高产l-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，特别是一种代谢改造的重组谷氨酸棒杆菌及其生产L-苯丙氨酸的方法。
背景技术：
苯丙氨酸(Phenylalanine),即D, L_ a -氨基-0 -苯基丙酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三种，其中具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, L-Phe)，比旋光度为-35.1。。L-Phe又名L-苯基-氨基丙酸,常温下为白色或无色结晶性粉末固体，水中溶解度为29.6g/L，难溶于甲醇、乙醇和乙醚。L-Phe在自然界中广泛存在于卵、乳和动物蛋白中，含量5%-6% ；L-Phe也存在于植物性蛋白质中，含量约为1%。L-Phe是人和动物体内不能合成的8种必需氨基酸之一，也是高甜度低热量的新型甜味剂阿斯巴甜的重要组成部分。作为一种重要的生物化工产品，L-Phe在食品、饲料添加剂以及医药等领域具有广泛的应用。20世纪80年代以来，随着氨基酸类抗癌药物和营养保健品的开发应用，尤其是阿斯巴甜的广泛生产与使用，国际市场对L-Phe的需求快速增长。据悉，2005年全球需求量为3万吨，实际年产量只有1.4万吨，而2006年L-Phe的需求量已达到10万吨左右，且有逐年上涨的趋势。随着市场需求的不断增长，L-Phe的生产受到越来越多的关注。L-Phe主要由化学合成法、酶法和微生物发酵法等3种方法来生产。化学合成法因其生产路线长、副产物多、且产物为消旋体不宜推广使用。酶法主要是由化学合成的类氨基酸前体经过微生物细胞内酶系高效专一地催化合成L-Phe。酶法生产工艺简单、产物浓度较高、纯化步骤简便且生产能力较强，是目前工业化生产L-Phe的主要方法之一。近年来，由于底物和酶等主要原料成本高、来源有限，反应过程中酶稳定性差等缺点，酶法生产L-Phe也受到了很大制约。发酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生产L-Phe的一种方法，具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高等优点。实际上，早在20世纪60年代，日本中山公司用糖质发酵制备L-Phe获得了成功，并由协和发酵公司实现了工业化生产。随着代谢工程、发酵工程等相关技术的不断发展，发酵法生产L-Phe受到国内外研究者的关注并得到了广泛深入的研究，成为目前国内外工业化生产L-Phe的主要方法。L-Phe, L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)属于芳香族氨基酸，只能由植物和微生物合成。可用于生产L-Phe的微生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(BrevibacteriumfIavum)、乳 酸短杆菌(Brevibacterium glutamicum)和乳糖发酵短杆菌(Brebibacterium Iactofermentum)等。其中 E.coli 和 C.glutamicum是发酵法生产 L-Phe的主要菌种。在C.glutamicum中，以葡萄糖为底物的L-Phe生物合成途径如图1-2所示。其中，由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓糖(E4P)在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP synthases, DS)的催化下缩合生成3_脱氧_D_阿拉伯庚酮糖酸7_磷酸(DAHP)的反应为第一个限速反应。在C.glutamicum中DS酶仅由aroG编码,在Escherichiacoli DS酶由三种基因aroF、aroG和aroH所编码,酶活组成比例为aroF:aroG:aroH = 80:I:20o第二和第三个限速反应分别为由分支酸在分支酸变位酶(Chorismate mutase, CM)的作用下转变为预苯酸，继而在预苯酸脱水酶(Prephenate dehydratase, PDT)的作用下脱水、脱羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因编码的双功能酶，受到产物L-Phe的反馈抑制。pheA基因的表达受到操纵子介导的阻遏和衰减调控。此外，L-Phe合成和转运有关的酶的表达还受到调控基因tyrR编码的阻遏蛋白TyrR的反馈阻遏。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，通过改造发酵菌株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum ATCC13032)，表达关键酶基因提高L-Phe合成途径中通路，具体策略为过量表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因，抗反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因，转酮醇酶基因及磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因。所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因、转酮醇酶基因及酸烯醇式丙酮酸合成酶均来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的方法，将所述重组谷氨酸棒杆菌活化后制备发酵种子，发酵种子以10%的接种量转入发酵培养基，于30° C、200rpm条件下培养72h。斜面培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5，葡萄糖5，斜面培养基添加琼脂20，ρΗ7.0 ；发酵种子培养基(g/L):葡萄糖25，玉米浆35，硫酸铵5，尿素2，磷酸二氢钾1，七水合硫酸镁 0.5，pH7.0-7.2，装液量 20mL/250mL。发酵培养基(g/L):葡萄糖130，硫酸铵25，玉米浆8，磷酸二氢钾I，七水合硫酸镁
0.5，碳酸钙 20，ρΗ6.8-7.0，装液量 20mL/250mL。摇瓶培养条件为:将30°C、200rpm下培养18h的发酵种子以10%的接种量转入发酵培养基，于30°C、200rpm条件下培养72h。苯丙氨酸的测定:高效液相色谱(HPLC)。仪器=AgilentllOO高效液相色谱仪(配紫外可见检测器和工作站)；色谱条件:色谱柱:Z0RBAXEclipse_AAA4.6xl50mm，3.5um PN963400-902流动相:A:40mM Na2HP04pH7.8 (5.5g Na2HPO4+1L 水)，用 NaOH 溶液调 pH 至 7.8。B:ACN:Me0H:水(45:45:10, v/v/v)流速:2mL/min柱温:40°C进样量:5μ L紫外检测器波长:338nm样品制备:5mL发酵液在IOOOOrpm下离心lOmin，取上清液移入试管中以备测L-Phe用。测L-Phe时，取ImL上清液移入5mL容量瓶中，去5%三氯乙酸定容至刻度线，经0.45um滤膜过滤后,滤液供液相色谱分析用。本发明通过在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032中过量表达3_脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因、抗反馈抑制的双功能酶分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因、转酮醇酶基因及磷酸烯醇式丙酮酸酶基因，获得了一株高产L-Phe的谷氨酸棒状杆菌工程菌株 C.glutamicuml9AF/99TPo 在 C.glutamicum ATCC13032 中过量表达 L-Phe 合成代谢途径的莽草酸代谢途径，分支酸代谢途径的关键酶基因使得L-Phe产量达到3.47gL，结合表达中心代谢途径提高前体物质的两个酶基因L-Phe产量最高达到4.86g/L。
图1:pXMJ19相关载体验证的转化子双酶切质粒双酶切验证。泳道1:DL2000Markers ;泳道 2 =PXMJlQ-PheAfbr 双酶切 PheAfbr ;泳道 3:pXMJ19-aroF 双酶切 aroF ；泳道 4 =PXMJig-PheAfbrBroF 双酶切 pheA^-aroF ;泳道 5 ^XMJlQ-pheA^-aroF 双酶切PheAfbr-BroF ;泳道6: Ikb DNA Markers ；
具体实施例方式实施例1重组菌的构建及鉴定根据Genebank登陆序列号NC_000913.2，采用PCR扩增得到aroF基因(引物F:CCAATGCATAAAGGAGGACACGC ATGCAAAAAGACGCGCTGAATAACG;R: CTAGTCTAGATTAAGCCACGCGAGCCGTCA),克隆到穿 梭载体 pXMJ19 (Jakoby, M., C.E.Ngouoto-Nkili, andA.Burkovski,Construction and application of new Corynebacterium glutamicumvectors.Biotechnology Techniques, 1999.13(6):p.437-441.)，最终获得含有 aroF 基因的穿梭表达质粒 pXMJ19-aroFo 根据质粒 pAP_B03 (Zhou, H.，X.Liao, T.Wang, G.Duj andJ.Chen.2010.Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of PheAfbrand aroFwt.Bioresour TechnollOl:4151-4156.)中获取抗反馈抑制的基因 pheAfbr (引物F:CCCAAGCTTAAAGGAGGACACGCATGACATCGGAAAACCCGTTACT ；R: AAAACTGCAGTCAGGTTGGATCAACAGGCACTA )采用PCR的扩增的方法得到pheAfto基因，克隆到重组质粒pXMJ19-aroF 获得重组表达载体 pXMJ19-pheAfto_aroF。根据Genebank登陆序列号NC_007779.1，采用PCR扩增或化学全合成方法得到tktA 基因(引物 F:CGCGGATCCAAAGGAGGACACGCATGTCCTCAC GTAAAGAGCTTGCC; R: CGAGCTCTTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCGC),克隆到穿梭表达载体 pECXK99E (Liu, Q., S.P.0uyang, J.Kim, andG.Q.Chen.2007.The impact of PHB accumulation on L-glutamate production byrecombinant Corynebacteriumglutamicum.Journal of Biotechnologyl32:273-279.),最终获得含有tktA基因的重组表达载体pECXK99E-tktA。根据Genebank登陆序列号NC_000913.2，采用PCR扩增或化学全合成得到ppsA基因(引物F:CCCAAGCTTAAAGGAGGACACGCATGTCCAACAATGGCTCGTCAC; R:AAAACTGCAGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGCTT),克隆到表达载体 pECXK99E-tktA 构建重组质粒 pECXK99E_tktA_ppsA。将重组表达载体pXMJ19-pheAfblr-aroF 与 pECXK99E_tktA_ppsA 分别转化C.glutamicumATCC13032，获得共表达4个基因的工程菌。实施例2发酵生产L-Phe重组菌C.glutamicum与出发菌进行发酵实验对比。在C.glutamicum ATCC13032中过量表达L-Phe合成代谢途径的莽草酸代谢途径，分支酸代谢途径的关键酶基因使得L-Phe产量达到3.47 g/L，结合表达中心代谢途径提高前体物质的两个酶基因L-Phe产量最高达到4.86gL。而出发菌株C.glutamicum ATCC13032发酵液发酵过程中则检测不到L-Phe产量。
权利要求
1.一种高产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于过量表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因，抗反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因，转酮醇酶基因及磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因。
2.权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-憐酸合成酶基因来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
3.权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于所述转酮醇酶基因来源于谷氨酸棒杆菌。
4.权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于所述磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因来源于谷氨酸棒杆菌。
5.权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于所述3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因、抗反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因采用诱导表达载体PXMJ19进行表达。
6.权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于所述转酮醇酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因采用诱导表达载体PECXK99E进行表达。
7.应用权利要求1所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于将所述重组谷氨酸棒杆菌活化后制备发酵种子，发酵种子以10%的接种量转入发酵培养基，于30。C、200rpm条件下培养72h。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成为(g/L):葡萄糖130，硫酸铵25，玉米浆8，磷酸二氢钾1，七水合硫酸镁0.5，碳酸钙20，pH6.8-7.0,装液量20mL/250mL。`
全文摘要
本发明公开了一种高产L-苯丙氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及发酵生产L-苯丙氨酸(Phe)的方法，属于代谢工程领域。本发明在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032中通过诱导表达3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶基因，抗反馈抑制的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶基因，转酮醇酶基因及磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因四个基因，获得了一株高产L-Phe的谷氨酸棒状杆菌工程菌株C.glutamicum19AF/99TP。在C.glutamicum ATCC13032中过量表达L-Phe合成代谢途径的莽草酸代谢途径，分支酸代谢途径的关键酶基因使得L-Phe产量达到3.47g/L，结合表达中心代谢途径提高前体物质的两个酶基因L-Phe产量最高达到4.86g/L，而出发菌株ATCC13032作为对照菌株在整个发酵过程中检测不到L-Phe的积累。
文档编号C12P13/22GK103074292SQ201310023160
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者陈坚, 张传志, 堵国成, 康振 申请人:江南大学